이 프로토콜은 갓 분리된 돼지 구강 상피 조직 점막을 이용해 펩타이드 투과를 평가하는 스크리닝 플랫폼을 설명합니다. 이 방법은 Franz 확산 세포 내 용액, Hilltop 챔버, 필름에서 온 투과 증강제 및 3D 프린팅 인서트를 사용하여 GLP-1RA의 투과를 통합하고, 조직학적 점막 평가와 함께 진행합니다.
이 논문에서
요약
초록
오로무코살 약물 투여는 필름, 정제, 로젠지 및 기타 제형으로서 소아 및 노인 환자, 그리고 캡슐이나 정제를 쉽게 삼키기 어려운 환자들에게 편리한 전신 투여 경로를 제공합니다. 구강 및 설하 펩타이드 제형을 개발하려면 돼지와 개가 가장 적합한 인간의 비각질화된 오로모코 상피 구조와 일치하는 전임상 모델이 필요합니다. 우리는 도살장에서 버려진 신선한 돼지 오로뮤코스 조직을 구했습니다. 점막은 제어된 가열을 이용해 기저 평활근에서 해리한 후 프란츠 확산 셀 또는 새로운 저용량 3D 프린트 수지 경화 삽입물에 장착되었습니다. 펩타이드-투과 증강제 조합이 공여 측에 첨가되었고, 수용자 측에서 투과된 분자를 샘플링하여 초고성능 액체 크로마토그래피(uHPLC)로 정량화했습니다. 삽입물의 경우, 부착된 점막의 경상피 전기 저항(TEER) 값을 EVOM 젓가락 전극을 사용해 측정하였습니다. 조직 조직학은 Franz 확산 세포와 3D 삽입물 모두에서 인큐베이팅 후 조사되었습니다. 펩타이드와 증강제의 수용성 혼합물이 투과율을 증가시켰을 때 투과제 최적 농도가 선택되었습니다. 펩타이드 투과율은 3차원(3D) 삽입물에서 3시간 동안 4.3%에 도달했으며, 힐탑 챔버 모델에서는 1.7%에 달했으며, 후자는 구강 필름에서 직접 노출을 시뮬레이션한 것입니다. 펩타이드-강화제 조합을 포함한 층별 고분자 점액 접착 막이 개발되어 확산 챔버를 이용한 투과 연구를 위해 점막 조직에 적용되었습니다. 돼지 구강 점막에 최적의 글리코데오시콜레이트(GDC) 조합을 노출했을 때, 돼지 구강 점막을 통한 엑스vivo 펩타이드 투과율은 2%에 도달했습니다. 이러한 체외 선별 연구들은 돼지와 인간에서 오로모코설 경로를 통해 투여된 펩타이드 가재 필름 제형의 후속 약물동학 평가 경로를 제공합니다.
서론
구강 및 설하 구강 구강 약물은 직접 접근 가능한 부위를 제공하고 간 1차 대사를 피할 수 있어경구 약물 투여의 매력적인 경로로, 경구 투여 등 다른 경로에 비해 생체이용률과 환자 수용성을 향상시킬 수 있습니다. 펩타이드는 분자량이 높고 친수성이며 효소 분해에 취약하기 때문에 장 상피를 통한 투과가 불편하기 때문에 일반적으로 경구 투여보다 주사로 투여됩니다. FDA는 치료용 용도로 102개의 펩타이드를 승인했으며, 이 중 약 450개는 전임상 또는 임상시험에서 평가 중입니다4. 여기에는 투과 촉진제(예: 세마글루타이드, 라이벨서스)5가 포함된 경구 정제와 Catalent의 Zydis 경구 분해 정제(ODT) 기술을 사용해 개발된 구강 기반 플랫폼(미니린 멜트 및 노크더나 설하 데스모프레신 아세테이트)이 포함됩니다. 구강 약물 투과성 연구에 대한 광범위한 조사에도 불구하고, 분자의 투과율 값은 재현성이 낮고 연구 간 비교 가능성도 제한적임을 보인다 7,8. 이러한 불일치는 주로 실험 동물 모델의 차이와 분리된 구강 점막9의 취급 및 준비 차이에서 비롯됩니다.
분리된 구강 및 설하 조직 점막을 이용한 체외 투과성 분석은 생체 내 구근 소분자 투과성 예측과 제형10, 11, 12와 관련된 제형 성분의 전임상 스크리닝에 유용한 도구입니다; 그러나 기저 투과성이 미미하기 때문에 펩타이드 스크리닝에서의 사용은 제한적이었습니다. 최근 몇 년간 돼지 구강 점막은 각질화되지 않은 구조와 생리적·생화학적 특성이 인간과 매우 유사하기 때문에 선호되는 모델이 되었습니다(13). 도살장에서 얻은 개의 구강 샘플은 도살장에서 나온 돼지 조직에 비해 접근하기 더 어렵지만, 두 출처 모두 각질화되지 않은 상태입니다14. 상피 두께와 가공 방식에는 상당한 변동성이 여전히 존재합니다. 구강 및 설하 구강 조제 준비의 표준화가 필수적입니다. 단기 및 장기 저장 조건, 조직 두께, 실험 중 생존 유지 등 변수들이 모두 체외 투과성 결과에 영향을 미칩니다. 조직 보존은 매우 중요하며, 점막의 구조적 완전성과 대사 활동이 확산 프로필에 직접적인 영향을 미치기 때문입니다12,15. 장벽 기능 상실은 인위적으로 약물 투과율을 높여줄 수 있습니다16,17. 저장 외에도, 돼지 구강 점막을 해부하여 투과실에 장착하는 방법은 추가적인 변동성을 초래합니다. 점막하 결합조직을 기계적, 화학적 또는 열적 방법으로 제거하는 차이는 투과성을 변화시킬 수 있습니다18. 일부 보고서에서는 상피를 평활근에서 분리하기 위한 열 분리가 투과성을 유지한다고 제안하지만, 합의는 부족하다. 현재로서는 분리된 구강점막20의 완전성을 해부하고 평가하는 보편적으로 인정된 방법이 존재하지 않습니다. 표지된 친수성 당인 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란(FITC dextran 4000, FD-4)은 돼지 구강 점막의 완전성 마커로 흔히 사용되며, 이는 ~500 Da 이하의 소분자만이 조직을 수동적으로 침투할 수 있기 때문입니다. 반면, 점막이 온전하면 FD-4 수송이 제한되며, 2-4시간 동안 기증자에서 수용자로의 전달이 0.6% 미만이면 일반적으로 허용 가능한 것으로 간주됩니다. 또한, 헤마톡실린과 에오신 조직 염색은 상피 형태를 간단히 평가할 수 있게 합니다.
이 연구에서는 일정 기간 동안 점막의 완전성과 투과성을 최적화하기 위해 분리된 돼지 구강점막의 점막 취급을 위한 표준화된 프로토콜을 확립하였습니다. 우리의 목표는 돼지 구강상피 조직을 해부하기 위한 실험적 틀을 제공하고, 확산 챔버와 삽입물에 장착된 오로머코과에 걸친 펩타이드의 체외 투과성 평가의 신뢰성을 높이는 것이었습니다. 먼저 도살장에서 손상 없는 구강 점막을 식별하기 위해 시각적 분석을 수행했습니다. 우리는 조직 처리 기법, 점막 두께, 그리고 실험 중 조직 무결성을 유지하는 방법을 최적화했습니다. 안정적인 저포능 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체 작용제(GLP-1 RA) 유사체를 도구 분자로 사용하여, 담즙염 투과 증강제인 글리코데옥콜레이트나트륨(GDC)의 유무 모두에서 프란츠 확산 세포에 장착된 구강 점막과 맞춤형 3D 프린팅 트랜스웰형 인서트에서 펩타이드 투과 연구를 수행하였습니다. GDC와 GLP-1 RA는 용액, Hilltop 챔버, 그리고 점액접착 고분자 이중층 막에서 얻은 구강 점막에 제시되었습니다. 우리는 투과성 마커, 조직 조직학, 그리고 간상피/내피 전기 저항(TEER) 값을 주요 평가 기준점으로 사용하였습니다.
프로토콜
이 연구에 사용된 돼지 뺨살은 지역 도축장에서 채집한 것으로; 따라서 윤리적 승인은 필요하지 않았습니다.
1. 돼지 구강 상피 분리, 준비 및 저장
- 지역 도축장에서 돼지 볼살 조직을 채취하여 90분 이내에 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 담아 실험실로 운송합니다. 다음 60분 이내에앞서 설명한 방법론에 따라 조직을 준비하세요. 그림 1에 나타난 대로 오로무코아 부위에 대해 소폭 수정을 가하세요.
- 메스를 사용해 구강 점막을 밑 조직에서 분리하고 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 세 번 헹구세요. 시각 표면 손상이 있는 점막은 버리세요.
- 온전한 점막을 65°C의 PBS에 3분간 담근한 후, 5사이즈 시계공용 겸자를 사용해 상피와 남아 있는 결합 조직을 평활근에서 분리합니다. 이 방법은 설하 및 혀 상피 점막 분리에도 적용 가능합니다.
- 해부한 오로무코과를 셀룰로오스 필터 페이지에 부드럽게 건조시키고 투과 검사(바람직한 방법)를 진행하거나 최대 4주간 냉동하세요.
- 분리 후 냉동 과정에서는 오로무코아를 85% 글리세롤25 냉동 보호제에 2시간 동안 부드럽게 흔들며 담가둡니다. 고점도의 글리세롤은 세포 간 물을 대체하여 조직 구조를 손상시킬 수 있는 물 결정 형성을 방지합니다.
- 이 기간 후에는 글리세롤을 신선한 PBS와 10% 글리세롤로 대체하세요. 점막 샘플은 저장 시간에 따라 -20 °C 또는 -70 °C에서 냉동합니다. ~-1 °C·min-1의 통제된 속도로 냉동 과정을 수행하세요.
참고: 모든 실험은 서로 다른 동물의 뺨에서 채취한 조직 최소 세 개를 사용하여 수행됩니다.
2. 프란츠 확산 세포에 장착된 점막의 외부 투과 및 GLP-1 RA 및 GDC를 제시하기 위한 힐탑 챔버 사용
참고: 체 외 투과성 연구는 처음에 프란츠 확산 세포(FDC)를 사용하여 신선하게 분리된 돼지 구강 점막에 대해 수행됩니다.
- 해리된 조직 점막을 그림 2에 표시된 창 면적 1.2 cm2의 챔버에 장착하고, PBS(pH 6.8, 기증 쪽, 1 mL 용피)와 PBS(pH 7.4, 수신 측 10 mL 용피)로 30분간 평형을 유지합니다.
- 30분간 평형화된 후, 공여액 PBS(pH 6.8)를 GLP-1RA(25 mg/mL)와 GDC(25 mg/mL)의 1:1 비율을 가진 PBS 1mL로 교체합니다.
- 수신기 챔버에 37 °C, 300 rpm에서 유지한 10 mL의 PBS pH 7.4를 계속 저어주세요. 수신기 구획에서 180분 동안 60분마다 1mL를 샘플링하세요. 실험 시작과 끝에 기증자 구획에서 3회씩 샘플을 채취하세요. 각 샘플링 후에는 챔버에 1mL의 PBS를 보충합니다.
- 실험이 끝나면 조직학을 위해 10% 포르말린에 보관하거나, 조직 내에 남아 있는 GLP-1RA 펩타이드를 정량하기 위해 균질화합니다.
- 마찬가지로, 힐탑 챔버(HTC)를 사용하여 GLP-1RA의 투과율을 측정합니다.
참고: HTC를 사용하는 목적은 GDC가 GLP-1 RA에 대해 입부 투과 증강 효과를 확인한 후 이중층 구강 구강 막을 제조하는 것입니다. HTC는 생체 적합성 스티렌-에틸렌-부틸렌-스티렌(SEBS) 블록 공중합체인 Kraton G-2705로 제작된 챔버로, 외경 19mm이며, 100% 부직포 면섬유로 된 직경 12.7mm의 Webril 패드를 포함하고 있어 용액적용을 위한 흡수성 논스틱 재료 역할을 합니다. - 마찬가지로, 점액접착 이중층 막에 적재된 GLP-1RA와 GDC(1:1 비율)의 체외 투과성을 평가하므로, HTC에서 설명된 FDC의 공여 챔버나 3D 인서트에 필름을 배치합니다.
- 돼지 구강 상피 조직의 완전성을 확인하기 위해 FD-4(0.05 mM)를 형광 플럭스 마커로 사용하여 기증 측에 추가하여 조직 전반에 누출을 평가합니다.
참고: 누출이 나타나는 조직은 투과성 계산에서 제외됩니다. - 3시간 실험 후, 기저측 구획에서 추출한 200 μL 샘플을 3중으로 추출하여 누적 GLP-1 RA 플럭스를 uHPLC 분석하여 정량화합니다. 모든 투과 실험을 세 번 반복하세요. GLP-1RA의 정해진 농도에서 생성된 보정 곡선을 통해 GLP-1RA의 누적 플럭스를 정량화합니다.
3. GLP-1RA와 GDC에 함정된 구강 막 준비
참고: 점액 접착제와 뒷면층을 포함하는 구강 이중층 필름은 반자동 코팅기27을 이용한 용매 주조를 사용하여 제조됩니다.
- HPMC와 PVP-K90을 필름 형성 고분자로 사용해 GLP-1RA를 포획할 이중층 막과 점액 접착 성분인 Na-CMC를 준비합니다.
참고: 점액 접착 및 구강 막의 뒷면층 구성은 표 1 을 참조하십시오. GDC는 GLP-1 RA 펩타이드와 함께 저용량 모델 필름에 포함되어, 챔버에 장착된 돼지 구강 점막 전반에 미치는 펩타이드 투과에 미치는 영향을 관찰합니다. - 막 형성 폴리머 45mg HPMC, 10mg Na-CMC, 25mg PVP-K90을 3% 글리세롤 함유 탈이온수에 400rpm 속도로 자기 핫플레이트 교반기로 10분간 녹여 점액 접착층을 준비합니다.
참고: HPMC는 상온에서 용해되며, PVP-K90은 40°C에서 30분간 가열해야 용해됩니다. - 저어진 상태에서 200 F의 Aerosil 2mg을 추가한 후 GLP-1 RA를 추가합니다. 그 다음 GDC를 추가하고 600rpm으로 30분간 분산시킵니다.
- 기포를 제거하기 위해 초음파 욕조를 사용해 최종 폴리머 용액을 90분간 초음파 처리합니다.
- 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 라이너에 필름을 주조하고, 2600 μm, 2 mm/s로 설정된 닥터 블레이드로 코팅합니다. 필름을 40°C의 뜨거운 오븐에서 ~1시간 동안 건조하세요.
- 뒷면층의 경우, 5% 에틸 셀룰로오스(EC)와 5% 프로필렌 글리세롤(PG)을 수소알코올 물(에탄올: 물)에 녹인 후 녹은 슬러리를 PET 라이너에 주조합니다. 마지막으로 건조된 필름을 1cm × 1cm 정사각형으로 자르고 알루미늄 주머니에 포장하여 4 °C에서 보관합니다.
4. 맞춤형 3D 트랜스웰 모방 인서트 인쇄
참고: 3D 프린팅 맞춤형 인서트는 앞서 설명한 방법으로 약간의 수정을 거쳐 제작됩니다.
- 간단히 말해, 컴퓨터 지원 설계(CAD) 소프트웨어를 사용해 3D 모델을 설계하세요.
- 3D 인서트의 크기는 주 원통형 본체(도너 챔버)와 동일하게 유지하며, 최대 표면적은 1659.06 mm2, 전체 외부 치수는 x축 25.20 mm, y축 14.50 mm, z 축 21.63 mm입니다.
- 또한, 상피 조직을 지지할 수 있도록 분리 가능한 원형 고정 링을 설계하세요. 이 링의 외경은 약 19.90mm, 내경은 17.93mm로, 이는 주 원통형 본체의 크기에 해당하며, 트랜스웰 12웰 플레이트에 장착할 수 있습니다(그림 3).
- 모든 부품은 데스크탑 스테레오리소그래피(SLA) 3D 프린터와 UV 경화 가능한 투명 수지를 사용하여 제작하세요. 모든 치수는 대략적인 수치이며, 트랜스웰에 적절히 맞고 실험적 호환성을 보장하기 위해 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
참고: 반응하지 않은 단량체와 잠재적 침출 가능성을 제거하기 위해 모든 부품은 표준화된 후처리 프로토콜을 거쳤으며, 여기에는 깨끗한 99% 이소프로필 알코올(IPA)에서 10분간 세척한 후 제조사 규격에 따라 Form Cure 2에서 상온에서 1분간 UV 경화가 포함됩니다. 3D 모델 설계용 스테레오리소그래피 파일(STL)은 https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 또는 보조 파일(보충 파일 1 및 보조 파일 2)에서 찾을 수 있습니다.
5. 점막을 통한 투과, 3D 인서트에 장착됨
참고: 점액접착 이중층 구강 막에 포함된 GLP-1RA와 GDC의 외부 투과성은 FDC의 대안으로 저부피, 맞춤형 트랜스웰 모방 3D 인서트(그림 2)를 사용해 평가할 수도 있습니다. 이는 FDC의 10mL 수신 측이 펩타이드를 희석시켜 uHPLC의 검출 감도를 위협하기 때문입니다. 따라서 FDC 설계는 펩타이드 플럭스에 비용 효율적이거나 실용적이지 않으며, 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 방사면역분석법(RIA) 검출이 지속적으로 필요하기 때문입니다.
- 데스크탑 SLA 3D 프린터28을 사용해 UV 경화 가능 수지에서 삽입물을 제조/출력하고, 12웰 조직 배양 플레이트에 장착합니다.
- 돼지 구강 점막을 심단과 기저외측 방 사이 1.4cm2 창문 면적에 위치시키고, STX2 젓가덕이 삽입물의 기증 및 수신 면에 부착된 EVOM 2 전압계를 사용해 기저 전피 전기 저항(TEER)을 측정합니다. TEER는 옴의 법칙에 의해 계산됩니다.
- 조직 상단에 막막(1.0 × 1.0 cm2)을 놓은 후, 피펫 0.5mL의 PBS(pH 6.8)를 끝 챔버에, 1.5mL의 PBS(pH 7.4)를 기저외측 챔버에 주입합니다.
- 수신기 쪽에서 3시간 간격으로 1시간 간격으로 샘플(0.2mL)을 채취하고, 같은 양의 신선한 완충제로 교체합니다.
- 플럭스된 GLP-1 RA 펩타이드를 uHPLC로 정량합니다.
참고: 보조 그림 1 및 보충 파일 3에 나와 같이 3D 삽입 후 3시간 이후에는 GLP-1RA의 흡착이 관찰되지 않습니다. - STX2 젓가락 전극을 사용한 EVOM 2 볼트옴미터를 사용해 3시간 간격으로 1시간 간격으로 초상피 전기 저항(TEER)을 측정합니다. TEER는 옴의 법칙에 의해 계산됩니다.
- 돼지의 구강 및 설하 상피 조직 완전성을 확인하려면 FD-4(0.05 mM)를 형광 표지자로 사용합니다.
참고: 모든 실험은 3회로 수행되며, 보고된 결과는 세 세트의 ± SD의 평균입니다.
6. GLP-1 RA의 uHPLC 검출
- uHPLC를 사용해 CSH C18 컬럼(130 Å, 1.7 μm, 2.1 mm × 50 mm)을 사용하여 FDC와 삽입물에 장착된 오로머코사에에 투과한 GLP-1 RA의 양을 정량화합니다. 이동상은 아세토니트릴(Eluent A)에서 0.1% TFA, 물(Eluent B)에서 0.1% TFA입니다. 30 °C에서 8분 동안 그라디언트 용출, 20 μL 주입 부피, 분당 0.7 mL 유량, 214 nm에서 자외선 탐지(보존 시간: ~4.2분).
- 선형성 연구를 수행하세요.
- GLP-1 교정 표준을 사용하여 2.5–20.0 μg·mL⁻¹ 범위의 최적화된 uHPLC 조건의 분석 응답을 추정하기 위한 선형 연구를 설계합니다.
- 보정 표준(n = 6–8 수준)을 독립적으로 준비하고 샘플을 3배로 주입합니다. 피크 면적(mAU)과 명목 농도의 최소제곱 선형 회귀를 수행하고, 결정 계수(r2), % y-절편, 잔차 분포(관찰-예측 반응)를 사용하여 선형성을 평가합니다.
참고: 교정 플롯과 잔차 플롯을 육안적으로 확인한 결과, 가장 낮은 감도 수준(2.5 μg·mL⁻1)에서 선형성에서 미미한 편차가 있었으며, 잔차는 사전 정해진 수용 한계(±3%) 내에 있었습니다. 이후 보정 범위는 2.5–20.0 μg·mL⁻1 범위로 제한되며, 회귀 분석은 허용 가능한 선형성을 보였다(r2 ≥ 0.999, % y-절벽 < 2%, 모든 잔차는 ±3%) 이내였다.
7. 구강 조직 내 GLP-1RA 보유량 추정
- FDCs/삽입물에서 GLP-1 RA 및 GDC에 노출된 돼지 구강 상피 점막을 제거하세요.
- 조직을 PBS로 세 번 헹구어 흡착된 약물과 필름 부패제를 제거합니다.
- 그 후 테이블탑 호모제이저를 사용해 5mL PBS에 조직을 완전히 분해할 때까지 균질화합니다.
- 균질화된 조직과 PBS 간 펩타이드 분배의 평형을 위해 샘플을 4°C에서 하룻밤 보관합니다.
- 그 후 혼합물을 5000 × g에서 5 분간 원 심분리하여 조각을 침전시키고 상청액을 수집하여 정량화합니다.
- uHPLC 분석 전에 0.22 μm 원심분리기 필터로 상원액을 멸균하여 잔류 입자를 제거합니다.
8. 구류조직 조직학
참고: 혼합물, HTC 또는 필름에서 GLP-1 RA가 3시간 동안 투과된 후, 점막을 처리하여 손상 여부를 평가합니다.
- 조직을 10% 포르말린에 48시간 고정한 후, 고정된 조직을 파라핀에 박아주세요.
- 5 μm 크기의 조직을 미세토움을 사용해 절제합니다.
- 그 후 헤마톡실린과 에오신(HE)으로 조직을 염색하여 4× 배율의 광학 현미경으로 조직학적 완전성을 검사합니다.
- 슬라이드는 업라이트 현미경으로 촬영하고 이미지 분석 소프트웨어로 분석됩니다.
참고: 전체 워크플로우는 그림 4에 요약되어 있습니다.
결과
돼지 구강 상피 조직의 분리 및 해리
돼지 구강점막은 인간 오로마코과와 유사한 해부학적 특징과 생리학적 장벽 특성을 공유하기 때문에 대리 조직으로 널리 사용된다29. 돼지 구강 상피 조직은 그림 4에서 볼 수 있듯이 외과적 방법과 가열 방법 모두로 분리됩니다. 처음에는 메스를 사용해 볼의 근육과 더 깊은 결합 조직을 제거합니다. 결합되고 온전한 점막층과 결합 조직을 가진 분리된 조직 조각들을 65°C로 가열한 따뜻한 PBS에 3분간 넣습니다. 조직을 완충제에서 제거하고, 5호 겸자로 상피와 그 밑의 고유층을 떼어냅니다. 가열을 통해 해리된 상피 내 두께가 일정하고 균일하게 유지됩니다.
FDC와 3D 프린팅 인서트에 장착된 돼지 구강 구강 구강 낭코과에 GLP-1RA의 외부 투과
FDC와 삽입물에 장착된 돼지 구강 상피 조직 점막을 사용하여 GLP-1RA의 외부 투과를 평가하였다. GLP-1 RA: GDC의 최적 농도비를 평가하기 위해, 면적이 12.7mm인 면화용 면화장이 담긴 HTC를 FDC에 부착한 점막의 기증 측에 부착하고, 펩타이드-증강제 혼합물을 면화패드에 피펫화하였습니다. GDC를 1:1 비율로 포함했을 때 GLP-1 RA의 누적 투과율은 3시간 동안 약 4.3%에 달했습니다(GLP-1RA 25mg: GDC 25mg). 반면, GDC가 없을 때는 검출 가능한 GLP-1RA 플럭스가 관찰되지 않았다27. P앱을 포함한 정량적 투과성 매개변수는 다음 공식을 사용하여 계산됩니다:
P앱 = 
여기:
Papp: 외관 투과율(cm/s).
dQ/dt: 정상 상태에서 GLP-1RA의 수송 속도로, 단위 시간당 수송되는 펩타이드량(μg/s)으로 계산됩니다.
A: 3D 인서트 면적(cm2).
Co: 공여자(첨단 구획) 내 펩타이드의 초기 농도(μg/mL).
돼지 구강점막 전역의 GLP-1RA의 겉보기 투과성 계수(Papp)는 보충 그림 2 에 나타났다. GLP-1RA:GDC 비율이 1:1일 때, HTC와 동일한 농도가 이중층 필름에 포함되었고; GLP-1RA가 세포에서 점막으로 전달되는 속도가 용액 내 혼합물이나 HTC에서 나타나는 것보다 느리기 때문에, 기존 FDC 구성으로는 GLP-1RA의 침투 현상을 정량화할 수 없었습니다. 이 한계를 극복하기 위해 맞춤형 저용량 3D 프린팅 인서트가 개발되어 수신기 부피를 1.5mL로 줄여 감지 감도를 향상시켰습니다. 3D 삽입물을 사용하면, 3시간 동안 구강 막에서 GLP-1RA의 누적 투과율이 측정 가능하여 약 1.8%에 도달했으며, 이는 그림 5에 나타난다. TEER 값과 FD-4 플럭스를 사용하여 상피 장벽의 무결성과 세포 간 투과성을 평가하였습니다. 치료군에서 TEER의 시간 의존적 감소가 관찰되었으며(보충 그림 3), 이는 GLP-1RA 투과 증가와 일치하였습니다. PBS와 빈 필름 처리 조직에서는 TEER 변화가 없어 이중층 필름 매트릭스가 장벽을 파괴하지 않았음을 나타냈다. 이 데이터는 GDC가 투과 증강 효과의 주요 원인임을 시사합니다.
돼지 조직학 평가
조직학적으로 돼지 구 강점막의 조직학적 평가를 수행하여 조직 분리 방법의 영향과 GLP-1RA 및 GDC 노출 후 상피 완전성을 평가하였습니다. 그림 6에서 보듯, 가열 방법으로 새로 분리된 조직은 정상 상피 생리학적 구조를 보존했으며, 층층이 온전하고 표면에 점액이 연속적으로 분비되어 있었으며, 구조적 손상의 증거는 없었습니다. 반면, 기계적 분리로 분리되거나 저장/냉동된 조직은 상피세포 형태에 미미한 변화와 표면 점액 두께의 감소를 보였습니다. 구강 점막이 25mg GLP-1RA에 노출된 상태에서 25mg GDC가 존재하면, 상피의 완전성을 유지하며 미처리 대조군과 매우 유사하였다. 경미한 부종과 표재성 상피 침식만이 관찰되었습니다. GLP-1RA 단독 또는 블랭크 및 GLP-1RA 노출: GDC 가재 이중층 필름은 눈에 띄는 조직 손상을 일으키지 않았으며, 조직학적 특징은 PBS 처리 대조군과 유사하였다.
그림 1: 돼지 구강이 구강과 구강 및 설하 점막 부위를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 2: FDC 및 구성 요소. 여섯 개의 챔버가 통합 시스템으로 장착되어 있습니다(왼쪽). 한 인물, 프란츠 셀이 보여집니다(가운데). 개별 챔버에 구강 조직을 장착하는 시스템(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3: 3D 프린팅 1 cm2 레진 인서트의 구성 요소. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 4: 돼지 구강상피 분리, 장착, 투과 및 조직학적 특성 분석 과정 워크플로우. BioRender.com 년에 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 5: GLP-1 RA의 누적 양. 25 mg/mL GLP-1RA(빨간색), 25 mg/mL GLP-1RA: 25 mg/mL GDC 용액(검은색), 25 mg/mL GLP-1RA(25 mg/mL GDC 필름 분포 후 보라색)를 HTC, FDC, 3D 인서트를 통해 180분 도포한 후 돼지 구강 상피 점막 수신 측에 GLP-1 RA의 누적 양이 투입되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 6: 다양한 노출 조건에서 돼지 구강상피 점막의 HE 염색 현미경 이미지. (A) 빈 필름, (B) GLP-1RA의 수용성 혼합물: GDC, (C) GLP-1RA:GDC로 포획된 필름, (D) 열처리(65°C) 후 신선한 조직에서 점막을 분리한 것, (E) 열처리 후 냉동 조직에서 분리한 구강상피, (F) 기계적 방법으로 점막을 분리한 것. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
| 점액 접착층의 조성 | |
| 구성 요소 | 농도 (mg) |
| GLP-1RA | 12.5mg |
| GDC | 12.5mg |
| HPMC | 45mg |
| Na-CMC | 10mg |
| PVP-K90 | 25mg |
| 글리세롤 | 3mg |
| 에어로실 200F | 2mg |
| 백킹 레이어 | |
| 에틸 셀룰로오스 | 5mg |
| 프로필렌 글리콜 | 5mg |
표 1: 점액접착제 및 구강 막 뒷면층의 구성.
보충 그림 1: 3D 삽입물을 사용하여 GLP-1RA 0.5 mg을 6시간 인큐베이팅한 후 GLP-1RA의 흡수 현상. 데이터는 세 번의 실험 ± 평균 표준편당수(n = 3)입니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 2: 3D 삽입물에 장착된 돼지 구강 점막 조직을 3시간 노출한 후 GLP-1RA의 겉보기 투과율(Papp). 25 mg/mL GLP 용액(빨간색), 25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC 수액(검정색), 그리고 25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC 구강 막 삽입(보라색). 표현된 데이터는 SD ± 평균 (n = 3)입니다. 그룹 간 통계적 유의성은 p< 0.05로 관찰되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 3: 초상피 저항성(TEER). 3D 삽입물에 고정된 돼지 구강상피 조직에서 25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC 용액(빨간색), 25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC 구강 필름(녹색), 25 mg/mL GLP-1RA PBS(파란색) 노출 후 경상피 저항성(TEER)의 점진적 감소. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 4: 조직의 완전성과 누출. 조직의 완전성과 누출은 3D 삽입물 내 돼지 구강 상피 조직을 기증 측에서 0.05 mM FD4에 노출시켜 평가하였다. 샘플은 6시간 동안 60분 간격으로 채취되었습니다. 세 가지 실험의 평균 +SD. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 1: transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 2: transwell-v9 (JOVE).stl.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 3: 추가 실험 세부사항.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
이 방법론은 돼지 구강 및 기타 구근 상피 분리를 위한 실험 프로토콜과 저효능 안정 GLP-1RA 유사체를 예시로 사용하여 펩타이드 기반 치료제에 대한 투과성 분석법을 설명합니다30. 펩타이드는 점막을 통과하는 투과성이 거의 없는 친수성 고분자입니다17. 위 프로토콜의 성공적인 실행은 구강 및 설하 점막의 정확한 분리와 부착에 달려 있습니다. 격리는 전문적인 기술과 엄격한 온도 조절이 필요하며; 가열 과정 중 미세한 열 변동조차도 상피 조직에 해로운 생리적·형태학적 변화를 유발하여 궁극적으로 투과 데이터의 무결성을 저해할 수 있습니다. 더불어, 맞춤형 3D 프린팅 인서트 내에서 분리된 조직을 고정하는 것은 매우 중요한 단계입니다. 상피층이 섬세하기 때문에 부착 시 조직 파열이나 누출 위험이 더 높습니다. 이를 완화하기 위해 우리는 플럭스 연구를 시작하기 전에 막의 무결성을 보장하기 위한 품질 관리 수단인 FD4 누출 테스트를 도입했습니다. FD4 누출은 처음에 육안으로 평가되었고, UV-가시광선 분광법을 통해 추가 정량화되었습니다. 해당 데이터는 보조 데이터(보충 그림 4 및 보충 파일 3)에 제공되어 있습니다.
기존 FDC는 체외 연구에서 표준으로 간주되지만, 일반적으로 10mL 용량의 수신기 챔버 내 부피가 많아 펩타이드 치료제를 정량화할 때 종종 어려움을 겪습니다. 높은 부피는 과도한 샘플 희석을 초래하여 표준 분석 방법에서 투과 펩타이드 농도를 낮은 LOD 이하로 밀어냅니다. 이를 방지하기 위해, 우리는 Caco-2를 포함한 상피 세포 단층에 사용되는 트랜스웰 시스템의 규모와 부피를 모방한 새로운 3D 프린팅 인서트를개발했습니다. 삽입물은 표준 12웰 조직 배양판에 직접 삽입할 수 있으며, 분리된 돼지 구강 상피 점막을 안전하게 수용할 수 있습니다. 이 수정은 공여체 구획 부피를 거의 7배 정도 줄여 1.5mL로 줄여, 분석물에 집중하고 uHPLC의 감도 한계를 극복합니다. 이 적응은 특히 비용이 많이 드는 저투과성 펩타이드 약물의 정량화에 중요합니다.
GDC가 존재할 때 3D 인서트 시스템을 사용하여 GLP-1 RA 투과가 증가하는 것이 관찰되었습니다. GLP-1RA의 누적 투과량은 3시간에 ~55.3 μg에 도달했으며, 이는 기증 측에 처음 도포된 농도의 ~4.3%에 해당한다. 반면, 구강 필름에 포착된 GLP-1RA와 GDC의 유사한 농도를 FDC에 부착한 구강 점막에 적용했을 때는 측정 가능한 GLP-1 RA 플럭스가 검출되지 않아, 펩타이드 투과가 발생했으나 수신기 부피의 과도한 희석으로 인해 분석적으로 검출되지 않았음을 시사합니다. 그러나 이중층 구강 막 제형에서 GLP-1 RA의 누적 투과율은 3시간 동안 3D 삽입물에서 약 1.8%에 도달하여, 소형 수신 시스템을 이용해 도형에서 구강 조직을 가로지르는 저수준 펩타이드 수송을 검출할 수 있음을 입증했습니다. GLP-1 RA의 체외 투과도 펩타이드와 GDC가 적재된 면사탕을 포함한 HTC를 사용하여 평가하였습니다. 이는 투과 강화제가 포함된 필름에서 펩타이드를 제시할 수 있다는 개념을 증명하는 매우 유용한 초기 스크리닝 장치입니다. 돼지 구강상피의 장벽 무결성은 TEER 및 FD-4 누출을 사용하여 실험 중에 모니터링할 수 있습니다. GLP-1 수용체 작용제(GLP-1 RA) 노출 시 TEER가 느리고 시간에 따라 감소하는 것이 관찰되었으며, 이는 담즙염이 구강 점막에서 유도하는 세포 측 수송 증가와 일치한다32.
이 기술의 한계는 신선한 돼지 조직에 의존한다는 점인데, 이는 도살장에서 항상 즉시 구할 수 있는 것이 아니며, 조직 품질도 변동이 있을 수 있습니다. 실험실에서 적당한 거리에서 신선한 조직을 확보하는 제약을 해결하기 위해, 우리는 나중에 사용할 수 있는 고품질 샘플을 저장할 수 있도록 냉동보호를 평가했습니다. 신선한 조직을 사용하는 것이 최적이지만, 분리된 저장된 점막 조직을 사용하려면 얼음 결정 형성과 그에 따른 장벽 손상을 방지하기 위해 냉동 보호제와 냉동 속도의 신중한 사용이 필요합니다. 이 프로토콜은 표준 거시적 투과 연구와 고민도 펩타이드 분석 간의 간극을 메울 수 있는 역량을 가지고 있습니다. 3D 인서트를 이용해 조직 분리 과정과 투과 프로토콜을 최적화함으로써, 우리는 일반적으로 FDC에서 보고되는 것보다 더 높은 재현성과 감도성을 달성했습니다. 더 나아가, 3D 삽입물의 사용은 연구자들이 비용이 많이 드는 펩타이드 분자에 대한 검출 한계를 제공할 수 있는 틀을 제공하며, 이는 체외 점막 연구의 유연성과 처리량을 크게 향상시킨다.
이 프로토콜들은 펩타이드를 넘어 다양한 약물군을 사용하여 점막 조직 투과를 신뢰할 수 있는 측정의 기초를 제공합니다. 체 외 모델에서 고해상도 투과 프로파일을 생성하는 능력은 동물 모델에서 파생된 전임상 흡수 데이터 예측에 도움을 줄 것입니다. GLP-1 RA의 체외 투과도 펩타이드가 함유된 면사대와 투과 증강제 용액인 GDC가 포함된 HTC를 사용해 평가하였습니다. 이 전달 방식은 혼합물과 점막 표면 간의 밀접하고 재현 가능한 접촉을 보장했습니다. 트랜스웰 모방 3D 인서트에서 GDC 비율이 1:1로 증가했을 때 GLP-1RA의 투과율이 유의미하게 증가하는 것이 관찰되었습니다. 이는 세포 내 펩타이드를 투과성 강화제로 표현하는 개념이 상피세포의 배양 단층을 조직 점막에 적용한 구조 설계에서 가능함을 증명하는 매우 유용한 스크리닝 장치입니다. 돼지 구강상피의 장벽 무결성은 TEER 측정과 FD4 누출을 사용하여 실험 중에 모니터링할 수 있습니다.
전반적으로 체 외 투과 및 조직학적 평가는 투과 강화제 존재 하에서 구강 및 설하 펩타이드 수송의 신뢰성 있는 평가가 조직 준비, 플럭스 프로토콜, 분석 민감도에 의존함을 보여줍니다. 연구된 분리 방법 중에서, 신선히 채취한 돼지 구강 및 설하 상피를 열기법으로 분리함으로써 상피의 완전성 유지와 조직 해리 재현성 사이의 균형을 이루었으며, 이는 안정적인 기초 TEER, 최소한의 FD4 누출, 보존된 조직 세포 구조로 입증되었습니다. 특히 3D 프린팅 인서트는 수신기 구획 희석을 줄여 FDC에서 검출되지 않는 저펩타이드 플럭스의 정량화를 가능하게 하여 실험 신뢰성을 크게 향상시켰습니다. 이 결과들을 종합하면, 조직 삽입 챔버에서 분리된 돼지 구강 상피 점막을 전신 전달을 위한 치료 펩타이드의 구강 투여를 평가하는 외부 플랫폼으로 활용하는 것이 뒷기침됩니다.
공개 사항
저자들은 공개할 재정적 연루나 이해 충돌이 없습니다.
감사의 글
저자들은 기술 지원을 제공해 준 벤 쇼블린(UCD 수의학대학)에게 감사를 표합니다. 또한 uHPLC 분석을 지원해 주신 한스 에크하르트 박사(UCD 화학대학)께도 감사드립니다. 이 프로젝트는 유럽연합의 Horizon Europe 연구 및 혁신 프로그램으로부터 보조금 번호 101071054의 지원을 받았습니다. 또한 보조금 번호 13/RC/2073_P2, Research Ireland의 CURAM 의료기기 센터, 유럽 개발 기금으로부터 추가 자금 지원을 받았습니다. 저자들은 돼지 뺨살을 제공해 준 로즈데라 아이리시 미트의 케네스 맥나마라에게 감사의 뜻을 전합니다.
재료
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| EEG 수집 모듈 | Upside Down Labs | BioAmp EXG 필 | 바이오 전위 신호용 아날로그 프론트 엔드 |
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| Matplotlib / Seaborn | 오픈 소스 | 최신 버전 | 시각화 라이브러리 |
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| Python 프로그래밍 환경 | Python Software Foundation | Python ≥3.8 | 오픈 소스 프로그래밍 언어 |
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| 신호 처리 라이브러리 | SciPy | 최신 버전 | 필터링, STFT |
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