난소 미세환경 탐구: 마우스 난소 체세포의 분리, 2D 배양 및 오가노이드 배양 방법

요약

우리는 기질이 풍부한 난소 분획에서 마우스 난소 체세포를 분리하고, 스캐폴드 없는 접근법을 사용하여 마우스 난소 체세포 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

초록

난소는 난포 내와 주변 기질체 내에 다양한 체세포 집단으로 구성되어 있어 난소 기능을 지원하고 고품질 생식세포 생성에 필수적입니다. 우리는 내피, 상피, 스테로이도제닉, 기질, 면역 세포 등 쥐 난소에서 체세포를 분리하는 방법을 보고합니다. 이러한 1차 난소 체세포가 전통적인 2D 배양 시스템에서 도판 및 배양될 때, 난소에서 일반적으로 발견되는 세포 이질성, 조직, 세포 간 및 세포-기질 상호작용이 사라집니다. 따라서 우리는 스캐폴드 없는 접근법을 사용하여 쥐 난소 체세포 오가노이드를 생성하는 방법도 설명합니다. 이 오가노이드는 자가 조립하여 다양한 세포 집단을 유지하고, 세포외 기질과 분비 인자(사이토카인을 포함)를 생성합니다. 오가노이드는 공동 배양 실험에 활용할 수 있으며, 최소 3주간 배양 내에서 유지할 수 있고 생존율이 높습니다. 전반적으로 이 모델들은 체세포 관점에서 난소 생리학과 병리학을 조사할 수 있게 합니다.

서론

난자, 즉 여성 생식세포는 다음 세대를 생성하는 데 필수적이지만, 난소 내 체세포 집단은 생식자 발달, 스테로이드 호르몬 생성, 난소 항상성에 중요한 역할을 합니다. 난자세포는 체세포 과립과 테카 세포로 둘러싸여 난소의 기능적 단위인 난포를 형성합니다. 육아형 세포는 난자와 경대 투사로 물리적으로 연결되어 있으며, 감수분열 정지를 조절하는 것 외에도 난자에 대사 및 영양 지원을 제공합니다 ^1,2. 더불어, 생식선자극호르몬에 반응하여 육아세포와 테카 세포는 에스트로겐, 프로게스테론, 안드로겐 등 스테로이드 호르몬을 생성하는데, 이들은 생식계를 넘어 심혈관계, 근골격계, 신경계에 영향을 미치고, 이는 여성 건강 전반에 영향을 미칩니다^. 난소 난포는 혈관, 면역 세포, 여러 간질성 섬유아세포 및 중엽 세포 집단, 그리고 고도로 질서가 있는 세포외기질(ECM^)으로 구성된 이질적인 난소 기질 내에서 발달합니다. 이 기질 미세환경은 난포 성장, 배란, 황체형성에 영향을 미치는 물리적·화학적 신호를 제공합니다^.

생식세포와 난포를 시험관 내에서 분리하고 배양하는 여러 방법이 존재하며, 이러한 방법들은 난자 발생과 난포 발생에 대한 이해를 진전시^{켰습니다.} 그러나 난소의 체세포 구획은 부분적으로 견고한 시험관 내 모델이 부족하기 때문에 상대적으로 연구가 부족합니다. 현재 난소 체세포 구획의 모델은 주로 섬유아세포, 난소 표면 상피세포, 내피세포, 면역세포 또는 육아 세포 6,7,8,9,10,11과 같은 단일 세포 유형에 제한되어 있습니다. 2D에서 광범위하게 정의된 일차 난소 체세포의 배양은 시간이 지남에 따라 대식세포 집단에 유리하게 작용하여 세포 이질성을 잃게 됩니다¹². 더불어, 기존의 2차원(2D) 단일층 배양은 난소에 존재하는 다양한 세포-세포 및 세포-기질 간 상호작용을 허용하지 않습니다. 난소 조직 이식은 원래 조직의 세포 및 구조적 복잡성을 유지하지만, 난소 내 어디에서 유래했느냐에 따라 조성은 달라집니다^13,14.

오르가노이드는 3차원(3D), 다세포, 소형 장기나 조직으로, 생체 내에서 조직과 기능을 재구성하는 형태입니다^15,16. 오르가노이드는 정상 또는 병든 조직에서 분리된 줄기세포나 1차 세포로부터 생성될 수 있습니다¹⁵. 여성 생식계 맥락에서, 자궁내막, 난관, 자궁경부, 태반¹⁷을 모델링하기 위해 오르가노이드가 생성되었습니다. 그러나 난소와 관련해서는 최근까지 오가노이드 모델은 난소 표면 상피세포나 암세포 등 단일 세포 유형에 한정되었거나, 난소 기질 대신 난포 구조를 닮도록 유도된 다능성 줄기세포에서 생성되기도 했습니다^17,18. 최근 연구들은 쥐, 붉은털원숭이, 인간 난소 조직에서 분리된 이질적인 체세포 집단을 이용해 오가노이드를 생성하고 특성화하였다 19,20,21. 이 오르가노이드 모델은 난소 노화의 세포 기전과 프탈레이트 노출이 ECM 조성에 미치는 영향을 연구할 수 있게 했습니다^19,21.

난포와 기질에서 체세포가 난소 기능에 매우 중요하다는 점을 고려하여, 우리는 기질이 풍부한 쥐 난소에서 체세포를 분리하고, 전통적인 단일층 배양 또는 오가노이드 모델을 사용하여 시험관 내에서 배양하는 방법을 설명합니다. 스캐폴드 프리 아가로스 마이크로몰드를 사용하면 난소 체세포가 1일에서 3일 이내에 오가노이드를 형성합니다. 오가노이드는 섬유아세포, 대식세포, 스테로이도조생 세포 등 주요 난소 세포군을 보존하며, 최대 3주간 높은 생존율로 배양할 수 있습니다. 난소 체세포 오르가노이드는 전사체 및 조직학적 평가, 조건 배지 분석, 다른 세포 유형과의 공동 배양, 그리고 화합물 선별 방법에 적합합니다. 전반적으로 이 오가노이드는 난소 체세포 구획의 시험 관 내 탐색과 조절을 위한 견고한 모델이며, 난소 발달, 노화, 생리학 및 병리학 연구에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜 개발에 동물을 사용한 것은 노스웨스턴 대학교의 기관 동물 관리 및 이용 위원회와 국립보건원(NIH) 실험동물 관리 및 사용 지침(노스웨스턴 대학교 동물 복지 보증 번호: A3283-01; IACUC 프로토콜 ID: IS00013082_IM12). 아가로스 마이크로몰드, 매체, 보충제용 실리콘 주조품을 포함한 모든 재료의 제조사 정보와 카탈로그 번호는 재료표에 제공되어 있습니다. 프로토콜 단계에 대한 개요는 그림 1에 제시되어 있습니다. 모든 프로토콜 단계는 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 모든 기관 생물안전 및 환경 보건 안전 규정을 준수하고, 별도의 명시가 없는 한 Class II 생물안전 캐비닛 내에서 수행되어야 합니다.

그림 1: 마우스 난소 체세포 분리, 난소 체세포 생성 및 후속 응용의 개식도. 쥐 난소를 분리하면 기질 분획이 풍부해집니다. 농축된 기질 분획은 효소 및 기계적으로 소화됩니다. 소화되지 않은 조직은 압착되어 배출됩니다. 세포는 2D 배양을 위해 펠릿 채취, 세척, 계수, 플레이트 부착을 거칩니다. 오르가노이드 생성 시에는 2D 배양 후 하룻밤 동안 세포를 추출하여 세포를 추출하고 펠릿으로 세척하고 계수합니다. 세포는 오가로스 마이크로몰드에 씨앗되어 오가노이드 배양을 위해 진행됩니다. 오르가노이드는 조직학, RNA/단백질 추출, 조건 배지 분석, 치료, 약물 스크리닝, 그리고 공동 배양에 활용될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

1. 난소 체세포 분리 및 배양을 위한 배지 준비

참고: 난소 조직의 소화 및 이후 원차 체세포의 분리 및 배양에는 네 가지 유형의 배지가 필요합니다: 해양 배지(DM; 마우스 난소 해리 및 천공을 위해 2.3–2.4단계에서 사용), 효소 배지(EM; 기질 풍부 생쥐 난소의 효소 소화를 위해 2.5–2.8단계에서 사용), 소결 배지(QM; 2.9단계에서 효소 소화 속도를 늦추기 위해 사용), 그리고 플레이트 배양(PM; 2.11–2.14 및 4.6단계에서 원차 난소 체세포의 세척, 플레이트 부착, 2D 배양 및 2D 배양 시 트립신 비활성화에 사용됨). 모든 매체는 멸균된 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 또는 층류 후드에서 준비되어야 합니다. 아래에 나열된 배지 레시피는 5–6마리의 난소 가공에 충분하지만, 필요에 따라 크기를 조절해야 합니다. 모든 배지는 최대 일주일 전에 준비하여 4 °C에서 보관할 수 있으나, EM 효소는 세포 분리 당일에 신선하게 첨가해야 합니다.

1. Leibovitz의 L-15 배지에 1% 태아 소 혈청(FBS)과 0.5% 페니실린-스트렙토마이신(PS)을 포함한 DM(15 mL)을 준비합니다. 멸균 필터를 사용해 매체를 멸균하세요.
   참고: DM은 주변 공기 교환을 위해 완충 처리되며, 주변 조직으로부터 난소를 미세해부하거나 기질 분획을 위한 농축 시 사용됩니다.
2. 1% FBS와 0.5% PS 함유의 EM(10 mL)을 αMEM으로 준비합니다. 콜라겐제 IV 효소 82 단위/mL와 DNase I 0.2 mg/mL(≥400 효소 활성 단위/mg)를 추가합니다. 효소를 역전시켜 용해한 후 멸균 필터를 사용해 매체를 멸균합니다.
   참고: 효소 매체는 5%_CO2 산소 교환을 위해 중탄산나트륨 완충 처리되어 난소 조직 조각의 효소 소화에 사용됩니다.
3. αMEM 배지에 FBS 10%와 PS 0.5%를 포함한 QM(20 mL)을 준비합니다. 멸균 필터를 사용해 매체를 멸균하세요.
   참고: QM은 5%_CO2 산소 교환을 위해 중탄산나트륨 완충 처리되어 효소 소화를 소화하는 데 사용됩니다.
4. RPMI 1640에 10% FBS와 1% PS(25 mM HEPES 및 2 mM L-글루타민 함유)를 포함한 PM(30 mL)을 준비합니다. 멸균 필터를 사용해 매체를 멸균하세요.
   참고: PM은 5%_CO2 산소 교환을 위해 중탄산나트륨 완충 처리되어 있으며, 원발 난소 체세포 도판 및 2D 배양에 사용됩니다.

2. 난소 조직의 소화 및 원차 체세포의 분리

참고: 쥐 난소는 1차 체세포를 분리하기 위해 효소 및 기계적으로 분리 및 소화됩니다. 5마리에서 6마리의 난소는 한 접시에서 함께 처리할 수 있습니다. 다음 단계는 무균 기법을 사용하여 수행해야 하며, 가능하면 층류 후드 내 해부 현미경을 사용해 수행해야 합니다.

1. EM 10 mL, QM 20 mL, PM 20 mL를 각각 100 mm 페트리 접시에 추가하세요. 사용 전 최소 1시간 동안 조직 배양 인큐베이터(가습 환경, 37°C,_CO2 5% 등산화탄소 함유)에서 접시를 평형으로 유지하세요.
2. 사용 전에 DM을 37°C의 물에 데워 넣으세요.
3. 쥐 난소를 3mL DM이 들어 있는 35mm 페트리 접시에 해부합니다. 가늘게 땡은 겸자나 미세가위로 난소를 부착된 지방 조직, 난관, 난소 점액낭과 분리합니다(그림 2Ai,ii). 필요 시 해부 현미경을 활용해 미세해부를 진행하세요.
4. 해리된 난소를 2–3 mL DM이 들어간 45mm 시계 유리에 옮깁니다. 해부 현미경 아래에서 비우세 손과 우세 손으로 각각 28-G 인슐린 바늘로 난소 모든 부위를 앵커하고 천공하여 약 10분간 삽입합니다. 난소 조직을 자주 회전시켜 모든 부위가 손상되도록 하세요.
   참고: 난소를 뚫으면 난포 전부, 적선-난자 복합체 및 구립세포가 난포에서 방출되어 기질 분획이 풍부해집니다(그림 2Aiii–iv).
5. 가늘게 봤던 겸자를 사용해 기질이 풍부한 쥐 난소를 평형 EM으로 페트리 접시로 옮기세요(그림 2Bi).
6. 매지의 온도와 pH 변화를 최소화하기 위해 빠르게 작업하며, 기질이 풍부한 난소를 미세 끝의 겸자로 약 2–3mm 조각으로 찢어냅니다(그림 2Bii).
7. 페트리 접시를 각도를 잡고 p1000 피펫으로 난소 조직 조각이 포함된 EM을 반복적으로 피펫팅하세요. 피펫은 1 mL, 100× 또는 3분 동안 빠른 시각으로 설정됩니다(그림 2Biii). 페트리 접시를 필요에 따라 돌려 모든 조직 조각이 피펫팅되었는지 확인하세요.
   참고: 조직이 너무 커서 p1000 팁으로 피펫 채취가 불가능하면, 멸균 메스로 끝을 잘라 입구를 넓힐 수 있습니다. 보어는 조직 조각 대부분(>50%)이 들어갈 수 있을 만큼 충분히 넓어야 하며, 전단이 아닌 형태로 전단 효과를 만들어냅니다.
8. EM과 난소 조직 조각이 담긴 페트리 접시를 조직 배양 인큐베이터(가습 환경, 37°C, 5%_CO2)로 옮겨 총 30분간 배양하고, 접시를 제거하고 15분 후에는 반복(100× 또는 3분간 피펫팅), 30분 배양 종료 후 다시 피펫팅합니다(그림 2Biii).
   참고: 첫 15분 배양 후에는 조직 조각이 충분히 소화되어 >80%가 p1000 피펫 팁을 통과할 수 있어야 하며, 입구를 넓히기 위해 팁을 자를 필요가 없습니다. 소화 과정의 총 시간과 피펫팅 시간은 찢어진 조직 조각의 시작 크기에 따라 달라집니다. 더불어, 마우스의 나이와 혈통, 효소 활성의 로트 간 변동성, 피펫 구멍 크기도 조직 분해 속도에 영향을 줄 수 있습니다. 난소 조직 조각이 약 1mm 크기로 분해되어 눈으로 여전히 보이면 소화가 억제되어야 합니다(그림 2Biv). 과소화는 세포 손실과 세포 생존력 저하로 이어질 수 있습니다.
9. 조직 소화 속도를 늦추기 위해 20mL의 예평형 QM을 첨가하여 효소를 희석하세요(그림 2Ci).
10. 세포 현탁액을 50mL 원뿔관 위에 놓은 40μm 세포 체를 통과시켜 소화되지 않은 조직 조각을 제거합니다(그림 2Cii). 300 × g 에서 실온에서 5분간 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만듭니다(그림 2Ciii).
11. 세포를 흡인하여 상정액을 제거하고, 세포 펠릿을 1 mL의 예평형 PM에 재현탁한 뒤, 세포 현탁액을 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮긴 후 300 × g 에서 5분간 실온에서 원심분리하여 다시 세포를 펠릿으로 투여합니다(그림 2Civ).
12. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 1mL의 PM에 재현탁한 뒤, 10 μL 알리코트 크기의 세포를 트리판 블루로 염색하여 세포 생존 가능성을 평가하고, 혈액세포계를 사용해 세포 수를 세는 것입니다.
    참고: 이 단계에서 마우스 계통과 연령에 따라 예상되는 원발 난소 체세포 수는 표 1 을 참조하십시오. 이 단계에서 세포 생존율은 >80%여야 합니다.
13. 조직 배양 처리 용기에 약 1.25 ×¹⁰ 5-1.5 × 10⁵/^cm² 밀도로 플레이트를 부착합니다(예: 약 3 × 10⁶ 세포 수는 조직 배양 처리된 60 mm 접시에, 약 1 × 10⁶ 세포 수는 조직 배양 처리된 6 웰 플레이트의 한 웰에 플레이트 칩).
    1. 플레이트나 접시의 총 부피에 따라 추가 PM을 추가하세요(예: 60mm 접시를 사용하면 PM 4mL를, 6웰 플레이트의 웰을 사용할 경우 PM을 2mL 추가).
       참고: 위에 나열된 플레이트 밀도는 2D 배양 후 오가노이드 생성에 사용할 경우 권장됩니다. 더 긴 2D 배양을 위해서는 세포를 낮은 밀도로 플레이트링할 수 있습니다. 평형이 맞지 않은 추가 도금 매체는 최대 1주일간 4°C에서 보관할 수 있습니다. PM은 오가노이드 생성과 2D 배양에서 난소 체세포 유지에 모두 필요합니다. 이 시점에서 난소 체세포는 2D 단층 배양(단계 2.14)에서 유지하거나 오가노이드 생성에 사용될 수 있습니다(섹션 3으로 진행). 오가노이드 생성 전 하룻밤 2D 배양은 40 μm 세포 체균을 통과했을 수 있는 초기 난포에서 난자를 제거하기 위해 필요합니다.
14. 도금 하룻밤(최소 16시간) 후, 인산염 완충 식염수(PBS; Mg/Ca-프리, pH 7.0–7.3)를 사용하여 죽은 세포와 이물질을 제거합니다(그림 3A). 세척 후 신선한 PM을 추가하고, 배양 과정 동안 격일로 신선한 PM으로 대체합니다(그림 3B).
    참고: 분리 후 높은 세포 생존율에도 불구하고, 플래팅 후 하룻밤 동안 플래팅 후 세포 사멸이나 조직 배양 혈관에 부착되지 못해 총 세포 수가 크게 감소하는 경우가 일반적입니다(그림 3A).

그림 2: 마우스 난소 체세포 분리 도식. (A) 마우스 난소 박리 및 (iii,iv) 기질 풍부화 대표 이미지. 쥐의 난소는 Ai의 점선으로 윤곽이 그려져 있습니다. (B) 기계적 및 효소 소화 과정 전반에 걸친 난소 조직 조각의 대표적 이미지. 기질 농축 난소는 (i) 찢어지기 전과 (ii) 후, (iii) 피펫팅 중 난소 조직 조각, (iv) 소화 후 난소 조직 조각입니다. (C) (i) 소화 억제, (ii) 세포 부유액 여과, (iii,iv) 마우스 1차 난소 체세포 세포 페일릿 투여의 대표 이미지. Cii와 Ciii의 삽입물은 각각 원심분리 후 세포 체와 세포 펠릿에 포착된 소화되지 않은 조직 조각을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 1차 난소 체세포는 2D로 배양할 수 있습니다. (A) 60mm 접시에 60mm 접시에 플레이트링된 1차 난소 체세포의 대표적인 빛 투과 이미지, 도금 후 PBS 세척 전후 (B) 24웰 플레이트에 3일간 배양된 1차 난소 체세포의 대표성 투과광 이미지. 스케일 바 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

3. 오가로스 마이크로몰드 및 배지를 준비하여 오가노이드 생성 및 배양

참고: 난소 체세포 오가노이드는 난소 오가로이드 배지를 가진 스캐폴드 없는 아가로스 마이크로몰드에서 생성 및 배양됩니다. 아가로스 마이크로몰드와 난소 오가노이드 배지는 멸균된 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 또는 층류 후드에서 무균 기법으로 준비해야 합니다.

1. 아가로스 마이크로몰드 제조
   1. 마이크로몰드와 그라페 겸자용 실리콘 주형을 멸균 파우치와 오토클레이브에 넣어 건조 사이클로 멸균합니다(재킷 압력: 20 psi, 챔버 온도: 250 °F (121.11 °C), 멸균 시간: 15분).
      참고: 여러 실리콘 주조물을 오토클레이브하여 한꺼번에 사용할 수 있어 아가로스 마이크로몰드의 더 빠른 생성이 가능합니다.
   2. 아가로스 마이크로몰드 저장을 위해 24웰 조직 배양판의 각 웰에 1% PS 함유 PBS 1mL를 첨가합니다.
   3. 전자레인지, 온수 욕조 또는 핫플레이트에서 가열하여 1.5% (w/v) 멸균 아가로스를 PBS에 녹입니다.
      참고: 50mL 원뿔형 튜브를 100mL 비커에 넣고 물을 채운 상태로 전자레인지에 아가로오스를 용해하는 것이 잘 작동합니다(그림 4Ai). 조절된 끓임을 가능하게 하는 것 외에도, 비커에서 만들어지는 뜨거운 물은 아가로스의 재응고를 늦춥니다.
   4. 액체 아가로스를 약 50°C까지 식혀 튜브를 편안하게 다룰 수 있을 때까지 기다립니다.
   5. 1.5% 아가로스 300–350 μL 액체를 천천히 실리콘 주형에 주입하되, 주형을 과도하게 채우거나 부족하게 채우지 않고 기포 발생을 방지하라(그림 4Aii). 아가로스가 주물 상단에 오목하거나 볼록한 가장자리가 아닌 평평한 층을 만들어야 합니다(그림 4Aiii, iv). 아가로오스가 굳기 시작하기 전에 멸균된 p10 피펫 팁으로 기포를 터뜨립니다(그림 4Bi–iii).
   6. 실리콘 주형에서 아가로스를 실리콘 주형에서 2–3분간 고체시키세요(그림 4Biv).
   7. 고체화된 후에는 PBS + 1% PS를 포함한 24웰 조직배양판의 웰 위에 실리콘을 뒤집어 주조합니다. 실리콘을 조심스럽게 구부려 아가로스 마이크로몰드를 플레이트 안으로 방출합니다(그림 4Ci).
      참고: PBS +1% PS에 담근 아가로스 마이크로몰드는 24웰 조직 배양판에 파라필름으로 감싸여 있으며, 사용 1개월 전까지 4°C에서 보관할 수 있습니다(그림 4Cii). 아가로스 마이크로몰드는 사용 최소 16시간 전에 준비해야 하며, 마이크로웰에는 주조 직후 PBS + 1% PS 수치의 공기 방울이 종종 존재하기 때문입니다(그림 4Ciii). 하지만 이러한 공기 방울은 저장 중에 사라집니다(그림 4Civ). 오가로이드 배양에 사용하기 전에, 아가로스 마이크로웰 삽입물은 주조 과정에서 마이크로웰이 융합되거나 파손되지 않았는지 현미경으로 꼼꼼히 검사해야 합니다(그림 4Di–iv). 결함이 있는 마이크로몰드는 오가노이드 생성 및 배양에 권장되지 않습니다. 결함이 발생할 수 있는 약 25%를 보정하기 위해 과도한 아가로스 마이크로몰드를 준비하는 것이 권장됩니다
2. 난소 오가노이드 매질의 준비
   1. 바이오세이티 캐비닛에서 제조사 지침에 따라 기저 배지에 오가노이드 성장 배지(마우스) 보충제(1, 2 및 1% PS)를 첨가하세요. 준비된 난소 오가노이드 배지는 사용 전 최대 2주간 4°C에서 보관하세요.
      참고: 보충제 1과 2는 분리하여 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

그림 4: 아가로스 마이크로몰드 준비 도식. (A) (i) 1.5% 아가로스 준비, (ii) 실리콘 주형에 피펫팅, (iii) 적절히 충전된 실리콘 주형, (iv) 과충전된 실리콘 주조물의 대표 이미지. Aiii와 Aiv의 점선은 각각 아가로스 마이크로몰드의 평평한 바닥과 볼록한 바닥을 보여줍니다. (B) (i,ii) 아가로스 내에 기포가 있는 채워진 실리콘 주형, (iii) 아가로스 고화 전 피펫 팁으로 기포를 터뜨리는 모습, (iv) 실리콘 주물 내 고체화된 아가로스 마이크로몰드의 대표 이미지. (C) (i) 실리콘 주조물에서 고화된 아가로스 마이크로몰드 제거, (ii) PBS + 1% PS 함유 24웰 플레이트에 아가로스 마이크로몰드를 보관한 모습, (iii) 주조 직후 마이크로웰에 존재하는 기포, (iv) 16시간 보관 후 기포 없는 제대로 주조된 아가로스 마이크로몰드의 대표 이미지. (D) (i,ii) 결합 우물, (iii) 파괴된 우물 또는 (iv) 손상된 마이크로몰드의 대표 이미지. 약어: PBS = 인산염 완충 식염수; PS = 페니실린-스트렙토마이신. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. 오르가노이드의 생성과 배양

참고: 2D 배양 하룻밤 후 1차 난소 체세포를 2D 배양에서 채취하여 아가로스 마이크로몰드에 씨앗을 주입하여 오가노이드를 생성합니다. 다음 단계는 멸균된 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛에서 무균 기법을 사용하여 수행되어야 합니다.

1. PM과 오르가노이드 배지를 37°C까지 물에 넣고, 0.05% 트립신을 실온으로 데웁니다.
2. Graefe 핀셋을 사용해 마이크로몰드를 조심스럽게 새로운 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다(그림 5Ai).
3. 아가로스 마이크로몰드가 포함된 24웰 플레이트의 각 웰에 500 μL 난소 오가노이드 배지를 추가합니다(그림 5Aii). 마이크로몰드는 매체에 완전히 잠겨 있어야 하며, 인큐베이터(습기 환경, 37°C,_CO2 5% 함유)에서 최소 30분 이상 평형을 유지하세요.
4. 흡인하여 부착된 난소 체세포에서 PM을 제거하고, Mg/Ca-프리 PBS로 세포를 세척하세요.
5. 2D 배양에서 세포를 채취하기 위해 0.05% 트립신(6웰 플레이트 또는 60mm 접시용 1–2mL 트립신)을 첨가합니다. 세포를 37°C에서 인큐베이터에서 2–3분간 트립신과 함께 배양합니다.
6. 세포가 현미경으로 분리되었는지, 트립신 1부피당 2부피의 가열된 PM을 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
7. 세포 현탁액을 15mL 원뿔 튜브로 옮기고, 300 × g 에서 원심분리하여 실온에서 5분간 펠릿으로 세포를 투여합니다.
8. 세포를 1mL의 가열한 PM에 재현탁하고, 트리판 블루로 세포 알리코트를 염색하여 세포 생존성을 평가한 뒤, 헤모사이토미터로 세포 수를 세는 것입니다.
   참고: 2D 배양 하룻밤 및 이후 트립신화 후 생쥐 계통과 연령에 따라 예상되는 원발 난소 체세포 수는 표 1 을 참조하십시오. 트립신화 세포의 생존율은 일반적으로 90% 이상입니다.
9. 세포를 원심분리(실온에서 300 × g, 5분간 투여)로 세포를 펠릿 주입하고, 세포 펠릿을 난소 오가노이드 배지에 재현탁하여 1mL 배지당 3.33 × 6^{개의 생세포} 10개, 즉 75 μL의 배지당 2.5 × 10개의⁵ 개 생세포를 만듭니다.
   참고: 여기서는 아가로스 마이크로몰드당 2.5×^{10개의 5} 세포가 시딩됩니다. 따라서 생성할 수 있는 마이크로몰드의 총 수는 총 셀 수에 따라 달라집니다. 오가로이드는 아가로스 마이크로몰드당 2.5 × 10⁵ 세포 미만으로 생성될 수 있지만, 오가노이드 크기, 응집 반응학, 상대 세포 구성 및 호르몬 생성 등 기능에 영향을 받을 수 있습니다.
10. 인큐베이터에서 평형 아가로스 마이크로몰드를 제거하고, 마이크로몰드가 세포 씨앗 채집이 위를 향하도록 정렬한 뒤, 난소 오가노이드 배지를 세포 씨앗 채집에서 제거하세요(그림 5Aiii).
    1. 마이크로몰드의 세포 씨앗 실에서 배지를 제거하려면 Graefe 겸자를 사용해 마이크로몰드를 들어 올리고 기울이거나, 피펫팅으로 제거하세요. 피펫으로 세포 시딩 챔버에서 배지를 제거할 때, 피펫 끝을 세포 시딩 챔버 모서리 위에 살짝 올려놓고 배지를 채취합니다. 마이크로웰을 손상시키지 않도록 아가로스 마이크로몰드와 직접 접촉하지 마세요.
       참고: 세포 씨앗 챔버는 가능한 한 건조하여 마이크로웰이 눈에 보이도록 해야 하지만, 마이크로몰드 외부는 난소 오가노이드 배지로 둘러싸여야 합니다(그림 5Aiii).
11. 각 아가로스 마이크로몰드의 세포 시딩 챔버에 75 μL(즉, 2.5 × 10⁵ 세포)을 직접 투여하고 기포 생성을 방지합니다(그림 5Bi). 24웰 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣으세요.
12. 세포 씨앗 후 1시간에서 2시간 후, 아가로스 마이크로몰드 외부에 250 μL의 가열된 난소 오가노이드 배지를 추가로 넣으면서도 세포 씨앗 실을 방해하지 않도록 주의합니다(그림 5Bii).
    참고: 1차 난소 체세포는 아가로스 마이크로몰드에서 씨앗 후 1–24시간 이내에 집집을 시작해야 합니다(그림 5Biii).
13. 세포 씨앗 다음 날부터 아가로스 마이크로몰드 주변 배지를 750 μL의 신선한 난소 오가노이드 배지로 교체하고, 배양 내내 격일로 교체합니다.
    1. 매체를 교체하려면 아가로스 마이크로몰드 주변의 사용된 매체를 제거하기 위해 플레이트를 약간 각도로 잡으세요. 세포 시딩 챔버에서 배지를 제거하지 마세요. 세포 씨앗 챔버를 방해하지 않도록 신선한 배지를 웰 벽 쪽으로 부드럽게 피펫팅하세요.
       참고: 매체 변화로 인한 조건화된 배지는 -80°C에서 저장하여 오가노이드 분비 인자 분석에 활용할 수 있습니다. 오가노이드가 형성되면(세포 시딩 후 1–3일 후), 배지를 재조합 단백질, 억제제 등이 포함된 배지로 교체하여 다양한 처리가 오가노이드 기능에 미치는 영향을 조사하거나 화합물 스크리닝을 위해 사용할 수 있습니다.

그림 5: 난소 체세포 오가노이드 생성 개요. (A) (i) Graefe 겸자로 아가로스 마이크로몰드를 배양판에 옮기는 대표 이미지, (ii) 난소 오르가노이드 배지에서 아가로스 미세몰드의 평형화, (iii) 세포 씨앗 챔버에서 배지 제거. Aiii의 화살표는 빈 세포 씨앗 챔버를 나타냅니다. (B) (i,ii) 아가로스 마이크로몰드에 진혈 세포를 시딩하는 대표 이미지와 (iii) 난소 체세포가 집결하는 아가로스 미세몰드의 투과된 광선 스캔. 스케일 바(Biii): 2500 μm. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

5. 오가노이드의 하위 응용 활용

참고: 오가노이드는 조직학, 분자생물학(예: RNA/단백질 분석), 조건 배지 분석, 공동 배양 등 다양한 후속 응용 분야에 활용될 수 있습니다.

1. 조직학
   참고: 오가로이드는 아가로스 미세몰드에서 제거하지 않고도 조직학적 종점에 대해 처리할 수 있습니다. 실제로 아가로스 마이크로몰드 내의 오르가노이드는 조직 마이크로어레이와 유사하게 작용하여, 한 번에 여러 개의 일정한 간격을 가진 오가노이드를 고처리량 조직학적으로 평가할 수 있습니다.
   1. 1.5% (w/v) 멸균 아가로스를 PBS에 끓여 녹입니다.
   2. 난소 체세포 오가노이드 배양 후에는 플레이트를 비스듬히 잡고 아가로스 미세몰드 주변의 배지를 제거합니다.
   3. 해부 현미경 아래에서, 피펫 팁을 각 세포 시딩 챔버 모서리 위에 부드럽게 올려 세포 시딩 챔버에서 배지를 제거하고, 오가노이드나 마이크로몰드 자체를 손상시키지 않고 조심스럽게 배지를 끌어올립니다.
   4. 각 세포 시딩 챔버 모서리에 100–125 μL 액체 1.5% 아가로스를 약 50 °C로 냉각하여 세포 시딩 챔버를 채우고 밀봉하되, 오가노이드를 손상시키지 않도록 주의합니다(그림 6Ai).
   5. 아가로오스를 실온에서 2–3분간 굳히세요.
   6. 각 웰에 750μL 변형 데이비슨 또는 4% 파라포름알데히드를 첨가하고, 4°C에서 밀폐된 아가로스 마이크로몰드 내에 오가노이드를 고정합니다.
   7. 고정 후에는 고정제를 제거하고 아가로스 마이크로몰드를 70% 에탄올로 세척하세요.
      참고: 마이크로몰드는 조직 처리(탈수, 정화, 왁스 침투)까지 4°C의 70% 에탄올에 보관할 수 있습니다. 조직 처리 중에는 아가로스 마이크로몰드의 방향을 추적하세요.
   8. 조직 처리 후에는 아가로스 마이크로몰드를 파라핀에 박아 마이크로몰드가 파라핀 블록 내에서 평평하게 위치시키고, 마이크로몰드 바닥이 가장 먼저 절단되도록 합니다(그림 6Aii).
   9. 파라핀 절반을 5 μm 거리에서 차단하고 조직 절편을 전하 현미경 슬라이드에 올려놓습니다.
      참고: 마이크로웰의 존재는 조직 절편과 파라핀 블록 모두에서 절절 시 육안으로 확인할 수 있습니다(그림 6Aiii,iv). 마이크로몰드 절편 내 오가노이드의 존재는 현미경으로 단절된 슬라이드를 검사하여 확인할 수 있습니다(그림 6Av). 같은 슬라이드에 2–3개의 연속된 구간을 배치하는 대신, 각각 50 μm 간격(즉, 10^번째 구간마다)인 2–3개의 구간을 한 슬라이드에 배치하면 대부분의 오가노이드가 각 슬라이드의 적어도 한 구간에 나타날 확률이 높아집니다. 오가노이드는 조직 절편 내에 일정하게 배치되어 조직학적 염색 후 영상 촬영이 용이해집니다(그림 6Avi).
   10. 슬라이드는 37°C의 오븐에서 하룻밤 말리세요.
   11. 조직학적 또는 면역조직화학 염색을 진행하거나 슬라이드를 실온¹⁹에 보관하세요.
2. 분자 응용을 위한 오가노이드 수확
   참고: 배양 후 아가로스 마이크로몰드에서 오가노이드를 제거하여 RNA 또는 단백질 추출을 포함한 다양한 하위 분자생물학 응용 분야에 가공할 수 있습니다.
   1. 아가로스 마이크로몰드가 담긴 플레이트를 약간 각도로 잡고, 피펫으로 아가로스 마이크로몰드 주변의 배지를 제거합니다.
   2. 아가로스 마이크로몰드가 포함된 웰에 상온 PBS 750 μL를 추가합니다.
   3. Graefe 겸자를 사용해 아가로스 미세몰드를 뒤집고 교반하여 오가노이드를 주변 PBS로 방출합니다. 현미경으로 아가로스 마이크로몰드에서 오르가노이드가 방출되는지 확인하세요.
   4. 그라페 겸자를 사용해 빈 아가로스 마이크로몰드를 제거하고, 오가노이드가 포함된 PBS를 피펫팅으로 미세원심분리관으로 옮깁니다.
   5. 오르가노이드를 10,000 × g에서 원심분리하여 실온에서 5분간 알렛으로 분포합니다.
   6. 흡인하여 상정액을 제거하고 RNA 또는 단백질 추출을 진행합니다. 또는 세포 펠릿을 급속 냉동하여 -80 °C¹⁹에서 보관할 수도 있습니다.
3. 분석을 위한 오가노이드 조건 매지 저장
   참고: 오가노이드에서 나온 조건화된 배지는 호르몬, 사이토카인, 성장 인자 등 오가노이드 분비 인자 분석에 대비해 배양 전반에 걸쳐 보관할 수 있습니다. 오가노이드 조건 배지에서 사이토카인 분석의 대표적인 결과는 그림 7A에 나와 있습니다.
   1. 아가로스 마이크로몰드가 담긴 플레이트를 약간 각도로 들고 피펫으로 마이크로몰드 주변의 조절된 배지를 제거합니다. 세포 시딩 챔버에서 배지를 제거하지 말아 오가노이드를 교란하지 않도록 하세요.
   2. 조절된 매체를 마이크로 원심분리관으로 옮긴 후 매체 분석 또는 급속 냉동 후 -80 °C^19,22에서 보관합니다.
      참고: 선택적으로 10,000 × g 에서 5분간 원심분리하여 죽은 세포나 이물질을 제거하세요. 상청액을 새로운 미세원심분리관으로 옮기고 매체 분석 또는 저장 전에 사용하세요.
4. 오르가노이드 공동 배양
   참고: 난소 체세포 오가노이드는 여러 방법으로 다른 세포 및 조직과 공동 배양할 수 있습니다. 5.4.1 및 5.4.3 단계에 설명된 방법에 따른 난소암 세포 및 난포와의 오가노이드 공동 배양 결과를 대표적으로 보았다. 그림 7B,C.
   1. 1차 마우스 난소 체세포와 다른 세포 유형을 조합하여 직접 세포 간 상호작용의 효과를 조사하기 위해 5.4.1.1–5.4.1.4 단계를 따르세요.
      1. 4.1–4.9 단계를 따라 2D 배양 후 1차 난소 체세포를 하룻밤 세척하고, 0.05% 트립신을 사용해 2D 배양에서 세포를 채취한 후 세포를 카운트, 카운트, 그리고 75 μL 배지당 2.5 × 10⁵ 개의 생세포 밀도로 난소 오가노이드 배지를 재현탁합니다.
      2. 다른 관심 세포 유형이 이관된다면, 2D 배양에서 세포를 채취하세요. 세포를 세고 원심분리로 펠릿으로 투여한 후, 75 μL의 배지당 2.5 × 10⁵ 개의 생세포 밀도로 난소 오가노이드 배지에 재현탁합니다.
      3. 원차 난소 체세포의 현탁과 관심 있는 다른 세포 유형의 현탁을 알려진 비율로 결합합니다.
      4. 4.10–4.13 단계를 따라 생성된 세포 현탁물을 아가로스 미세몰드 및 오가노이드 배양에 시딩합니다.
   2. 형성된 오가노이드를 포함한 아가로스 마이크로몰드를 다른 세포나 오르가노이드가 포함된 24웰 플레이트로 옮기려면, 5.4.2.1–5.4.2.4 단계를 따라 이동하세요.
      참고: 오가로이드 유래 분비 인자가 다른 세포 유형에 미치는 영향을 평가하기 위해, 형성된 오가로이드는 아가로스 마이크로몰드 내에 남아 있을 수 있으며, 전체 아가로스 마이크로몰드는 다른 세포나 오가노이드가 포함된 24웰 플레이트로 옮길 수 있습니다. 이러한 공동 배양 방법은 난소 오가노이드 배지를 사용하여 세포/조직 유형 모두를 배양할 때 활용될 수 있습니다.
      1. 난소 오가노이드 배지를 37°C까지 물에 넣어 가열하세요.
      2. 아가로스 마이크로몰드가 담긴 플레이트를 각도를 잡고 피펫팅으로 아가로스 마이크로몰드 주변의 매체를 제거합니다.
      3. Graefe 겸자를 사용해 마이크로몰드를 다른 세포나 오가노이드가 포함된 24웰 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다.
      4. 아가로스 마이크로몰드 주변에 신선한 난소 오가노이드 배지 750 μL을 추가합니다.
   3. 아가로스 마이크로몰드에서 형성된 오가노이드를 제거하여 새로운 아가로스 마이크로몰드로 옮기려면 5.4.3.1–5.4.3.13 단계를 따릅니다.
      참고: 난소 오가노이드 배지가 공동 배양 실험에 적합한 배지가 아니라면, 5.4.2단계에서 설명한 패러다임은 진공당 마이크로몰드가 난소 오가노이드 배지로 포화되어 있어 배지 전이가 상당히 이어지는 문제를 제기합니다. 형성된 오가노이드(초기 세포 시딩 후 1-3일 후)는 아가로스 마이크로몰드에서 옮겨져 추가 배양 또는 공동 배양을 위해 새로운 아가로스 마이크로몰드로 옮길 수 있으며, 이를 통해 배지 이월을 방지합니다.
      1. 공동 배양에 필요한 배지를 37°C로 물욕에서 데웁니다.
         참고: DMEM, αMEM, F12 기반 배지는 난소 체세포 오가노이드와의 공동 배양 실험에 성공적으로 사용되었습니다.
      2. Graefe 겸자를 사용해 PBS +1% PS에서 새로운 아가로스 마이크로몰드를 24웰 플레이트의 웰로 조심스럽게 옮겨 다른 세포나 오가노이드를 포함해 공동 배양합니다.
      3. 마이크로몰드는 배지에 완전히 잠겨 있어야 하며, 필요에 따라 공동 배양용 추가 배지를 추가하고, 최소 30분간 인큐베이터(가습 환경, 37°C, 5%_CO2)에서 최소 30분간 평형을 맞추세요.
      4. 형성된 오가노이드가 포함된 아가로스 마이크로몰드가 담긴 플레이트를 약간 각도로 잡고, 피펫팅으로 아가로스 마이크로몰드 주변의 배지를 제거합니다.
      5. 형성된 오가노이드와 함께 아가로스 마이크로몰드 주변에 공동 배양을 위한 원하는 배지를 추가합니다.
      6. Graefe 겸자를 사용해 아가로스 마이크로몰드를 뒤집고 저어주어 오가노이드를 주변 배지로 방출합니다. 현미경으로 아가로스 미세몰드에서 오가노이드 방출을 확인하라.
         참고: 1차 난소 체세포가 충분히 집결하지 않은 경우, 아가로스 마이크로몰드에서 제거했을 때 오가노이드가 온전하지 않을 수 있습니다. 오가노이드 조립은 난소 체세포가 분리된 쥐의 계통과 나이에 따라 1일에서 3일이 걸릴 수 있습니다.
      7. 빈 아가로스 마이크로몰드는 Graefe 겸자로 제거하고, 오르가노이드가 포함된 배지를 피펫으로 미세원심분리관으로 옮깁니다.
      8. 오가노이드를 300 × g 에서 실온에서 5분간 원심분리하세요.
      9. 해부 현미경 아래에서 피펫으로 상정액을 제거하며, 오가노이드가 포함된 50–75 μL의 배지를 남깁니다.
      10. 인큐베이터에서 평형 마이크로몰드를 제거하고, 세포 씨앗 챔버가 위를 향하도록 마이크로몰드가 정렬되도록 하세요.
      11. Graefe 겸자나 피펫으로 세포 시딩 챔버에서 배지를 제거하세요.
          참고: 웰에는 500 μL 이상의 배지를 포함하지 않아야 하며, 이를 통해 마이크로몰드의 세포 시딩 챔버를 비울 수 있습니다.
      12. 각 새로운 아가로스 마이크로몰드의 세포 시딩 챔버로 오가노이드를 직접 피펫팅하여 옮깁니다. 24웰 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣으세요.
      13. 1–2시간 후에는 아가로스 마이크로몰드 외부 주변에 원하는 배지를 추가로 250 μL을 추가하며, 세포 씨앗 챔버를 방해하지 않도록 주의합니다.

그림 6: 난소 주요 세포 유형이 난소 체세포 오가노이드에 보존됩니다. (A) (i) 배양 말단 미세몰드로 아가로스를 밀봉하는 모습, (ii) 절단되지 않은 미세몰드, (iii) 파라핀 블록에 박힌 절판 미세몰드의 대표 이미지. 마이크로웰은 (iv) 장착된 절면으로 시각화할 수 있으며, 단면화된 마이크로몰드 내 오가노이드의 존재는 (v) 조직학적 염색 전에 현미경으로 확인할 수 있습니다. (B) Vimentin, F4/80, Foxl2, 3β-HSD에 대한 항체를 이용한 면역조직화학적 염색 후 마우스 난소 조직 절편 및 난소 체세포 절편의 대표 이미지. 스케일 바 = 20 μm. 약어: H&E = 헤마톡실린과 에오신. 이 그림은 Dipali 등(¹⁹)의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 7: 난소 체성 오가노이드와 난포 및 난소암 세포의 공동 배양. (A) 오가로스 마이크로몰드 1개에서 오가로스 마이크로몰드 5일째에 오가로스 미소몰드 분비량을 측정하였으며, 오가로이드가 없는 아가로스 마이크로몰드에서 조건화된 배지로 정규화하였다. N = 4개의 아가로스 마이크로몰드. (B) 배양 0일, 4일, 8일에 난소 난포의 대표적 빛 투과 영상(대조군 유무 여부 포함) 및 (i) 공동 배양 패러다임의 도식. 스케일 바 = 400 μm. (ii) 난포 생존률과 (iii) 8일간의 배양 내 성장(대조군 오가노이드 유무 포함)의 정량화. 데이터는 평균± 표준편당수로 표시됩니다. 일부 오차 표시는 시각화하기에는 너무 작습니다. N = 그룹당 56개의 난포. **P < 0.01. (C) 배양 1일, 3일, 5일째에 적색 형광 단백질 태그 난소암세포(OVCAR8-RFP)와 10:1 비율로 배양한 원발성 난소 체세포의 대표성 투과광(상단) 및 형광(하단) 이미지. 스케일 바 = 400 μm. 약어: RFP = 적색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

6. 문제 해결 팁

1. 문제 1: 분리된 원발 난소 체세포의 수가 예상보다 적습니다.
   참고: 효소 소화 후 난소 조직 조각이 지속적으로 1mm 미만이거나 눈에 보이지 않는 경우, 과소화로 인한 생존 능력 저하로 인해 분리된 세포 수가 낮을 수 있습니다. 효소 소화 후 난소 조직 조각이 1 mm를 초과하면 난소 조직의 소화가 부족해 분리된 세포 수가 낮을 수 있습니다.
   1. 효소 소화 후 난소 조직 조각이 1mm를 초과하면 6.1.1.1–6.1.1.2 단계를 따릅니다.
      1. 콜라겐제 IV와 DNase I이 권장 유통기한 내에 있으며, 부적절한 저장이나 DNase I의 경우 반복적인 동결-해동 주기로 인해 효소 활성 손실이 없음을 확인하세요.
      2. 난소 조직의 반복 피펫팅 횟수를 늘리고, p1000 팁을 더 넓게 절단했다면 보어 크기를 줄이거나, 전자기구에서 적발 시간을 늘리세요.
   2. 효소 소화 후 난소 조직 조각이 지속적으로 1mm 미만일 경우, 난소 조직의 반복 피펫팅 횟수를 줄이고, p1000 팁의 구멍 크기를 넓게 절단하여 확장하며, EM 내 총 인큐베이션 수를 줄이세요.
2. 문제 2: 주조 아가로스 마이크로몰드의 ~25% 이상이 결함을 가지고 있습니다
   1. 실리콘 캐스트에 잔류 아가로스나 이물질이 없는지 확인하세요. 필요하다면 실리콘 캐스트를 PBS로 세척한 후 오토클레이빙으로 다시 살균하세요. 필요하다면 주조에 사용되는 1% 아가로스를 다시 가열하세요. 고체화되는 아가로스는 실리콘 주형을 균일하게 채우지 못하거나 기포가 생길 수 있습니다.
   2. 실리콘 주형에 피펫으로 삽입한 후에는 아가로스가 완전히 고체되도록 두세요. 아가로스 마이크로몰드를 조기 제거하면 마이크로웰이 손상될 수 있습니다.
   3. 실리콘 주형이 과도하게 충전되어 있지 않은지 확인하세요. 그렇지 않으면 아가로스 마이크로몰드의 구조적 완전성이 저하되어 실리콘을 굽혀 아가로스 마이크로몰드를 제거할 때 손상이 발생할 수 있습니다.
   4. 또한, 실리콘 캐스트의 제조사는 오토클레이브를 최대 12회 이상 사용하지 않을 것을 권장합니다. 실리콘 캐스트가 과도한 멸균을 거쳤다면 교체하세요.
3. 문제 3: 마이크로웰의 10% 이상에서 오르가노이드가 형성되지 않음
   1. 아가로스 마이크로몰드를 주조할 때 실리콘 캐스트가 과도하게 채워지지 않는지 확인하세요. 그렇지 않으면 세포가 불규칙하게 마이크로웰로 분포되어 아가로스 마이크로몰드 내 중앙 마이크로웰이 외부 마이크로웰보다 우선할 수 있습니다.
   2. 아가로스 마이크로몰드의 세포 씨앗 챔버에 세포 현탁액을 분사할 때 기포를 발생시키지 마세요. 기포는 마이크로웰 내 세포 분포를 방해할 수 있습니다.
   3. 필요하다면 각 마이크로몰드당 75 μL 이상의 세포 현탁액(1mL당 3.33 × 10^6개 생전지 밀도)으로 시작하여 피펫 팁 부피 부족으로 기포가 발생하지 않도록 합니다.
   4. 세포 씨앗 투여와 아가로스 마이크로몰드 외부에 난소 오가노이드 배지를 추가하는 간격을 늘려 세포가 마이크로웰에 침착할 충분한 시간을 확보합니다.

결과

난소 체세포 오가노이드의 세포 구성을 규명하기 위해, 주요 난소 세포 유형에 대한 항체를 이용해 6일간 배양 후 오가노이드 조직 절편의 면역조직화학을 수행하였습니다. 오르가노이드는 비멘틴 양성 섬유아세포, F4/80 양성 대식세포, 그리고 스테로이도생성 세포 집단을 포함하고 있다(그림 6B)¹⁹. 우리는 Foxl2에 대한 항체를 이용해 과립구와 과립구-루테인 세포를 표시하고, 3β-HSD에 대한 항체를 이용해 테카 세포, 테카-루테인 세포, 스테로이도생 섬유아세포를 표지하였습니다. 난소 체세포 오가노이드는 Foxl2 양성 세포와 3β-HSD 양성 세포를 모두 포함하고 있습니다(그림 6B)¹⁹. 흥미롭게도, F4/80 대식세포와 3β-HSD 양성 스테로이도제닉 세포는 공간적으로 뚜...

토론

이 논문은 난소 체세포의 이질성을 유지하면서 기질이 풍부한 난소 분획에서 1차 마우스 난소 체세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 1차 마우스 난소 체세포는 2D 단층 배양할 수 있으며, 스캐폴드 없는 아가로스 마이크로몰드를 이용해 난소 체세포 오가노이드를 생성하는 데 활용될 수 있습니다. 아가로스 마이크로몰드는 오가노이드 형성을 위한 96개의 마이크로웰을 포함하고 있으며, 24웰 플레이트의 단일 웰에 맞춰 고처리량으로 일정한 크기의 오가노이드를 많이 생성할 수 있는 방법입니다. 더불어, 아가로스 마이크로몰드는 배지 교환, 영상 촬영, 그리고 후속 조직학적 응용이 용이합니다. 난소 체세포는 세포 시딩(seeding) 후 1–3일 이내에 오가노이드를 형성하며, 오가노이드는 섬유아세포, 대식세포, 스테로이도생성 세포 등 주요 난소 세포 유형을 6일 이상 배양 내에 보존합니다. 세포 집단은 공간적으로 뚜렷한 조직을 보이며, F4/80 양성 대식세포와 절단된 카스파제-3 양성 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 μm, Polyethersulfone syringe filter	Corning	431229
1.5 mL microcentrifuge tubes	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL glass beaker	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petri dishes	Corning	351029
15 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	339651
24-well plates (TC-treated)	Corning	353047
28-gauge insulin needles	Exel International	26027
35 mm Petri dishes	Corning	351008
3β-HSD antibody	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm cell strainer	Corning	431750
45 mm watch glass	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL concial tubes	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile syringe	Air-Tite	ML60
60 mm TC-treated plates	Corning	353037
6-well plates (TC-treated)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
Autoclave sterilization pouch	Fisherbrand	01-812-55
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Bluing reagent	Fisherbrand	23-245681
Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Class II biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Collagenase, Type IV, powder	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissecting microscissors	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissecting scissors	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissection microscope	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 antibody	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fine-tipped dissecting forceps	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 antibody	Abcam	ab246511	1:200
Graefe Forceps	Fine Science Tools	1105010
Hematoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocytometer	MedOne	DHCN015
Imaging System	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
Laminar flow hood	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Microscope slides	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
Modified Davidson's Fixative	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP cells			Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago 선물
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Red staining solution	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tabletop centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin antibody	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides	Gibco, Fisher Scientific	32561102