Method Article

초파리 복안의 고해상도 Z-스택 영상을 위한 테이프 마운팅 프로토콜

DOI:

10.3791/71043

⸱

April 3rd, 2026

 ,  , 
1Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 주요 목표는 초파리 복합안의 비파괴 영상 및 정량적 분석을 가능하게 하는 것입니다. 이 기술은 테이프 마운팅 전략과 입체 현미경 Z-스택 획득 및 확장 초점 심도 재구성을 결합하여 고해상도, 아티팩트 없는 이미지를 생성합니다.

Abstract

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여기서는 초파리 복합안의 고해상도 표현형 분석을 위한 비파괴적 장착 및 영상 프로토콜을 제시합니다. 초파리 복합 눈의 정확한 표현형 분석은 볼록한 기하학적 특성과 취급 시 기계적 취약성으로 인해 종종 제한됩니다. 이를 해결하기 위해, 다방면에서 고해상도 시각화를 가능하게 하는 다목적 비침습적 영상 워크플로우를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 거꾸로 된 테이프 플랫폼에 맞춤형 접착 장착 전략을 사용하여, 머리는 완전히 건드리지 않고 몸통과 날개를 고정합니다. 무엇보다도, 이 유연한 구성은 각각의 부착 방향을 지지합니다: 개별 눈의 완전한 볼록함을 포착하는 측면 위치와 머리 전체의 대칭을 평가하는 정면 위치입니다. 이 방법은 또한 고밀도 배열의 배열을 용이하게 하여 세션당 20–30개의 샘플을 빠르게 처리할 수 있게 합니다. 반사광 입체현미경과 Z-스택 획득 및 확장 초점 심도(EDF) 재구성을 통합함으로써, 워크플로우는 균일하게 선명한 준3차원 합성 이미지를 생성합니다. 이 접근법은 자연 색소를 보존하고, 정량적 장기 규모 표현형 분석에 적합한 고화질, 대조가 풍부한 이미지를 생성합니다.

Introduction

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초파리 흑위성 복합안은 발달 중 장기 성장, 패턴 형성, 견고함을 연구하는 고전적이고 강력한 모델입니다. 약 800개의 고도로 질서화된 옴마티디아로 구성된 파리 눈은 증식, 분화 및 조직 조직에 영향을 미치는 유전적 교란을 민감하고 정량적으로 측정할 수 있게 제공합니다 1,2,3. 눈 발달의 유전적 조작은 역사적으로 보존된 신호 전달 경로에 대한 근본적인 통찰을 제공해 왔습니다. 획기적인 연구들은 전사 인자의 눈 없는 자궁 발현만으로도 망막 조직에서 눈 형성을 유도하기에 충분함을 보여주었으며, 이는 눈을 장기 특정성과 가소성의 전형으로 확립했다. 이후 연구에서는 D. melanogaster 하마 신호 전달 경로가 증식과 세포자살자사의 조정된 조절을 통해 눈 크기와 세포 수의 중심 조절자임을 확인했습니다 5,6. 동시에 Hedgehog와 BMP 신호 전달은 발달 중인 망막 내....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 샘플 수집 및 동기화

참고: 실험적 비교 가능성을 보장하기 위해 폐쇄 타이밍의 엄격한 제어가 필요합니다. 표준 배양 조건인 25°C에서는 보통 산란 후 10일에서 12일 사이에 폐화가 일어납니다. 번데기 시기에는 번데기가 어두워지면 곧 폐고가 임박했음을 알리므로 주의 깊게 관찰해야 합니다.

  1. 직접 탭핑 방식(표준 방법)
    1. 표준 24 x 95mm 플라스틱 초 파리 배양 바이알(폼 플러그로 밀봉됨)을 부드러운 패드에 부드럽게 두드려 성충 파리를 바닥으로 밀어내세요.
    2. 플러그를 빠르게 제거하고 신선한 채취 바이알의 입구를 배양 바이알과 맞추세요.
    3. 배양 바이알이 위에 있도록 세팅을 뒤바꿔 보세요. 벽을 살짝 두드려 파리를 채취 바이알로 옮기세요.
      참고: 표준 옥수수 가루-한천 먹이가 촉촉한 배지라면 이 방법은 권장하지 않으며, 새로 닫힌 파리는 쉽게 포획되어 죽을 수 있습니다. 사망률을 최소화하기 위해 처음에는 빈 24 x 95mm 바이알에 파리를 채취하세요. 마취 후(3단계) 파리를 24 x 95mm 크기의 신선한 배지가 담긴 바이알의 내벽에 옮깁니다.

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Results

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샘플 채취부터 이미지 획득까지의 전체 실험 파이프라인은 그림 1에 요약되어 있습니다. 수정된 프로토콜의 효율성은 고밀도 샘플 배열 생성을 통해 입증됩니다. 그림 2A에 보시다시피, 마취된 플라이 20–30마리를 하나의 역테이프 플랫폼 위에 격자 형태로 배열할 수 있습니다. 테이프의 비접착 끝에 적힌 방향 표시는 일관된 헤드 방향성을 보장하여, 최소한의 스테이지 조정으로 빠르고 체계적인 영상 촬영을 가능하게 합니다. 무엇보다도, 이 방법은 고정 과정을 표준화하여 야생형 및 돌연변이 표현형의 재현 가능한 영상을 위한 고밀도 배열의 신속한 생성이 가능해진다. 성공적인 준비 과정은 변형이나 광학 흐림 없이 곡선 망막 표면 전체에 걸쳐 균일하게 선명한 이미지를 생성합니다.

이 전략은 두 가지 뚜렷한 방향에서 안정적인 고정을.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

초파리 복합안은 유전적 선별을 위한 강력한 표현형 판독 역할을 하며, 눈 크기, 거칠기, 색소침착 2,3,8의 관찰 가능한 변화는 종종 Hippo 5,6이나 Hedgehog7과 같은 기본 신호 경로의 교란을 나타냅니다. 하지만 이러한 스크린의 효율성은 오랫동안 전통적인 영상 워크플로우의 한계로 인해 병목 상태에 걸려 왔습니다. 이전의 고정 기법들은 보통 핀셋을 이용한 수동 위치 조정이나 영구 접착을 포함하며, 이는 노동 집약적이고 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 분석 대상 구조물을 손상시킬 위험도 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 맞춤형 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국가자연과학기금(32071135)의 후원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
이산화탄소(CO2) 가스 실린더현지 공급업체해당 없음
CO2 마취용 블로우건T& LDG-08
디지털 현미경 카메라라이카DMC6200
좋은 핀셋베투스MOS-167B
폼 플러그동팽해당 없음
이미지 획득 소프트웨어 (LAS X)라이카3.7.1
이미지 처리 소프트웨어 (FIJI/ImageJ)NIH오픈 소스
LED 돔 조명기라이카LED5000 HDI
LED 구스넥 조명기코스심LG-10
모터 입체 현미경라이카M205 FCA
대물 렌즈라이카1.0x PlanApo NA0.2
공압식 발 페달 밸브델릭시FV-320
표준 초파리 배양 바이알라이보어2424951
표준 초파리 먹이 배지해당 없음옥수수 가루-천가-당밀
표준 유리 현미경 슬라이드시토테스트10127101P-G
표준 입체 현미경니콘SMZ745
흰 종이 마스킹 테이프우윈폭 25mm

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