초파리 복안의 고해상도 Z-스택 영상을 위한 테이프 마운팅 프로토콜

Summary

이 프로토콜의 주요 목표는 초파리 복합안의 비파괴 영상 및 정량적 분석을 가능하게 하는 것입니다. 이 기술은 테이프 마운팅 전략과 입체 현미경 Z-스택 획득 및 확장 초점 심도 재구성을 결합하여 고해상도, 아티팩트 없는 이미지를 생성합니다.

Abstract

여기서는 초파리 복합안의 고해상도 표현형 분석을 위한 비파괴적 장착 및 영상 프로토콜을 제시합니다. 초파리 복합 눈의 정확한 표현형 분석은 볼록한 기하학적 특성과 취급 시 기계적 취약성으로 인해 종종 제한됩니다. 이를 해결하기 위해, 다방면에서 고해상도 시각화를 가능하게 하는 다목적 비침습적 영상 워크플로우를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 거꾸로 된 테이프 플랫폼에 맞춤형 접착 장착 전략을 사용하여, 머리는 완전히 건드리지 않고 몸통과 날개를 고정합니다. 무엇보다도, 이 유연한 구성은 각각의 부착 방향을 지지합니다: 개별 눈의 완전한 볼록함을 포착하는 측면 위치와 머리 전체의 대칭을 평가하는 정면 위치입니다. 이 방법은 또한 고밀도 배열의 배열을 용이하게 하여 세션당 20–30개의 샘플을 빠르게 처리할 수 있게 합니다. 반사광 입체현미경과 Z-스택 획득 및 확장 초점 심도(EDF) 재구성을 통합함으로써, 워크플로우는 균일하게 선명한 준3차원 합성 이미지를 생성합니다. 이 접근법은 자연 색소를 보존하고, 정량적 장기 규모 표현형 분석에 적합한 고화질, 대조가 풍부한 이미지를 생성합니다.

Introduction

초파리 흑위성 복합안은 발달 중 장기 성장, 패턴 형성, 견고함을 연구하는 고전적이고 강력한 모델입니다. 약 800개의 고도로 질서화된 옴마티디아로 구성된 파리 눈은 증식, 분화 및 조직 조직에 영향을 미치는 유전적 교란을 민감하고 정량적으로 측정할 수 있게 제공합니다 ^1,2,3. 눈 발달의 유전적 조작은 역사적으로 보존된 신호 전달 경로에 대한 근본적인 통찰을 제공해 왔습니다. 획기적인 연구들은 전사 인자의 눈 없는 자궁 발현만으로도 망막 조직에서 눈 형성을 유도하기에 충분함을 보여주었으며, 이는 눈을 장기 특정성과 가^소성의 전형으로 확립했다. 이후 연구에서는 D. melanogaster 하마 신호 전달 경로가 증식과 세포자살자사의 조정된 조절을 통해 눈 크기와 세포 수의 중심 조절자임을 확인했습니다 ^5,6. 동시에 Hedgehog와 BMP 신호 전달은 발달 중인 망막 내에서 형태발생 진행, 성장 정밀도 및 공간 패턴을 조절하는 것으로 나타났습니다 ^7,8.

그러나 성인 복합안의 고해상도 이미지를 촬영하는 것은 볼록하고 반구형인 형상 때문에 상당한 시각적 도전이 있습니다. 표준 밝시야 현미경은 얕은 피사계 심도에 제한되어 있어 단일 노출 9에서 눈의 가장 등쪽 끝(극)과 가장자리 가장자리(적도)에 동시에 초점을 맞추는 것이 불^{가능합니다.} 이러한 한계는 망막 표면의 상당 부분이 흐릿하게 보이는 이미지를 자주 만들어, 고해상도 이미지 분석과 변색된 표현형을 정량화하는 머신러닝 도구의 적용을 방해합니다. 망막 표면을 완전히 특성화하려면 전체 곡률을 광학 아티팩트 없이 시각화해야 합니다. 따라서 원래의 눈 형태를 보존하면서도 전체 곡선 망막 표면의 고해상도 시각화가 가능한 영상 방법이 필요합니다.

더불어, 기존의 현미경 샘플 준비 방법은 플라이 헤드의 구조적 무결성을 자주 저해합니다. 기존의 장착 기술은 표면 세부를 가릴 수 있는 접착제를 사용하거나, 핀셋으로 머리 캡슐에 압력을 가하는 물리적 조작을 자주 사용합니다. 망막 형태형성 연구에서 언급하듯, 눈의 구조적 완전성이 가장 중요합니다. 직접적인 압력이나 천공은 혈림프 누출을 일으켜 내부 압력 손실과 그 결과 안구 표면이 붕괴되거나 '찌그러짐'을 일으킵니다. 이러한 기계적 인공물은 신경퇴행성 표현형이나 유전적 결함을 모방하여 대규모 스크리닝에서 위양성 결과를 초래할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 온전한 초파리 복안의 고해상도 시각화를 위한 비파괴적 장착 및 영상 워크플로우를 제공하는 것입니다.

여기서는 머리와 직접 접촉하지 않고도 온전한 초파리 복안과 머리 전체 형태를 고해상도로 시각화할 수 있는 빠르고 재현 가능한 영상 워크플로우를 제시합니다. 이 방법에서는 성충 파리를 유연한 접착 장착 전략으로 몸과 날개를 고정하여 측면 방향(한쪽 눈의 전체 곡률을 포착)이나 전면 방향(전면 방향)에서 안정적으로 위치를 확보하여 전체 머리 대칭과 안간 특징을 평가합니다. 이 다목적 장착 전략은 기계적 손상을 최소화하고 3차원에서 원래의 눈 기하학을 보존합니다. 반사광 입체현미경, Z-스택 획득, 확장 초점 심도 재구성⁹와 결합하면, 이 접근법은 여러 관점에서 균일하게 선명하고 고품질의 이미지를 생성하여 정성적 검사와 정량적 표현형 분석 모두에 적합합니다. 이 방법은 특히 초파리의 유전적 교란, 발달 표현형 연구, 그리고 고처리량 눈 형태 스크리닝 연구에 적합합니다.

Protocol

1. 샘플 수집 및 동기화

참고: 실험적 비교 가능성을 보장하기 위해 폐쇄 타이밍의 엄격한 제어가 필요합니다. 표준 배양 조건인 25°C에서는 보통 산란 후 10일에서 12일 사이에 폐화가 일어납니다. 번데기 시기에는 번데기가 어두워지면 곧 폐고가 임박했음을 알리므로 주의 깊게 관찰해야 합니다.

1. 직접 탭핑 방식(표준 방법)
   1. 표준 24 x 95mm 플라스틱 초 파리 배양 바이알(폼 플러그로 밀봉됨)을 부드러운 패드에 부드럽게 두드려 성충 파리를 바닥으로 밀어내세요.
   2. 플러그를 빠르게 제거하고 신선한 채취 바이알의 입구를 배양 바이알과 맞추세요.
   3. 배양 바이알이 위에 있도록 세팅을 뒤바꿔 보세요. 벽을 살짝 두드려 파리를 채취 바이알로 옮기세요.
      참고: 표준 옥수수 가루-한천 먹이가 촉촉한 배지라면 이 방법은 권장하지 않으며, 새로 닫힌 파리는 쉽게 포획되어 죽을 수 있습니다. 사망률을 최소화하기 위해 처음에는 빈 24 x 95mm 바이알에 파리를 채취하세요. 마취 후(3단계) 파리를 24 x 95mm 크기의 신선한 배지가 담긴 바이알의 내벽에 옮깁니다.
2. 음의 지오택시 전달법(부착 방지 방법)
   1. 신선한 채취 바이알에서 플러그를 빼서 벤치 위에 뒤집어 파리가 들어오지 않도록 하세요.
   2. 배양 바이알을 입구가 아래를 향하게 잡으세요. 파리는 먹이 쪽으로 올라가 구멍에서 멀어집니다.
   3. 입구에 파리가 없어지면 빠르게 배양 바이알의 마개를 뽑아 벤치 위에 있는 뒤집힌 빈 24 x 95 mm 채취 바이알과 정렬하세요.
   4. 연결 지점을 작업대에 살짝 두드려 파리를 채취 바이알에 넣으세요.
      참고: 이 방법은 음식 부착으로 인한 사망률을 크게 줄이지만, 직접 탭핑보다 시간이 더 많이 소요됩니다.
3. CO₂ 마취법 (고효율 방법)
   1. 배양 바이알을 뒤집어 플러그가 아래를 향하게 하세요.
   2. CO₂ 마취기 바늘을 플러그와 바이알 벽 사이에 조심스럽게 꽂으세요.
   3. 풋 페달과 핸드 밸브를 부드럽게 작동시켜 100% CO₂를 낮고 부드러운 유량으로 방출하세요.
   4. 파리가 마취되어 플러그 위에 떨어지면, 배양 바이알을 수평으로 놓으세요. 플러그를 제거하고, 빈 채취 바이알과 정렬한 뒤, 배양 바이알을 부드럽게 두드려 마취된 파리를 채취 바이알로 옮기세요.
      참고: 과도한 공기 흐름은 파리를 음식 표면에 날려 부착과 사망을 일으킬 수 있습니다; 파리를 물리적으로 밀어내지 않도록 마취할 수 있을 만큼 부드러운_CO2 흐름을 엄격히 유지하세요. 모니터 플라이는 날개와 다리의 미세한 경련이나 움직임 등 초기 회복 징후를 가까이에서 관찰합니다.
4. 라벨링 및 유지보수
   1. 채취 바이알에 성별, 채취일, 폐쇄일, 유전자형, 배양 조건을 라벨링하세요.
   2. 성별 분리: 영상 촬영이 10일 이상 된 경우, 교미와 F2 세대의 출현을 막기 위해 수컷과 암컷을 서로 다른 식품 배양 바이알에 분리하여 실험 환경에 방해를 줄 수 있습니다.
      참고: 파리는 이전 배양 조건(예: 25 °C)에서 원하는 영상 촬영 연령에 도달할 때까지 이 식품 함유 바이알에 보관할 수 있습니다.

2. 장착판 준비

1. 깨끗한 표준 유리 현미경 슬라이드를 확보하세요.
2. 슬라이드보다 약 2cm 더 긴 흰색 마스킹 테이프 조각을 잘라냅니다.
3. 테이프를 슬라이드 위에 붙이고, 접착면이 위를 향하게 하세요(비접착 면은 유리에 닿게 합니다). 테이프가 양쪽 끝에서 슬라이드 위로 약 1cm 정도 돌출되도록 하세요.
4. 슬라이드 뒷면에 ~5mm 길이의 테이프 두 개를 단단히 감아 돌출 끝을 고정합니다.
5. 접착 표면이 평평하고 팽팽하며 주름이 없는지 확인하세요.
6. 라벨링: 테이프의 비접착 끝에 방향 표시기(예: "Top/Up" 및 "Bottom/Down")나 샘플 식별자를 표시하여 현미경 하에서 방향 확인과 추적을 용이하게 합니다.
   참고: 영상 촬영용 파리를 선택할 때는 체격 차이가 큰 개체를 피하십시오. 동일한 배율을 사용해도 체격 차이로 인해 복합 눈 표면적이 비교 불가능해질 수 있습니다.

3. 안락사와 마구

1. 안락사
   1. 파리를 밀봉된 빈 채취 바이알에 옮기세요.
   2. 밀봉된 바이알을 -80 °C 냉동고에 15–20분간 보관하세요.
      주의: 가는 핀셋의 날카로운 끝으로 플라이를 찔리거나 꽉 쥐지 마세요. 경미한 혈림프 누출도 내부 정수압을 급격히 잃게 하여 즉각적인 움푹 들어간 곳과 복합안구의 돌이킬 수 없는 붕괴를 초래하여 영상 품질을 저하시킵니다.
2. 측면 시야를 위한 장착 (단일 복합 눈)
   1. 위치 선정: 표준 입체 현미경(예: 니콘 SMZ745) 아래에서 미세 핀셋을 사용해 안락사된 파리를 옆으로 누운 자세로 정렬합니다.
   2. 전달: 가늘한 핀셋을 사용해 날개를 부드럽게 잡아 (측면 자세를 유지하며) 준비된 접착 장착판으로 옮깁니다.
   3. 고정: 파리 몸통 한쪽을 붙이는 테이프에 붙입니다. 날개를 펼쳐서 테이프에 평평하게 붙여서 안정성을 높이세요.
   4. 부속지 관리: 장착 시 다리가 복합안을 가리지 않도록 주의하세요. 앞다리가 시야를 가릴 경우, 핀셋을 사용해 눈에서 조심스럽게 떼어내고 테이프에 단단히 붙이세요(예: 아래로 뻗거나 가슴 아래에 넣는 식).
   5. 고정: 핀셋을 기울이고 끝 부분(뾰족한 끝이 아님)으로 몸체를 테이프에 부드럽게 눌러 고정을 확실히 하세요.
   6. 미세 조정: 헤드가 수평인지 확인하세요. 눈이 단일 초점면에 있지 않다면, 핀셋을 사용해 몸의 각도를 미세하게 조절하세요.
3. 정면 모습 장착 (전체 머리)
   1. 자세: 마취 패드 위에서 플라이를 배 쪽이 아래(엎드려) 자세로 맞추세요.
   2. 옮기기: 핀셋으로 한쪽 날개를 잡고 플라이를 들어 올립니다. 접착 장착판으로 옮기세요.
   3. 초기 고정: 양쪽 날개를 부드럽게 바깥쪽(좌우)으로 펼치고 접착 표면에 단단히 눌러 플라이를 고정합니다.
   4. 신체 안정화: 접착판과 완전히 접촉하도록 흉부를 부드럽게 눌러주세요. 핀셋으로 뒤쪽 복부(꼬리)를 가볍게 잡고 부드럽게 당겨 몸축을 곧게 펴고 복부를 테이프에 붙이세요.
   5. 머리 방향: 가는 핀셋을 사용해 머리 각도를 조절하여 전면(면)이 접착 표면과 평행하도록 합니다. 복합 눈 두 개는 평평해야 하며 같은 초점면에서 볼 수 있어야 합니다.
4. 편곡
   1. 접착 표면에 여러 개의 플라이를 평행 행 또는 격자 형태로 배치하세요. 개별 플라이가 겹치지 않도록 Z-스택 간섭을 방지해야 하지만, 처리량을 극대화하기 위해 밀집 배치(예: 슬라이드당 20–30 플라이)는 허용됩니다. 모든 파리의 머리가 같은 방향을 향하도록 정렬하게(2.6단계의 라벨에 표시됨), 체계적인 영상 촬영을 용이하게 합니다.
   2. 같은 코호트에서 온 서로 다른 안락사 파리 세트를 사용하여 측면 및 전면 영상을 촬영할 별도의 샘플 배열을 준비합니다. 플라이가 테이프에 부착되면 안전하게 제거하거나 재배치할 때 시료에 심각한 기계적 손상을 일으킬 수 있습니다; 따라서 동일한 개인의 여러 뷰를 순차적으로 이미징할 수 없습니다.
      참고: 조직 건조를 방지하기 위해 안락사 및 장착 직후 샘플 영상을 찍는 것이 강력히 권장됩니다.

4. 이미지 획득

1. 모터 구동 입체현미경 영상 시스템 시작 및 초기화
   1. PC, 모니터, 현미경 유닛을 순서대로 켜세요.
   2. LAS X 소프트웨어를 실행하세요.
   3. "초기화/자기 테스트" 프롬프트가 뜨면, 목표 아래 공간에 장애물이 없는지 확인하고 확인을 클릭하세요. 현미경이 Z축 보정 전체를 완료하도록 허용하세요.
      참고: 다음 단계는 LAS X 소프트웨어 시스템을 사용하는 입체현미경에 최적화되어 있습니다.
2. 샘플 배치와 조명
   1. 준비된 장착판을 모터 구동 입체 현미경의 기본 플랫폼에 옮기고, 디지털 카메라 대물렌즈 아래 배열의 첫 번째 샘플을 중앙에 위치시키도록 수동으로 조정합니다.
   2. 투과광(베이스)과 입사광(상단) 광원을 켜세요. 복합 눈 촬영에는 주로 반사광을 사용합니다. 조리개를 조절해 균일한 조명을 확보하세요.
3. 소프트웨어 구성
   1. 획득 모드를 Z-스택으로 설정하세요. 프로젝트 설정에서 다차원 이동 우선순위를 'Z-first'로 설정하여 모터 구동이 지속적이고 안정적으로 작동하도록 하세요.
   2. 영상 모드를 반사광으로 설정하세요.
   3. 완전 초점 이미지를 합성하기 위해 확장 초점 심도 (EDF)를 활성화하세요.
   4. 이미지 고급 설정에서 하이 다이내믹 레인지(HDR)를 활성화하세요. 복합안의 고반사성 키틴질 표면으로 인해 흔히 발생하는 스페큘러 하이라이트와 과노출을 완화하는 데 강력히 권장됩니다.
4. 위치 선정과 화이트 밸런스
   1. 배율 노브를 적절한 수준(예: 측면 단일 눈 시점은 16배, 정면 전체 머리 시점은 12.5배 줌)으로 조정하며, 관심 영역이 시야의 절반에서 2/3 정도를 차지하도록 합니다.
   2. 수동으로 장착판을 위치시켜 플라이의 가슴을 시야 중앙으로 끌어당깁니다.
   3. 토락스를 이용해 화이트 밸런스 보정을 수행해 색온도를 보정하세요.
5. 노출 및 영상 매개변수(참조 값)
   노출: 60–80 ms.
   게인: 0–5 (잡음 최소화를 위해 낮게 유지).
   강도: 60%–80%.
   Z-스택 스텝 크기: 표준: 8–12 μm.
   참고: 매끄럽고 건강한 복합안(예: w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4)의 경우, 연속적이고 규칙적인 곡률이 광학 단면을 덜 필요로 하므로 최대 15 μm의 스텝 크기가 충분할 수 있습니다. 그러나 급격한 위상 변화가 특징인 거칠거나 불균일한 눈 표현형의 경우, 미세한 구조적 세부를 포착하고 EDF 재구성 정확도를 크게 향상시키기 위해 5 μm까지 낮은 스텝 사이즈가 필요합니다.
6. Z-스택 정의 및 캡처
   1. 측면 뷰를 위해: 8–12 μm 스텝 크기를 사용하여 궤도 가장자리(시작)에서 중심 옴마티디아(끝)까지 Z-스택 범위를 설정하세요.
   2. 정면 시점에서는: 복합 눈의 외곽 윤곽이 겨우 초점이 맞을 때까지 초점 조절(시작). 초점을 반대 방향으로 조정하여 머리 꼭대기의 중앙 눈(노란색 단순한 눈)이 겨우 초점이 맞을 때까지 조절합니다(끝). Set End를 클릭하세요.
   3. 미리보기를 멈추려면 라이브 중지 를 클릭하세요.
   4. 획득 시작을 클릭하세요. 시스템은 정의된 초점면을 자동으로 캡처하여 고해상도의 완전 초점 이미지를 합성합니다.
7. 파일 저장:
   1. EDF 재구성이 완료되면 소프트웨어 인터페이스에서 저장 아이콘을 클릭하거나 파일 > 다른 이름으로 저장 기능으로 이동하세요.
   2. 목적지 디렉터리를 선택하고 지정된 파일 이름을 입력한 후 저장을 클릭하세요.
   3. 각 획득은 세 개의 서로 다른 이미지 파일을 생성합니다: a. RAW/채널 이미지 (그레이스케일);b. 컬러 미리보기 이미지; c. EDF 합성 이미지 ("_Composite" 접미사 포함)
      참고: RAW/채널 이미지와 EDF 합성 이미지 모두 분석 및 문서화를 위해 보관해야 합니다

Results

샘플 채취부터 이미지 획득까지의 전체 실험 파이프라인은 그림 1에 요약되어 있습니다. 수정된 프로토콜의 효율성은 고밀도 샘플 배열 생성을 통해 입증됩니다. 그림 2A에 보시다시피, 마취된 플라이 20–30마리를 하나의 역테이프 플랫폼 위에 격자 형태로 배열할 수 있습니다. 테이프의 비접착 끝에 적힌 방향 표시는 일관된 헤드 방향성을 보장하여, 최소한의 스테이지 조정으로 빠르고 체계적인 영상 촬영을 가능하게 합니다. 무엇보다도, 이 방법은 고정 과정을 표준화하여 야생형 및 돌연변이 표현형의 재현 가능한 영상을 위한 고밀도 배열의 신속한 생성이 가능해진다. 성공적인 준비 과정은 변형이나 광학 흐림 없이 곡선 망막 표면 전체에 걸쳐 균일하게 선명한 이미지를 생성합니다.

이 전략은 두 가지 뚜렷한 방향에서 안정적인 고정을...

Discussion

초파리 복합안은 유전적 선별을 위한 강력한 표현형 판독 역할을 하며, 눈 크기, 거칠기, 색소침착 ^2,3,8의 관찰 가능한 변화는 종종 Hippo ^5,6이나 Hedgehog⁷과 같은 기본 신호 경로의 교란을 나타냅니다. 하지만 이러한 스크린의 효율성은 오랫동안 전통적인 영상 워크플로우의 한계로 인해 병목 상태에 걸려 왔습니다. 이전의 고정 기법들은 보통 핀셋을 이용한 수동 위치 조정이나 영구 접착을 포함하며, 이는 노동 집약적이고 시간이 많이 걸릴 뿐만 아니라 분석 대상 구조물을 손상시킬 위험도 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 맞춤형 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
이산화탄소(CO2) 가스 실린더	현지 공급업체	해당 없음
CO2 마취용 블로우건	T& L	DG-08
디지털 현미경 카메라	라이카	DMC6200
좋은 핀셋	베투스	MOS-167B
폼 플러그	동팽	해당 없음
이미지 획득 소프트웨어 (LAS X)	라이카	3.7.1
이미지 처리 소프트웨어 (FIJI/ImageJ)	NIH	오픈 소스
LED 돔 조명기	라이카	LED5000 HDI
LED 구스넥 조명기	코스심	LG-10
모터 입체 현미경	라이카	M205 FCA
대물 렌즈	라이카	1.0x PlanApo NA0.2
공압식 발 페달 밸브	델릭시	FV-320
표준 초파리 배양 바이알	라이보어	2424951
표준 초파리 먹이 배지	해당 없음	옥수수 가루-천가-당밀
표준 유리 현미경 슬라이드	시토테스트	10127101P-G
표준 입체 현미경	니콘	SMZ745
흰 종이 마스킹 테이프	우윈	폭 25mm