냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

Summary

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

Abstract

공간 다중옴 기술과 단일 세포 프로파일링의 결합은 복잡한 조직의 분자 및 세포 구조를 밝힐 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다. 최적의 절정 온도(OCT) 냉동 매체에 박힌 조직 블록에서 조제한 개별 냉동절영 내 핵의 공간 바코딩과 단일 세포 다중체 분석법을 결합하여 간단하고 효율적인 워크플로우를 만들어 조직 내 세포에 대한 주석 작성과 공간적으로 분해된 분자 분석을 용이하게 할 수 있습니다. 본 연구는 단일 냉동 뇌 절편에서 히스톤 H3K27ac 변형과 유전자 발현을 동시에 프로파일링하는 공간적 절단 및 표적 및 표지 하 공간 절단(CUT&Tag) 다중옴 접근법을 보고합니다. 공간 바코딩 후에는 단일 핵을 분리하여 CUT&Tag, 태그가 부착된 DNA, RNA, 공간 바코드의 결합 캡처, 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 적용합니다. 이 워크플로우는 동일한 핵에서 공간적으로 주석이 달린 후생유전체 및 전사체 프로필을 생성하여 다중체 정보를 해부학적 좌표에 할당할 수 있게 합니다. 후생유전체 정보와 공간 전사체 데이터를 통합하면 세포 유형 식별의 정밀도가 높아지고, 온전한 조직 내에서 공간적으로 조직된 조절 프로그램과 세포-세포 상호작용이 드러납니다.

Introduction

공간 생물학은 분자, 세포, 조직의 위치, 조직 및 상호작용을 그 원래 환경^내에서 지도화하는 빠르게 발전하는 분야입니다. 1^{, 2, 3}. 조직 해리가 필요하고 위치 정보가 손실되는 대용량 또는 기존의 단일 세포 방법과 달리, 공간적 접근법은 분석물이나 세포/핵의 물리적 좌표를 보존하여 조직 구조가 세포 정체성, 세포 간 소통, 생물학적 기능에 미치는 영향을 직접 조사할 수 있게 합니다 4,5,6,7 . 공간 전사체학과 공간 단백질체학이 현재 가장 널리 채택되는 모달리스이지만, 이 분야는 공간적 다중 오믹 프로파일링으로 빠르게 확장되고 있습니다 ^3,8,9. 동일 조직 내에서 유전자 발현과 후생유전체 상태를 공동 프로파일링하는 것은 특히 강력한데, 이는 전사 출력을 유전자 활동을 조절하는 조절 메커니즘(예: 염색질 접근성 및 히스톤 변형)과 직접 연결하여 공간 영역에 걸쳐 변하는 것으로 알려져 있기 때문입니다 10,11,12. 따라서 통합된 공간 후생유전체 및 전사체 분석은 조절 프로그램이 세포 정체성과 조직 조직을 어떻게 형성하는지에 대한 중요한 통찰을 제공할 것입니다.

동시에 후생유전체와 전사체 프로파일링을 가능하게 하기 위해 여러 공간적 다중체체 전략이 개발되었습니다. 조직 시퀀싱에서의 결정적 바코딩(DBiT-seq)은 마이크로 유체 채널을 사용하여 젤 슬랩으로 스탬핑하여 조직 절면에 공간 바코드를 직접 또는 간접적으로 전달하여 분석물의 공간적 주석을 가능하게 합니다. 이 접근법은 후생유전체 및 전사체 특징 12,13,14,15의 공간적으로 공동 프로파일링을 용이하게 합니다. 슬라이드 태그 방법은 Takara Trekker 플랫폼으로 상업화되었으며, 해리 전에 공간 바코드를 온전한 조직에 직접 도입하여, 공간적으로 인덱싱된 핵을 표준 단일 세포 워크플로우로 처리하고 원래 조직 좌표¹⁶으로 계산적으로 투영할 수 있게 합니다. 반면, 접근 가능한 염색질, 세포 계통, 유전자 발현에 대한 공간 분석법(SPACE-seq)은 공간 전사체체 타일¹⁷에서 poly(A) 꼬리 후생유전적 표적과 mRNA를 poly-dT 포획 서열에 포착하는 타겟아웃 전략을 사용합니다.

표적 및 태그먼트 하 절단(CUT&Tag)은 매우 낮은 입력 샘플에서 DNA와 히스톤 또는 비히스톤 단백질 간 상호작용을 매핑하는 강력한 도구입니다¹⁸. CUT&Tag는 Tn5 전이효소 매개 염색질 단편화와 DNA 태깅(tagmentation)에 의존하며, 항체 유도 단백질 A-접합 Tn5를 이용해 유좌 특이적 절단과 분자 태깅을 수행합니다. 기존 CUT&Tag 분석법은 여러 번의 배큐 및 세척 단계를 포함하지만, 단순화되고 간소화된 CUT&Tag 워크플로우가 활용되어 하위 단일 세포 멀티^{옴 응용 분야에서} CUT&Tag 효율성을 향상시켰습니다.

그림 1: 공간 Trekker–CUT&Tag 멀티옴 분석의 워크플로우 및 품질 관리 개요. (A) 공간 Trekker–CUT&Tag 멀티옴 워크플로우의 개략도. 신선하게 냉동된 쥐 뇌 조직의 코로나 절단이 트레커 공간 타일에 부착되어 공간 바코딩을 처리합니다. 조직 용해 후에는 핵을 분리하여 수율과 품질을 평가합니다. H3K27ac CUT&Tag에는 약 50,000개의 핵이 사용되며, 태그가 부착된 핵은 카운트 후 10배 게노믹스 크롬 멀티옴 젤 비즈를 사용하여 단일 세포 바코딩을 합니다. 단세포 바코드 DNA는 사전 증폭되어 두 개의 분획으로 나뉩니다. 인덱스화된 CUT&Tag 라이브러리는 인덱스 PCR에 의해 직접 생성됩니다. 유전자 발현 및 공간 바코드 라이브러리에서는 사전 증폭된 DNA를 추가로 증폭하고 크기를 선택합니다. 일반적인 cDNA 크기에 해당하는 조각들은 유전자 발현 라이브러리 준비에 사용되며, 더 짧은 DNA 조각은 공간 바코드 라이브러리를 생성하는 데 사용됩니다. 도서관은 10배 유전체학 및 Curio Trekker 가이드라인에 따라 서열 배열과 지도화됩니다. 예상 실험 일정은 왼쪽에 표시되어 있습니다. (B) 핵심 품질 관리(QC) 체크포인트 및 워크플로우 전반에 걸친 중요한 고려사항. 핵 QC에는 수율, 완전성, 응집 및 잔해 함량 평가가 포함됩니다. 사전 시퀀싱 QC에는 모든 라이브러리에 대한 DNA 크기 분포 및 프라이머 다이머 오염 평가가 포함됩니다. CUT&Tag 라이브러리의 특이성은 배경 전반에 걸쳐 표적 유전체 영역의 풍부도를 측정하는 정량적 PCR(qPCR)으로 평가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

본 연구는 신선 냉동 조직 절편에서 활성 시스 조절 요소와 유전자 발현과 관련된 히스톤 H3K27ac 변형을 동시에 프로파일링하는 공간적 Trekker CUT&Tag 멀티옴 분석법을 제시합니다. 이 프로토콜은 Takara Trekker 공간 바코딩, 조직 해리 및 핵 분리, 핵 수 및 품질 관리, H3K27ac 변형의 저입력 CUT&Tag 프로파일링, 10배 유전체 단세포 멀티옴 젤 비드에서의 분자 표적 포착, 라이브러리 준비 등 단계별 절차를 제공합니다. 이 작업 흐름은 쥐 뇌 조직의 관상 절편을 사용하여 시연되었습니다. 표준 10x Genomics Multiome 워크플로우에서는 트랜스포효소 접근 가능한 염색질을 고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)으로 측정하는 방식과 달리, 이 프로토콜은 ATAC 단편 대신 CUT&Tag에서 유래한 DNA 조각을 대체하여 단일 세포 해상도로 히스톤 변형 지형을 직접 조사할 수 있게 합니다. Trekker 공간 바코드를 10배 유전체 단일 세포 바코드와 연결하기 위해, Poly(A) 꼬리 공간 바코드와 mRNA 전사체는 Multiome 겔 비즈의 poly-dT 서열에 의해 포착되며, CUT&Tag DNA 조각은 스페이서 서열에 의해 포획됩니다. 이 이중 포획 전략은 동일한 단일 핵에서 후생유전체, 전사체, 공간 정보를 동시에 회수할 수 있게 합니다. 우리가 아는 한, 이는 바코드가 포함된 Trekker 공간 주석과 단일 세포 다중옴 분석법을 직접 통합하여 히스톤 마크의 유전체 전체 분포와 전사체를 공동 프로파일링하는 최초의 공간 다중옴 워크플로우입니다. 이로 인해 공간적으로 분해된 다중종 지형은 H3K27ac 점유 및 유전자 발현 데이터를 통합하여 단일 세포 프로필을 원래 조직 좌표로 투사할 수 있게 하며, 후생유전체 조절 메커니즘과 온전한 조직 구조와 관련된 전사 프로그램 간의 직접적인 연결고리를 제공합니다.

Protocol

성체 쥐는 조직 채취 전에_CO2 흡입(IACUC #: A48315-15-R24)으로 안락사되었습니다. 시상 두개골 절개술과 반으로 잘린 수추 제거 후 뇌가 전면 제거되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 공간 바코드 작성을 위해 Trekker 바코드 타일에 티슈 섹션을 부착하기

1. 시작하기 전에 다음 내용을 준비하세요.
   1. 절절 전에 최적 절단 온도(OCT) 조직 블록을 냉동체에서 평형으로 맞춥니다. 자외선 절단, 조직 해리, 핵 분리를 위한 완충제를 준비하세요.
      참고: 절절 최적 온도는 조직 종류에 따라 다를 수 있습니다.
   2. 핵 분리를 위해서는 1.5 mL 튜브용 스윙 버킷을 사용해 원심분리기를 4 °C로 미리 냉각하세요. 12웰 플레이트를 Trekker O-링으로 얼음 위에 미리 냉각하세요.
   3. UV 미터를 최대 전류 제한(1.2 A)과 최대 출력으로 설정하세요.
2. 사용할 Trekker 타일의 공간 바코드 타일 ID(예: U0001_001)를 기록하세요.
   참고: 각 트레커 타일에는 고유한 바코드 좌표가 포함되어 있습니다. 타일 ID는 시퀀싱 데이터의 공간 바코드 매핑을 위해 올바른 파일을 가져오는 데 필요합니다.
3. 조직을 절개하세요. bregma -1 mm 대략 위치에서 두께 25μm 두께의 코로나 절단이 −18 °C에서 수행되었습니다(그림 1A).
   참고: 세포 밀도가 낮은 조직을 다룰 경우 두께를 30 μm까지 늘릴 수 있습니다.
4. 해당 단면(또는 관심 영역)을 공간 타일 위에 위치시키고, 슬라이드 유리 바닥에 손가락을 살짝 대어 녹입니다.
   주의: 필요 시 Trekker 훈련 타일을 이용한 핵 품질 관리 측정 절차를 확인하세요.
5. 핀셋을 사용해 투명 접착제에서 타일을 떼어내고, 12웰 조직 배양판의 웰 안에 얼음 위에 넣어 Trekker O-링 위에 올려놓으세요. 즉시 30 μL Trekker UV 절단 버퍼를 타일에 피펫팅하여 조직 전체가 완충제로 덮이도록 하세요.
6. UV 램프(1.2A 설정)를 웰 바로 위 플레이트에 올려놓으세요. 1분간 조명을 켜서 바코드를 해제하고, 모든 것을 얼음 위에 보관하세요.
   주의: UV 램프를 사용할 때는 보호 UV 안경을 착용하세요.
7. UV 램프를 끄고 타일을 얼음 위에 7.5분간 부화시키세요. 배양 중에는 Trekker 10 x 10 세척 챔버를 꺼내 1번과 2번 챔버에 400 μL 냉각 Trekker 핵 세척 버퍼를 채워서 얼음 위에 샘플을 채취합니다.
8. 구슬을 만지지 않고 핀셋으로 조심스럽게 타일을 집어 1번 챔버에서 5초간 세척하세요. 2번 방의 타일을 5초간 세척하세요. 타일을 얼음 위에 올려놓은 12웰 플레이트의 우물에 조심스럽게 넣으세요. 조직 부위는 파란색으로 염색되어 쉽게 보이도록 해야 합니다.

2. 조직 해리 및 핵 분리

1. 조직을 향해 175 μL 인벤트 미닛 버퍼 A를 투여합니다. 3번 더 반복하면 총 700 μL가 됩니다. 각 디스펜스마다 타일의 다른 부위를 겨냥해 전체 조직을 타일에서 분리하세요.
   참고: 타일을 긁어주거나 비즈가 떨어져 나가는 오염을 피하세요.
2. 조직을 타일에서 분리하기 위해 웰 옆에서 버퍼를 흡인해 조직으로 덮인 타일 부위에 분사하고, 플레이트를 최대한 얼음 위에 두세요. 이 과정을 반복하여 타일에 조직이 남지 않을 때까지 반복합니다. 모든 조직이 타일에서 제거되면, 핀셋을 사용해 빈 우물로 옮기세요.
3. P1000 피펫을 사용해 같은 웰에서 반복적으로 분쇄하여 핵을 기계적으로 해리합니다. 보이는 조직 덩어리가 남지 않을 때까지 반복합니다.
4. 신경 조직/세포용 Invent Minute 단일 핵 분리 키트의 수집관이 포함된 필터 카트리지로 핵 현탁액을 조심스럽게 옮깁니다. 캡을 열어 –20°C에서 10분간 배양하세요. 필터 카트리지를 뚜껑으로 덮고 즉시 13,000 x g 에서 냉장 마이크로 원심분리기에서 30초간 원심분리합니다.
5. 필터 카트리지를 버리고 펠릿을 부드럽게 10–20번 피펫팅하여 다시 현탁하세요. 600 x g 의 압력으로 미리 냉하된 원심분리기와 스윙 버킷을 5분간 돌려 보세요. 상원액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 200 μL Trekker 버퍼 C에 재현탁합니다.
6. 1.5mL 저결합 에펜도르프 튜브에 1mL의 냉 인벤트 미닛 버퍼 B를 추가하고, 층 혼합을 방지하기 위해 튜브 벽에 천천히 배출하여 200 μL 핵 현탁액을 조심스럽게 겹쳐 넣습니다. 튜브를 500 x g 의 스윙 버킷이 있는 프리콜드 원심분리기에서 10분간 돌립니다. 우유층과 상원액을 조심스럽게 제거하세요.
7. 24 μL Trekker 버퍼 C로 핵을 부드럽게 재현탁한 후 분리된 핵의 품질 관리 측정을 진행합니다.

그림 2: 분리된 핵의 품질 관리 평가. 마우스 뇌 조직에서 분리된 핵의 대표성 밝시야 이미지. 핵은 0.4% 트리판 블루로 염색하고 40배 배율로 촬영하여 핵 완전성과 잔해 존재 여부를 평가했습니다. 왼쪽에 표시된 핵 준비물은 하류 분석에 적합한 고품질 온전한 핵을 보여주는 반면, 오른쪽에 표시된 준비물은 부분적으로 용해된 조직 응집체가 있는 저품질 핵을 보여줍니다. 손상되거나 파열된 핵은 채워진 화살촉으로 표시됩니다. 스케일 바는 100 μm입니다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 분리된 핵의 계수 및 품질 측정

1. 핵 수를 측정할 때는 핵 현탁액 2 μL를 8 μL Trekker 버퍼 C에 넣고, 희석된 핵 현탁액 10 μL과 AO/PI 염색 용액 10 μL를 섞습니다. 제조사의 지침에 따라 핵 수를 세세요.
2. 분리된 핵의 품질을 평가하기 위해, 핵 현탁액 2 μL를 4% 트리판 블루 용액 8 μL에 희석합니다. 형광 현미경으로 40배 확대로 핵을 검사하여 핵막의 형태와 비핵 잔해 함량이 온전한지 확인하라(그림 2).
3. 즉시 단일 핵 CUT&Tag 다중종(H3K27ac + 유전자 발현에 대한 CUT&Tag) 분석으로 진행합니다.
   주의: 최소 30,000개의 고품질 핵이 회수되면 다음 단계로 진행하세요.

4. 고립된 핵에 대한 CUT&Tag 태깅

1. CUT&Tag 인큐베이션 버퍼 I을 준비하세요. 얼음 위에 올려놓으세요.
2. 유도(TAG) 효소 접합체에 의해 활성화된 1차 항체 및 전이효소를 준비합니다.
   1. 얼음 위에 있는 PCR 튜브에 CUT&Tag 인큐베이션 버퍼 I 46.23 μL과 TAG 효소 1.33 μL 추가합니다. 튜브에 최적화된 양의 1차 항체를 추가하세요. 피펫팅으로 천천히 10번 섞으세요.
      참고: 반응에 2.43 μL 항-H3K27ac 항체가 첨가되었습니다. 항체 로트는 벌크 및 현장 CUT&Tag 분석에 대해 검증되었습니다. TAG 효소 접합을 위한 항체 양을 벌크 분석으로 최적화하세요. 최적 항체는 qPCR로 양성 및 음성 표적 유전자좌에서 최대 신호 대 잡음비를 달성한 가장 낮은 농도로 정의되었습니다.
   2. 잠시 돌려서 튜브를 18rpm 회전 장치에 올려놓으세요. 실온에서 1시간 정도 배양하세요. 이 혼합물은 미리 만들어 최대 5시간 동안 얼음 위에 올려둘 수 있습니다.
      참고: 항체-TAG 인큐베이션은 핵 분리와 동시에 또는 이전에 시행될 수 있습니다.
3. 항체-TAG 효소 결합체와 함께 분리된 핵을 배양.
   1. 분리된 핵 튜브(Step 2.7)를 500 x g 의 스윙 버킷을 이용한 원심분리기에서 10분간 돌립니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하고 ~5 μL의 상청액을 남깁니다.
   2. CUT&Tag 배양 버퍼 I 25 μL (Step 4.1)을 추가하고 부드럽게 10회 피펫팅하여 재현탁합니다. 핵을 항체-TAG 접합체가 포함된 튜브로 옮기세요(단계 4.2.2). 같은 피펫 팁을 사용하세요. 피펫팅으로 10번 부드럽게 섞은 후, 튜브를 부드러운 회전기에 올려놓으세요.
   3. 4°C에서 하룻밤 부양하세요.
4. 다음 날(2일차)에는 CUT&Tag 핵 완충액 1개를 준비하고 얼음 위에 올려놓으세요.
5. CUT&Tag 태그멘테이션
   1. 회전자에서 반응관(단계 4.3.3)을 회수하세요. CUT&Tag 활성제 5 μL을 추가하고 혼합물을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 37°C에서 550rpm 온도의 ThermoMixer에서 1시간 동안 부양합니다.
   2. 튜브를 회수하고 20 μL CUT&Tag 담근 버퍼를 추가한 후 반응을 10회 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 500 x g 에서 스윙 버킷을 사용해 미리 냉장 원심분리기에서 10분간 원심분리합니다. 핵 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하고, 튜브 바닥에 ~5 μL의 상액을 남깁니다.
   3. 100 μL 1X CUT&Tag 핵 버퍼를 추가하고, 부드럽게 10회 피펫팅하여 핵을 재현탁합니다. 튜브를 500 x g 의 스윙 버킷이 있는 프리콜드 원심분리기에서 10분간 돌립니다. 상청액 85 μL를 제거하고 ~15 μL만 남기세요. 핵을 부드럽고 천천히 10회 피펫팅하여 재현탁합니다.
6. 태그가 부착된 핵 수 및 표적 수 결정
   1. 태그된 핵 현탁액 1 μL을 인산 완충 식염수 9 μL에 첨가한 후 10 μL AO/PI 염색액과 혼합합니다. 3.1단계에서 설명한 태그가 있는 핵을 개수하세요.
   2. 단일 세포 GEM 생성 시 목표 핵 수의 1.6배를 사용하여 원하는 포획 핵 수를 얻습니다.
   3. 500 x g 압력으로 스윙 버킷이 장착된 예냉 원심분리기에서 튜브를 10분간 돌린 후 상상액을 조심스럽게 제거하여 최종 부피는 8 μL로 남깁니다.

5. 태그가 부착된 핵의 단일 세포 바코드 및 바코드 DNA의 사전 증폭

1. 실험에 예상되는 표적 핵 수와 함께 태그가 부착된 핵 8μL에 7 μL ATAC 버퍼 B를 추가합니다.
   참고: Chromium Next GEM 단세포 다중세포 ATAC + 유전자 발현 키트 사용자 가이드(CG000338 Rev G)의 "GEM 생성 및 바코딩" 프로토콜에서 Chromium X 기기의 반응 설정 및 작동에 대한 자세한 내용을 참조하십시오.
2. 크롬 X 기기를 이용한 GEM 생성 및 바코딩.
   1. 태그가 부착된 핵이 포함된 튜브에 GEM 마스터 믹스 60 μL을 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞은 후 Chromium Next GEM 칩 J의 1번째 행에 적재하세요.
   2. 단세포 멀티옴 젤 비즈를 준비하고 2행에 50 μL 젤 비즈를 적재합니다. 3행의 유정에 45μL의 분배용 오일을 분배합니다.
   3. 조립된 칩 J와 가스켓을 Chromium X 기기의 트레이에 넣고 기기를 작동시킵니다.
   4. 회수 우정의 가장 낮은 지점에서 천천히 100 μL GEM을 흡입합니다. 피펫 끝을 웰 측면에 대고 얼음 위에 새 PCR 튜브에 GEM을 천천히 분사하세요.
   5. 수집된 GEM을 열 사이클러(뚜껑 온도 50°C)에서 다음 절차로 인큐브합니다: 37°C 사이클 1회는 45분, 25 °C 사이클 1회는 30분, 4 °C 사이클 1회 유지 시 보관합니다.
   6. 5 μL 담금제를 추가하고 피펫팅으로 10회 천천히 섞습니다.
3. GEM 이후 배양 및 DNA 정제 정화
   참고: 자세한 내용은 Chromium Next GEM 단세포 다중종 ATAC + 유전자 발현 키트 사용자 가이드(CG000338 Rev G)의 "GEM 인큐베이션 후 정화" 프로토콜에서 확인할 수 있습니다.
   1. 상온에서 튜브에 분홍색 회수제 125 μL를 첨가한 후 튜브를 부드럽게 10번 뒤집습니다. 원심분리기 잠깐. 튜브 바닥에서 125μL의 회수제/분열유(분홍색)를 천천히 제거하고 버리세요.
   2. 튜브에 200μL 다이나비즈 클린업 믹스를 넣고 피펫팅으로 10회 섞습니다. 상온에서 10분간 배양하세요. 용액이 맑아질 때까지 튜브를 자석 스탠드 위에 올려두세요. 상정액을 제거하세요.
   3. 펠릿에 신선하게 준비한 80% 에탄올 300 μL을 첨가합니다. 30초 배양하고 상원액을 제거하세요. 80% 에탄올 200 μL을 펠릿에 추가하고 30초 배양한 후 상원액을 제거합니다. 튜브를 잠시 돌려서 자석 위에 올려놓으세요. 남은 상청액을 제거하세요.
   4. 자석에서 튜브를 분리하세요. 즉시 50.5 μL 용액 I를 추가하세요. 피펫팅으로 혼합한 후 상온에서 1분간 인큐베이션합니다. 잠시 돌린 후 튜브를 자석 위에 올려 용액이 맑아질 때까지 유지하세요. 50 μL 투명한 용액을 새 튜브에 옮깁니다.
   5. 패러자성 비드에 의한 DNA 정제
      1. 각 샘플에 90 μL 파라자성 비드(1.8X)를 추가하고 피펫팅으로 충분히 혼합합니다. 실온에서 5분간 부화하세요. 잠시 돌린 후 튜브를 자석 위에 올려 용액이 맑아질 때까지 유지하세요. 상정액을 제거하세요.
      2. 펠릿에 80% 에탄올 200 μL를 추가합니다. 30초간 부화하세요. 에탄올을 제거하세요. 한 번 더 반복하세요.
      3. 잠시 돌리고 튜브를 자석 위에 올려놓으세요. 남은 상청액을 제거하세요.
      4. 자석에서 튜브를 분리하세요. 버퍼 EB 46.5 μL을 추가하고 피펫으로 혼합합니다. 실온에서 2분간 배양하세요. 돌려서 자석 위에 올려서 용액이 맑아질 때까지 두세요.
      5. 정제된 DNA 46 μL을 새로운 튜브로 옮깁니다.
4. 바코드 DNA의 사전 증폭.
   1. 각 샘플에 54 μL의 프리 앰플리피 믹스를 첨가합니다. 피펫 혼합 후 원심분리기를 잠시 사용하세요.
   2. 열 사이클러(뚜껑 온도는 105°C)에서 다음 프로토콜로 배양합니다: 72°C의 사이클 1회, 5분간 함께; 98°C의 3분간 한 주기; 총 7회 사이클이 있었는데, 98 °C 20초, 63 °C 30초, 72 °C 1분; 1분 동안 72°C의 사이클; 그리고 4°C에서 보류가 있습니다. 하룻밤 4°C에서 보관하세요.
   3. 다음 날(3일차)에는 5.3.5단계에 설명된 대로 1.6배 비드로 사전 증폭된 DNA를 정제합니다. 튜브에 80.5 μL 버퍼 EB를 추가하고 피펫으로 혼합합니다. 22 °C(상온)에서 2분간 배양합니다. 잠시 돌린 후 튜브를 자석 위에 올려 용액이 맑아질 때까지 유지하세요.
   4. 80 μL 사전 증폭된 DNA를 새로운 튜브로 옮깁니다. 40 μL를 사용해 CUT&Tag 라이브러리를 생성하세요. 남은 사전 증폭된 DNA는 4°C에 저장합니다.
      참고: 남은 40 μL의 사전 증폭 DNA는 이후 유전자 발현 및 공간 바코드 라이브러리에 사용됩니다.

6. CUT&Tag, 유전자 발현 및 공간 바코드를 위한 라이브러리 준비

1. scCUT&Tag 라이브러리 준비
   1. 40 μL 사전 증폭된 DNA를 새 튜브로 옮기고 60 μL 샘플 인덱스 PCR 혼합물을 추가합니다. 피펫으로 혼합하고 잠시 돌리세요.
   2. 열 사이클러(뚜껑 온도는 105°C)에서 다음 프로토콜로 배양합니다: 98°C의 사이클 1회, 45초; 총 12회 사이클이 98 °C 20초, 67 °C 30초, 72 °C 20초 동안 측정; 1분 동안 72°C의 사이클; 4 °C는 정지 시 가능합니다).
      참고: 최적의 주기 수는 시작 핵 수와 프로파일링되는 히스톤 마크에 따라 달라집니다. 실험에서 H3K27ac 마크에는 12개의 증폭 사이클이 사용되었습니다.
   3. 이중 크기 선택 및 패러자성 구슬에 의한 DNA 정제(0.6X, 1.55X)
      1. 각 샘플에 60 μL 파라자성 비드(0.6X)를 추가하고 피펫팅으로 충분히 혼합합니다. 실온에서 5분간 부화하세요. 잠시 돌린 후 튜브를 자석 위에 올려 용액이 맑아질 때까지 유지하세요.
      2. 150 μL 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 각 샘플(상청액)에 95 μL 파라자성 비드(1.55X)를 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 실온에서 5분간 부화하세요. 용액이 맑아질 때까지 튜브를 자석 위에 올려놓으세요. 상정액을 제거하세요.
      3. 펠릿에 80% 에탄올 300 μL을 추가합니다. 30초 기다려. 에탄올을 제거하세요. 한 번 더 반복해. 잠시 돌리고 튜브를 자석 위에 올려놓으세요. 남은 상청액을 제거하세요.
      4. 자석에서 튜브를 분리하세요. 20.5 μL 버퍼 EB를 튜브에 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 실온에서 2분간 배양하세요. 돌려서 자석 위에 올려서 용액이 맑아질 때까지 두세요.
      5. 정제 및 인덱스화된 CUT&Tag 라이브러리 20 μL을 새 튜브로 옮깁니다.
2. CUT&Tag 라이브러리의 품질 검사
   1. 도서관 내 DNA 크기 분포 분석
      1. 정제된 라이브러리 DNA 1 μL과 저 TE 버퍼 1 μL을 혼합합니다.
      2. 희석된 DNA를 Fragment Analyzer 작업 버퍼와 혼합한 후, 고감도 HS NGS 단편 키트(1-6000bp)를 사용해 기기에서 실행합니다(그림 3A).
   2. 시서열 분석 및 지도화 전에 H3K27ac 양성 유전체 유전자좌의 농축 상태를 평가하세요.
      1. 정제된 라이브러리 DNA 1 μL과 뉴클레아제 프리 물 4 μL을 혼합합니다. 세 개의 유전체 유전체 유전자에 대해 qPCR 측정을 위해 희석된 라이브러리 DNA 1 μL을 사용하세요.
         참고: H3K27ac CUT&Tag의 경우, 양성 프라이머는 Actb-TSS 유전자좌에서 설계되었으며, T1-TSS와 유전자 간 유전자좌를 표적으로 한 프라이머는 음성 대조군으로 사용되었습니다²⁰ (표 1). 마우스 유전체 DNA는 PCR 효율을 정규화하기 위한 입력 대조군으로 사용되었습니다(그림 3B).
      2. 총 20 μL 반응 혼합물을 다음과 같이 준비합니다: 희석된 라이브러리 DNA 1 μL, 10 μM 프라이머 혼합물 2 μL, 2X SYBR 그린 마스터 믹스 10 μL , 뉴클레아제 무첨가 물 7 μL
      3. 준비된 qPCR 플레이트를 적절한 사이클링 프로그램을 사용하여 CFX Opus 실시간 PCR 시스템에서 SYBR 그린 검출을 수행합니다.
3. cDNA 및 공간 바코드 DNA의 증폭.
   1. 35 μL 사전 증폭 DNA (Step 5.4.4)을 새 튜브로 옮기고, 65 μL cDNA 증폭 반응 혼합물을 추가합니다. 피펫으로 혼합하고 잠시 돌리세요. cDNA 및 공간 바코드 DNA 증폭에 사용되는 프라이머는 Feature cDNA Primers 2입니다.
   2. 열 사이클러(뚜껑 온도는 105°C)에서 다음 프로토콜로 배양합니다: 98°C의 사이클 1회, 45초; 총 8주기가 98 °C 20초, 63 °C 30초, 72 °C 1분 주기; 1분 동안 72°C의 사이클; 대기 시 4 °C.
      참고: 최적의 사이클 수는 세포 유형, RNA 함량, 그리고 시작 핵 수를 기준으로 결정되어야 합니다. 이 실험에서는 8번의 증폭 사이클이 수행되었습니다.
   3. 증폭된 cDNA의 정제
      1. 6.1.3단계에서 설명한 이중 크기 선택 및 패러자성 구슬(0.6X, 2.0X)에 의한 DNA 정제. 각 샘플에 60 μL 파라자성 비드(0.6X)를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 실온에서 5분간 부화하세요. 자석을 용액 위에 올려 투명해질 때까지 대세요.
      2. 펠릿을 방해하지 않고 새 튜브에 75μL의 상청액을 옮기고 저장하세요. 상온에서 유지하세요.
         주의: 상정액은 공간 바코드 라이브러리를 생성하는 데 사용될 짧은 조각을 위해 DNA가 풍부하게 포함되어 있으므로 버리지 마십시오.
      3. 남은 상청액을 제거하세요. 6.1.3단계에 설명된 대로 80% 에탄올로 두 번 세척합니다.
      4. 튜브에 40.5 μL 버퍼 EB를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 실온에서 2분간 배양하세요. 잠깐 돌린 후 용액이 맑아질 때까지 자석을 올려 놓으세요.
      5. 증폭된 cDNA 40 μL을 새로운 튜브로 옮깁니다. 인덱싱된 유전자 발현 라이브러리를 준비하기 위해 얼음에 보관하세요.
         참고: 이 분획은 일반적인 cDNA의 크기에 대한 DNA를 풍부하게 만듭니다.
   4. 증폭된 공간 바코드 DNA의 정제
      1. 70 uL 파라자성 비드(2.0X)를 이전에 저장한 75 μL의 상청액에 추가합니다(6.3.3.2단계). 피펫으로 혼합하고 잠시 돌리세요. 실온에서 5분간 배양하세요. 용액이 맑아질 때까지 튜브를 자석 위에 올려놓으세요. 상정액을 제거하세요.
      2. 6.1.3단계에 설명된 대로 80% 에탄올로 두 번 세척합니다.
      3. 튜브에 40.5 μL 버퍼 EB를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 실온에서 2분간 배양하세요. 잠깐 돌린 후 용액이 맑아질 때까지 자석을 올려 놓으세요.
      4. 증폭 및 정제된 공간 바코드 DNA 40 μL을 새로운 튜브로 옮깁니다. 이후 인덱스 공간 바코드 라이브러리를 생성할 때 −20 °C에 저장됩니다.
   5. 조각 분석기를 이용한 cDNA 크기 분석. 증폭된 cDNA 1 μL과 저 TE 버퍼 1 μL을 혼합합니다. 희석된 DNA를 6.2.1단계에서 설명한 프래그먼트 분석기로 분석합니다.
   6. 인덱스 유전자 발현 라이브러리 준비
      1. 증폭된 cDNA 10 μL(단계 6.3.3.5)을 새로운 튜브로 옮깁니다. 버퍼 EB 25 μL과 분쇄 혼합물 15 μL 추가. 얼음 위에 피펫팅해서 섞으세요. 잠시 돌린 후 튜브를 4°C의 미리 냉각된 열 사이클러로 옮깁니다.
      2. 다음 프로토콜을 시작하여 열 사이클러(뚜껑 온도는 65 °C)에서 배양합니다: 32 °C 사이클 1회 5분; 65°C에서 30분간 한 사이클; 대기 시 4 °C.
      3. 6.1.3단계에서 설명된 2배 크기 선택 및 상자성 구슬(0.6X, 0.8X)에 의한 DNA 정제. 버퍼 EB 50.5 μL을 추가하고 피펫으로 혼합합니다. 실온에서 2분간 배양하세요. 잠깐 돌린 후 용액이 맑아질 때까지 자석을 올려 놓으세요.
      4. 50 μL 샘플을 새 튜브로 옮깁니다. 어댑터 리게이션 믹스 50 μL을 추가하고 피펫으로 혼합합니다. 잠깐 돌려보세요. 열 사이클러(뚜껑 온도는 30°C)에서 다음 프로토콜로 배양합니다: 20°C의 15분, 4°C의 1주기 동안 15분, 4°C로 보관.
      5. 5.3.5단계에서 설명한 순자성 구슬(0.8X)에 의한 DNA 정제. 버퍼 EB 30.5 μL을 추가하고 피펫으로 혼합합니다. 실온에서 2분간 배양하세요. 잠깐 돌린 후 용액이 맑아질 때까지 자석을 올려 놓으세요. 샘플 30 μL를 새 튜브로 옮깁니다.
      6. 유전자 발현 라이브러리의 인덱스 PCR. 각 샘플에 50 μL 앰프 믹스와 20 μL 개별 듀얼 인덱스 TT 세트 A를 추가합니다.
      7. 열 사이클러(뚜껑 온도는 105°C)에서 다음 프로토콜로 배양합니다: 98°C의 사이클 1회, 45초; 총 11회 사이클이 있었으며, 98 °C 20초, 54 °C 30초, 72 °C 20초 동안 1분 동안 72°C의 사이클; 대기 시 4 °C.
         참고: 최적의 사이클 수는 세포 유형, RNA 함량, 시작 핵 수를 기준으로 결정해야 합니다. 이 실험에서는 총 11개의 증폭 사이클이 사용되었습니다.
      8. 6.1.3단계에서 설명된 2배 크기 선택 및 상자성 구슬(0.6X, 0.8X)에 의한 DNA 정제. 튜브에 35.5 μL의 버퍼 EB를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 실온에서 2분간 배양하세요. 잠깐 돌린 후 용액이 맑아질 때까지 자석을 올려 놓으세요.
      9. 정제 및 인덱싱된 유전자 발현 라이브러리 35 μL을 새로운 튜브로 옮깁니다.
4. 유전자 발현 라이브러리 내 DNA 크기 분포 분석. 라이브러리 DNA 1 μL과 저 TE 버퍼 1 μL 혼합합니다. 6.2.1단계에서 설명한 희석된 DNA를 검사합니다. (그림 3A).
5. 인덱스 공간 바코드 라이브러리 준비
   1. 샘플 인덱스 PCR 혼합액 총 100 μL를 다음과 같이 준비합니다: 50 μL 암페어 믹스(GEM-X 단세포 3' 피처 바코드 키트에서), 버퍼 EB 25 μL, 듀얼 인덱스 플레이트 TT 세트 A에서 프라이머 20 μL, 그리고 정제된 공간 바코드 DNA 1 μL(단계 6.3.4.4)을 4 μL EB 버퍼에 희석한 상태.
   2. 열 사이클러(뚜껑 온도는 105°C)에서 다음 프로토콜로 배양합니다: 98°C의 사이클 1회, 45초; 총 7주기가 있었으며, 98 °C 20초, 54 °C 30초, 72 °C 20초 동안 측정; 1분 동안 72°C; 대기 시 4 °C.
   3. 5.3.5단계에서 설명된 1.2X의 파라자성 구슬에 의한 DNA 정제. 튜브에 35.5 μL 의 EB 버퍼를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 실온에서 2분간 배양하세요. 용액이 맑아질 때까지 튜브를 자석 위에 올려놓으세요.
   4. 정제 및 인덱싱된 공간 바코드 라이브러리 DNA 35 μL을 새로운 튜브로 전송합니다. 최대 72시간까지 4°C에서 보관하며, 장기 보관은 −20°C에서 보관할 수 있습니다.
6. 인덱스된 공간 바코드 라이브러리에서 DNA 크기 분포를 확인하세요. 정제된 라이브러리 DNA 1 μL과 저 TE 버퍼 1 μL을 혼합합니다. 희석된 DNA를 6.2.1단계(그림 3A)에 설명된 프래그먼트 분석기로 분석합니다.

그림 3: 색인된 도서관의 품질 관리 평가. (A) 증폭된 DNA 및 인덱스 라이브러리에서의 크기 프로필. DNA는 조각 분석기(Fragment Analyzer)를 통해 DNA의 질과 크기 분포를 평가합니다. 여기에는 색인 CUT&Tag 라이브러리, 유전자 발현 및 공간 바코드 라이브러리 준비에 사용되는 증폭 DNA, 색인화된 유전자 발현 라이브러리, 그리고 색인화된 공간 바코드 라이브러리의 대표적 프로필이 나와 있습니다. (B) CUT&Tag 라이브러리는 qPCR로 분석되어 H3K27ac 양성 유전체 영역(즉, ACTB)이 H3K27ac 음성 배경 신호(즉, T1 및 유전자 간 유전자 유전자 좌위) 위에 얼마나 풍부한지 평가합니다. 양과 음의 영역 간 폴드 차이는 농축²¹로 계산됩니다. 이 분석법²⁰에서는 접힘 농축이 10보다 이상으로 간주됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

7. 라이브러리 순서

1. Trekker 공간 바코드 라이브러리를 포획한 핵당 5,000쌍의 리드 페어 깊이에서 시퀀싱합니다.
2. 포획된 핵당 25,000쌍의 리드 쌍에서 H3K27ac CUT&Tag 라이브러리를 시퀀싱합니다.
3. 포획한 핵당 최소 20,000쌍의 리드 쌍 깊이에서 유전자 발현 라이브러리를 시퀀싱합니다.

8. 생물정보학 및 데이터 분석

1. 프로세스 유전자 발현과 CUT&Tag 읽기는 Cell Ranger ARC v2.0.2를 사용하여 --min-atac-count=1000과 --min-gex-count=1000으로 수행됩니다. Trekker 파이프라인 v1.3.0을 사용하여 Cell Ranger ARC 출력과 Trekker 바코드 정보를 통합하고, 기본 매개변수로 공간 위치를 할당합니다.
2. Signac을 사용해 품질 관리를 수행하세요. 다음 기준을 충족하는 세포는 하위 분석에서 제거되었습니다: CUT&Tag의 경우 총 조각 수는 1,000,000 또는 ≤ 100≥, TSS 농축 ≤ 2; 유전자 발현의 경우 총 UMI 수는 100,000개≤ 1,000개≥, 검출된 유전자 수는 10,284개≥ 200개≤.
3. 유전자 발현은 scDblFinder를, CUT&Tag는 AMULET으로 제거하세요. 다음 기준을 충족하는 세포는 이중항으로 분류되었습니다: (1) scDblFinder 점수 ≥ 0.6; (2) scDblFinder 점수 ≥ 0.3, AMULET ≤ 0.01; 그리고 (3) 이중 중복 비율이 높은 군집에서 발견됩니다.
4. LogNormalize를 사용해 유전자 발현 데이터를 정규화하고, TF-IDF를 사용하여 CUT&Tag 데이터를 정규화합니다. 염색질 모달리티에 대해 LSI 차원 2–50을 사용하여 RNA PCA 및 CUT&Tag LSI 임베딩을 계산합니다. FindMultiModalNeighbors를 사용하여 가중치 근접 그래프를 구성하고, 이 다중모달 이웃 그래프를 기반으로 UMAP 임베딩을 생성합니다.
5. FindTransferAnchors와 기본 매개변수를 적용한 PCA 투영 매핑 전략을 기반으로 Seurat 레이블 전송을 사용하여 품질 관리 후 Trekker 데이터를 주석으로 표시합니다. ABC 아틀라스(버전 20230630)의 scRNA-seq 데이터가 참고 자료로 사용되었습니다. 알려진 조직 해부학과 일치하지 않는 세포 유형 예측은 수동 관리 과정에서 제거되었습니다.
   참고: 생물정보학 분석 스크립트는 GitHub에서 확인할 수 있습니다: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

신선으로 냉동된 생쥐 뇌 조직의 관상 절단면(두께 25 μm, 약 10 × 10 mm 공간 타일 70% 포함)을 사용하여 여기서 설명한 작업 흐름은 일관되게 50,100개의 고품질 핵(SD = 12,200, n = 8)을 얻어 하위 단일 세포 다중군 프로파일링에 충분했습니다(그림 1). 조직 단면의 Trekker 공간 바코딩 후, 핵은 부드러운 조직 해리를 사용해 분리되었고, Invent 단일 핵 분리 키트로 추가 정제되었습니다. 이 절차는 최소한의 이물질과 낮은 수준의 핵 응집을 가능하게 하여 단일 세포 분석에 적합한 핵 준비물을 생산했습니다. 분리된 핵의 대표적인 이미지는 그림 2에 나와 있습니다.

CUT&Tag 멀티옴 프로파일링(CUT&Tag + 유전자 발현)을 포함한 하위 단일 핵 분석에서는 약 50,000개의 핵이 이곳에서 일반적으로 처리되었습니다. 핵 회수를 극대화하기 위해, 직접 항체–pA/Tn5 표적 지정과 태깅을 사용하여 단순화되고 효율적인 저입력 CUT&Tag 프로토콜을 구현하여 배양 시간과 세척 단계¹⁹를 최소화하였습니다. 이 방법을 사용해 약 25,000개의 태그먼트 핵이 회수되었으며, 평균 수율은 48.3%에 해당합니다(SD = 6.1, n = 3). 이 핵들은 이후 10배 게노믹스 크롬 멀티옴 젤 비즈와 함께 단일 세포 바코딩에 사용되었습니다. GEM 생성을 위해 약 15,000개의 핵을 목표로 삼았으며, 품질 필터링 후 약 10,000개의 공간적으로 지수된 핵을 회수할 것으로 기대했습니다. Trekker 공간 바코드 디코딩을 기반으로 단일 셀 데이터셋의 핵(SD = 9, n = 3)의 81.3%가 타일 내 공간 위치에 자신 있게 할당할 수 있었습니다.

공간 Trekker–CUT&Tag 멀티옴 워크플로우는 세 가지 인덱스 라이브러리(CUT&Tag), 유전자 발현, 공간 바코드 라이브러리를 생성합니다. 사전에 증폭된 바코드 DNA는 젤 비드의 표적의 포획 화학에 따라 라이브러리 준비에 사용된 두 개의 분획으로 나뉘었습니다. CUT&Tag 라이브러리는 사전 증폭된 DNA에서 직접 증폭되었으며, 핵체가 없는 DNA와 핵체체 DNA에 해당하는 CUT&Tag 태그먼트의 특징적인 조각 크기 분포를 나타냈습니다(그림 3A). 라이브러리는 H3K27ac 양성 Actb 유전자좌가 H3K27ac 음성 유전체 유전체 유전자^20,21보다 잘 풍부해졌음을 보여주었으며(즉, 68배 차이로, 이전에 설정된 H3K27ac²⁰의 크로마틴 면역침전-시퀀싱 분석에서 설정된 10배 컷오프를 초과함) (그림 3B). 유전자 발현 및 공간 바코드 라이브러리의 경우, 10배 유전체 cDNA 증폭 프로토콜을 따라 사전 증폭된 DNA를 먼저 증폭한 후, 파라자성 비드 정제를 이용해 조각 크기에 따라 두 개의 분획으로 분리되었습니다. 인덱스 공간 바코드 라이브러리는 짧은 조각에 대해 농축된 분열에서 준비되었으며, 예상 조각 크기에서 뚜렷한 피크를 보였습니다. 유전자 발현 라이브러리는 증폭된 cDNA 조각을 중심으로 한 특징적인 크기 분포를 보였다(그림 3A).

그림 4: 마우스 뇌 조직에서 공간적 Trekker–CUT&Tag 멀티옴 분석의 단세포 및 공간 표현. (A) 단일 세포 분석을 통한 세포 유형 식별. 균등 다양체 근사 및 투영(UMAP) 플롯은 H3K27ac CUT&Tag 단독, 유전자 발현 단독, 그리고 통합 멀티옴 데이터셋(CUT&Tag + 유전자 발현)에서 도출된 주석 달린 세포 집단을 보여줍니다. (B) 공간 Trekker–CUT&Tag 멀티옴 데이터의 공간적 표현. 통합 멀티옴 데이터셋의 핵은 Trekker 바코드를 사용해 공간 좌표에 할당되어, 쥐 뇌 조직 단면에 걸쳐 해부학적으로 조직된 세포 유형의 분포를 드러냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

CUT&Tag 및 유전자 발현 라이브러리의 시퀀싱 및 매핑은 10배 유전체 가이드라인을 따라 Cell Ranger ARC v2.0.2를 사용하여 수행되었으며, 공간 바코드 라이브러리는 Takara Trekker 권고에 따라 Trekker v1.3.0을 사용해 처리되었습니다. 제안된 단일 셀 ATAC-seq 매핑 옵션은 CUT&Tag 라이브러리에 적용되었습니다. 단일 핵 데이터셋은 CUT&Tag 단독, 유전자 발현 단독, 그리고 결합 멀티옴(CUT&Tag + 유전자 발현)에 대해 생성되었습니다. CUT&Tag(≥ 1,000,000 또는 ≤ 100) 또는 유전자 발현(≥ 100,000 또는 ≤ 1000)을 가진 총 UMI를 가진 세포는 Signac²²를 사용하여 걸러냈습니다. 더블렛 예측은 유전자 발현을 위해 scDblFinder²³을, CUT&Tag를 위해 AMULET²⁴를 조합하여 수행했습니다. 다음 기준 중 하나를 충족하는 세포가 제거되었습니다: 1) scDblFinder.score > 0.6; 2) scDblFinder.점수는 0.3에서 0.6 사이이며, amulet.s코어는 0.01<. 세포 유형 주석은 Allen Brain Cell Atlas의 참조 데이터²⁶을 기반으로 Seurat의 FindTransferAnchors²⁵를 사용하여 수행되었습니다. 이 연구의 유전자 발현 라이브러리에서 세포당 UMI 중앙 수는 15,378개, 세포당 유전자 중앙값은 4,378개였습니다. CUT&Tag 라이브러리에서는 11,860개의 세포가 검출되었으며, 세포당 중앙값은 6,631개의 고품질 조각, TSS 농축 점수는 7.66이었습니다. Trekker 공간 바코드 라이브러리에서는 92.43%의 핵이 공간 위치에 할당되었고, 51.54%의 핵이 단일 공간 위치에 할당되었습니다. 원시 시퀀싱 데이터와 2차 분석에서 처리된 데이터는 GEO를 통해 등록번호 GSE327406 아래에 제공된다. QC 이후 마지막 주석이 달린 Seurat 객체는 Zenodo에서 accession number 19475899로 제공됩니다. 셀 유형 주석이 포함된 대표적인 UMAP 임베딩은 그림 4A에 나와 있습니다. 단일 세포 바코드를 공간 바코드와 연결함으로써 개별 핵을 조직 내 공간적 위치에 다시 할당하여 공간 지도를 생성했습니다(그림 4B). 이 지도는 인접 단면에서 관찰된 해부학적 특징과 매우 일치하며, 쥐 뇌 해부학의 표준 참고문헌인 Allen Brain Atlas²⁷의 관상뇌 단면과 일치합니다. 단일 세포 해상도에서 공간 유전자 발현과 H3K27ac 프로필을 공동 분석하여 주요 뇌세포 유형을 식별하고 조직 절편 전반에 걸쳐 해부학적으로 조직된 세포 분포 패턴을 밝혀냈습니다.

Discussion

이 프로토콜은 공간 바코딩, H3K27ac의 저입력 CUT&Tag 프로파일링, 10배 유전체 단세포 멀티옴 젤 비즈에서 다중 분자 표적의 동시 포착, 그리고 일루미늄 시퀀싱을 위한 하위 라이브러리 준비를 통합한 공간적 Trekker–CUT&Tag 멀티옴 워크플로우를 설명합니다. 공간 색인과 단세포 후생유전체 및 전사체 판독을 결합함으로써, 이 접근법은 기존 단일 세포 다중옴 분석의 근본적인 한계를 해결합니다. 이 분석은 토착 조직의 맥락이 부족합니다. 이 연구는 공간적 CUT&Tag 멀티옴 프로파일링(H3K27ac CUT&Tag + 유전자 발현)의 실현 가능성을 성공적으로 입증하고, 유전자 발현 및 히스톤 마크 및 염색질 관련 단백질과 같은 조절 표적의 공간적 공동 프로파일링의 기초를 마련했습니다.

워크플로우의 여러 단계에서 엄격한 품질 관리가 이 워크플로우의 성공적인 구현을 위해 필수적입니다(그림 1). 여기서 설명하는 절차는 절개 후 단계부터 시작하지만, 조직 절제의 품질이 최적의 결과를 위해 매우 중요합니다. 절편 두께는 조직 유형과 예상되는 세포 밀도에 따라 조정되어야 합니다. 조직 해리 및 핵 분리 과정에서, 핵 무결성을 유지하면서 핵 수율을 극대화하는 것은 Trekker 기반 단세포 다중옴 분석의 전반적인 성능에 매우 중요합니다. 낮은 핵 수율은 최적 해리가 아니거나, 핵 분리가 비효율적이거나, 절면 두께가 부족한 경우에 의해 발생할 수 있습니다. 핵 무결성 저하는 과도한 기계적 파괴, 장기간 처리 시간, 또는 과분해로 인해 발생할 수 있습니다. 핵 분리는 Trekker 기반 단일 셀 멀티옴 워크플로우를 성공적으로 구현하기 위한 주요 문제 해결 포인트입니다. 따라서 Trekker 기반 단세포 다중옴 분석법을 시작하기 전에 핵 분리 프로토콜의 조직 특이적 최적화가 강력히 권장됩니다. 분리된 핵은 정량적이고 정성적으로 평가되어야 합니다. 핵 염료를 이용한 핵 계수는 수율을 추정할 수 있으며, 현미경 검사는 핵막의 무결성, 응집, 비핵 잔해의 존재 여부를 평가할 수 있습니다. 라이브러리 준비 후에는 모든 라이브러리에서 조각 크기 분포와 어댑터 다이머 유무를 평가해야 합니다. CUT&Tag 라이브러리의 경우, 배경 조사 전의 표적 유전체 영역 농축을 정량적 PCR로 평가하여 분석의 특이성과 전체 라이브러리 품질을 조기에 파악할 수 있어야 합니다. 시퀀싱 후 품질 관리는 공간 멀티옴 데이터의 정확한 해석을 위해 똑같이 중요합니다. 매핑 속도, 핵당 조각 수, 전사 시작 부위 풍부도, CUT&Tag의 조각 인피크 점수, 유전자 복잡도, 세포별 리드 깊이와 같은 지표는 10x Genomics와 Takara Trekker의 권장 지침에 따라 평가되어야 합니다. 후생유전체와 전사체 양쪽에서 이러한 지표를 공동 평가함으로써 기술적 산물의 식별이 가능하고, 공간적, 후생유전체적, 전사 정보의 신뢰성 있는 통합을 보장합니다.

이 연구에서는 Trekker 기반 바코드 입력 방식과 단일 세포 CUT&Tag 멀티옴 분석법의 실행 가능성을 입증했으나, 설명된 접근법에도 한계가 있습니다. 예를 들어, 이 방법은 현재 신선한 냉동 조직에 한정되어 있으며, 생물학적 복제 없이 단일 조직 유형(마우스 뇌)에서 단일 히스톤 변형(H3K27ac) 프로파일링에만 그 실현 가능성이 입증되었습니다. 더불어, 이 접근법은 두 개의 독자적인 상업용 플랫폼(Takara Trekker와 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome)에 의존합니다. 이 기술의 광범위한 적용 가능성, 성능, 일반화 가능성 및 재현성을 평가하기 위해서는 다양한 조직 유형과 추가적인 후생유전학적 표지에 대한 추가 평가가 필요합니다.

요약하자면, 여기서 제시된 공간적 Trekker–CUT&Tag 멀티옴 프로토콜은 후생유전체와 전사체 특징의 공간적으로 해상도된 단일 세포 공동프로파일링이 가능함을 입증합니다. 공간 바코딩과 기존 단일 세포 다중종 화학을 결합함으로써, 온전한 조직 구조 내에서 유전자 조절의 메커니즘 연구를 가능하게 하며, 미래 공간 생물학 응용을 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 주목할 만한 잠재적 용도로는 특정 세포 유형에서 유전자 발현의 후생유전학적 조절에 미치는 다양한 실험적 및 환경 자극의 영향 평가가 있습니다. 예를 들어, 신경 자극의 효과를 중추 및 말초신경계의 특정 뉴런 유형에서 분석하거나, 침윤하는 전염 및 항염증 면역 세포가 염증성 질환과 암에서 인근 세포에 미치는 영향을 밝힐 수 있습니다.