본 연구는 네트워크 약리학과 생체 내 실험을 통합하여 전립선염 치료에 유귀 알약의 잠재적 효과를 조사합니다. 네트워크 약리학 분석과 쥐 전립선염 모델에서의 YGP 치료는 YGP의 치료 효과가 염증 반응 조절과 연관될 수 있음을 시사하며, YGP가 전립선염에서 항염증 효과를 발휘함을 시사합니다.
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본 연구는 네트워크 약리학과 생체 내 실험을 통합하여 전립선염 치료에 유귀 알약의 잠재적 효과를 조사합니다. 네트워크 약리학 분석과 쥐 전립선염 모델에서의 YGP 치료는 YGP의 치료 효과가 염증 반응 조절과 연관될 수 있음을 시사하며, YGP가 전립선염에서 항염증 효과를 발휘함을 시사합니다.
전립선염은 치료법이 제한적인 흔한 비뇨기과 질환입니다. 유귀 알약(YGP)은 특히 염증 관련 질환에서 잠재적 치료적 가치를 보여주고 있습니다. 이 연구는 그 효과를 평가하고 가능한 기전을 탐구하는 것을 목표로 했습니다. YGP의 활성 성분은 경구 생체이용률(OB ≥ 30%)과 약물 유사성(DL ≥ 0.18) 기준을 사용하여 TCMSP에서 선별하고, 해당 표적을 수집하였다. 전립선염 관련 표적은 GeneCards에서 얻었고, 겹치는 표적은 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크와 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 풍부화를 통해 분석되었습니다. 총 126개의 활성 화합물과 208개의 잠재적 표적이 확인되었으며, 이 중 180개의 중복 표적이 전립선염과 연관되어 있습니다. PPI 분석에서 TP53, IL6, AKT1, TNF, IL1B가 핵심 허브 유전자임이 확인되었습니다. KEGG 농축은 IL-17, TNF, MAPK, PI3K-Akt 신호 전달 경로 등 염증 관련 경로의 관여를 시사하였다. 전립선염의 쥐 모델은 전립선 내 카라기난 주사를 통해 확립되었습니다. 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)와 인터루킨-6(IL-6)의 조직학적 검사 및 측정이 수행되어 치료 효과를 평가하였다. YGP 치료는 전립선 조직병리학을 개선하고 단백질과 mRNA 수치에서 TNF-α 및 IL-6 수치를 감소시켰습니다. 이 발견들은 YGP가 전립선염에서 항염증 효과를 발휘한다는 것을 시사하지만, 구체적인 분자 기전은 아직 검증되지 않았습니다.
전립선염은 전립선이 염증을 일으키고 붓고 자극받는 상태입니다. 전 세계 비뇨기과 임상 진료의 약 25%를 차지합니다2. 국립보건원(NIH)은 전립선염을 네 가지 분류로 분류했습니다: 급성 세균, 만성 세균, 만성 전립선염/만성 골반통 증후군(CP/CPPS), 그리고 무증상 전립선염3. 이 중 CP/CPPS가 가장 흔한 형태이며 지속적인 염증과 면역 조절 장애와 밀접한 관련이 있습니다. 전립선염의 염증성 이해가 진전되었음에도 불구하고, 현재 치료 전략은 특히 비박테리아 아형에 대해 제한적입니다 4,5. 항생제는 임상 실무에서 흔히 사용됩니다; 그러나 비세균성 전립선염에서의 효능은 매우 논란이 많습니다. α 차단제부터 비스테로이드성 소염제(NSAIDs)에 이르기까지 다양한 치료법들은 주로 증상 완화를 목표로 하지만, 종종 위장 장애, 기립성 저혈압 등의 위험이 무시할 수 없는 최적 결과를 보입니다 7,8,9,10. 이러한 한계는 전립선염에서 염증을 효과적으로 조절할 수 있는 대체 치료법의 필요성을 강조합니다.
전통 중의학(TCM)은 더 나은 안전성과 내약성 프로필을 가진 더 넓은 치료적 이점을 제공할 수 있습니다. 유귀 알약(YGP)은 경월 전서에 기록된 고전적 공식으로, 수세기 동안 신양을 보충하고 관련 질환을 완화하는 데 경험적으로 사용되어 왔습니다12. 이전 연구들은 일부 성분이 항염증 활성을 가지고 있다고 보고했습니다 13,14,15,16. 임상 증거는 YGP가 전립선염 증상을 효과적으로 완화할 수 있음을 시사하지만, 그 근본 기전은 아직 명확하지 않습니다. 네트워크 약리학은 시스템 생물학과 약리학을 결합하여 전통 의학의 복잡한 메커니즘을 밝히는 강력하고 통합적인 접근법입니다. YGP가 여러 표적과 염증 관련 경로를 조절함으로써 항염증 효과를 발휘할 수 있다는 가설이 제기되었습니다. 이러한 예측은 카라기난 주사로 전립선염을 유도하는 생체 내 전립선염 모델을 통해 추가로 평가되었습니다. 모델 구축 후, 동물들은 YGP로 처리되었습니다. 전립선 조직은 헤마톡실린 및 이오신(HE) 염색을 통해 조직병리학적 검사를 위해 수집되었으며, 효소 연쇄 분석법(ELISA) 및 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)을 통한 염증 표지자의 정량 평가를 위해 수집되었습니다.
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모든 동물 실험은 베이징 중의대학 기관동물 관리 및 이용 위원회(BUCM-2024110107-4103)의 승인을 받았습니다.
활성 구성원 및 목표 수집
YGP는 레만니아 글루티노사, 아코니툼 카르미카엘리, 시나모뭄 카시아, 디오스코레아 오포시타, 코르누스 오피시나리스, 쿠스쿠타 치넨시스, 엔젤리카 시넨시스, 유코미아 울모이데스, 세르비 코르누스 콜라, 그리고 라이시움 바르바룸으로 구성되어 있습니다. 이 약초명들은 전통 중의학 시스템의 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP)에 입력되어 화합물을 검색했습니다. 활성 화합물은 경구 생체이용률(OB ≥ 30%)과 약물 유사성(DL ≥ 0.18) 기준19, 20, 21을 사용하여 선별하였다. 각 화합물의 해당 표적은 TCMSP에서 얻었으며, UniProt 데이터베이스를 사용해 유전자 심볼로 표준화하였습니다. 전립선염 관련 표적은 GeneCards 데이터베이스에서 "전립선염"이라는 키워드를 사용해 검색했으며, 평균보다 높은 관련성 점수를 가진 유전자를 연구에 포함하도록 선정하였습니다.
전립선염에 대한 YGP 조절 네트워크 구축
YGP 관련 표적과 전립선염 관련 표적 간의 교차점이 잠재적 치료 표적 집합으로 식별되고 정의되었습니다. 이 표적들은 Cytoscape(버전 3.9.1)에 도입되어 복합물-표적-질병 네트워크를 구축했습니다. 네트워크 토폴로지 분석은 CytoHubba 플러그인을 사용하여 수행되었으며, 최대 클리크 중심성(MCC) 값22를 기반으로 주요 구성 요소를 식별하였습니다.
단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석
겹치는 표적들은 STRING 데이터베이스(버전 11.5)에 임포트되었으며, 생물체는 호모 사피엔스로 설정되었습니다. 최소 필요한 상호작용 점수는 ≥ 0.7로 설정되었고, 연결이 끊긴 노드는23번으로 숨겨져 있었습니다. 상호작용 데이터는 TSV 형식으로 내보내져 Cytoscape에서 시각화되었습니다. 허브 유전자는 CytoHubba 플러그인을 통해 정도 중심성을 기반으로 추가로 확인되었습니다.
KEGG 경로 및 GO 농축 분석
공유된 표적들은 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 경로 분석을 위한 메타스케이프 플랫폼에 업로드되었습니다. 입력 및 분석 종은 호모 사피엔스로 설정되었습니다. KEGG 경로 농축 분석이 수행되었습니다. 경로는 출판된 문헌과 데이터베이스 주석에 의해 전립선염과의 관련성을 기준으로 추가로 필터링되었습니다. 나머지 경로들은 로그 P 값에 따라 순위가 매겨졌습니다. 상위 농축된 KEGG 경로는 버블 플롯을 사용해 시각화되었습니다.
분자 도킹
주요 표적은 정도 중심성을 기반으로 PPI 네트워크에서 선정되었고, 활성 화합물은 MCC 값을 기반으로 YGP-전립선염 조절 네트워크에서 확인되어 이후 도킹 분석을 수행하였습니다. 단백질 구조는 AlphaFold 단백질 구조 데이터베이스에서 PDB 형식으로 얻었고, 리간드 구조는 TCMSP에서 mol2 형식24로 다운로드되었습니다. 분자 도킹은 CB-Dock2 온라인 플랫폼25를 사용하여 수행되었습니다. 도킹 전에는 단백질 구조가 자동으로 전처리되어 물 분자를 제거하고 수소 원자를 추가하며 누락된 잔기를 완성했습니다. 결합 친화도를 기록하고 GraphPad Prism(버전 10.1.2)을 사용해 히트맵을 생성했습니다. Vina 점수가 가장 낮은 리간드-단백질 복합체의 3차원 구조는 ChimeraX를 사용해 시각화되었고, LigPlus를 사용해 2차원 상호작용 다이어그램을 생성했습니다.
YGP 수성 추출물 제제
YGP의 허브 성분은 전통적인 조제 비율에 따라 조제되었으며, 여기에는 가공된 레만니아 글루티노사(Shudihuang) 뿌리 24g, Aconitum carmichaelii(Fuzi) 가공 측근 6g, 계피나무 카시아(Rougui) 껍질 6g, Dioscorea opposite (Shanyao) 12g, Cornus officinalis(Shanzhuyu) 9g 등이 포함됩니다. Cuscuta chinensis 씨앗 12g(Tusizi), Cervi Cornus Colla(루자오자오) 가공 사슴뿔젤라틴 12g, Lycium barbarum(Gouqi) 열매 12g, Angelica sinensis 뿌리(당귀) 9g, Eucommia ulmoides 나무껍질 12g(Duzhong) 등이 포함됩니다. 아코니툼 카르미카엘리와 세르비 코르누스 콜라를 제외한 모든 허브는 총 무게의 6배 증류수에 30분간 담갔고, 아코니툼 카르미카엘리는 각각 증류수 무게의 6배에 따로 담갔습니다. 아코니툼 카르미카엘리(Aconitum carmichaelii)는 먼저 전기 가열기로 1시간 동안 절제한 후, Cervi Cornus Colla를 제외한 나머지 허브들을 추가하여 각 주기마다 1시간씩 두 번 각각 차단했습니다. Cervi Cornus Colla는 이후 60–70°C의 물욕에서 완전히 녹여 추출물에 혼합되었다. 냉각 후, 증빙액은 이중층 거즈로 걸러져 알리오트를 한 뒤 -20 °C에서 48시간 냉동한 후 동성식품으로 가루 추출물을 얻었다.
동물 모델 및 실험 설계
수컷 스프래그-도울리 쥐(8주, 200–220g)는 특정 병원체가 없는 환경에서 12시간의 빛과 어둠 주기, 그리고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 환경에서 사육되었습니다. 1주일 적응 후 쥐는 무작위로 세 그룹(n=6개)으로 나뉘었습니다: 대조군, 모델군, 그리고 YGP 그룹. 만성 전립선염은 3% 카라기난 용액의 전립선 내 주사로 유도되었다26. 간단히 말해, 쥐들은 유도 시 3–4%, 유지 시 1.5–2% 이소플루란으로 마취를 했고, 전립선을 노출시키기 위해 복부 중앙 절개를 했습니다. 전립선 각 복엽에 총 25 μL 3% 카라기난 용액을 주입하였습니다. 대조군은 전립선 내 생리식염수(생리식염수)만 주사를 받았습니다. 수술 후 페니실린(2.5 ×10 5 U/kg)은 3일간 근육 주사로 투여되었습니다.
YGP 동염 추출 분말을 추출하여 0.9% 멸균 생리식염수에서 재구성하여 구강 개고지에 대한 균일한 현탁액(10.54 g/kg/day)을 얻었습니다. YGP 그룹의 쥐들은 YGP 추출물(10 mL/kg)을 경구 투여받았고, 대조군과 모델군은 0.9% 멸균 생리식염수에 해당하는 용량을 투여받았습니다. 4주 후, 쥐들은 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg, 복막 내 주사)으로 마취되었고, 윤리 지침에 따라 희생된 후 전립선 조직을 채취했습니다.
조직병리학적 검사
전립선 조직은 4% 파라포름알데히드에 24시간 고정되고, 등급별 에탄올(알코올 75% 4시간, 알코올 85% 2시간, 알코올 90% 2시간, 알코올 95% 1시간, 절대 에탄올 1시간)으로 탈수되었으며, 자일렌으로 정화한 후 파라핀에 박혀 있습니다. 4–5 μm 단면들은 표준 절차27에 따라 HE 염색을 했습니다. 간략히 절편은 탈파라핀, 재수화, 헤마톡실린으로 염색, 분화 및 에오신으로 카운터 염색을 했습니다. 탈수 및 장착 후, 절편은 조직병리학적 평가를 위해 광학 현미경으로 관찰되었습니다.
조직병리학적 염증은 염증 세포 침윤, 섬유아세포 증식, 아시나르 형태, 분비 상태를 기반으로 한 반정량적 점수 체계를 사용하여 평가하였다. 염증성 세포 침윤은 0점(침윤 없음), 2점(경미한 침윤), 4점(중등도 침윤), 6점(심한 침윤)으로 점수를 받았습니다. 섬유아세포 증식은 0(부재), 1(경미), 2(중등도), 3(중증)으로 평가되었습니다. 원추 형태는 0(대액 내강), 1(중간 정도 감소한 내강 크기), 2(현저히 감소한 내강 크기), 3(원추 폐쇄 또는 소멸)로 평가되었습니다. 분비 상태는 0점(분비량 풍부), 1점(중간 정도 분비), 2점(분비량 부족), 3점(분비 없음)으로 평가되었습니다. 총 조직병리학 점수는 네 가지 매개변수의 합으로 계산되었으며, 점수가 높을수록 전립선 조직 손상과 염증이 더 심각함을 나타냈다28.
엘리사
전립선 조직(100mg)은 얼음처럼 차가운 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 헹구고, 프로테아제 억제제를 보완한 용해 완충제에서 균질화하였습니다. 호모제네이트는 4°C에서 30–120분간 배양하고, 5000 × g 에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 상원액을 수집했습니다. TNF-α와 IL-6의 단백질 농도는 제조사 지침에 따라 ELISA 키트를 사용해 측정되었습니다. 표준과 샘플은 96웰 플레이트에 추가되어 37°C에서 배양한 후, 비오티닐화 항체와 효소 접합체로 순차적으로 배양했습니다. 세척 후에는 기질 용액을 추가하여 색 현상을 진행하고, 반응은 스톱 용액으로 종료되었습니다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm 거리에서 흡광도를 측정했습니다. 사이토카인 농도는 표준 곡선을 기반으로 계산되었습니다.
qRT-PCR
총 RNA는 컬럼 기반 방법으로 전립선 조직에서 추출되었으며, 순도를 평가하기 위해 260 nm와 280 nm 흡광도를 측정하여 정량화하였습니다. RNA 샘플은 역전사 키트를 사용해 42°C에서 15분간 cDNA로 역전사되었습니다. qRT-PCR은 다음 조건에서 열사이클러를 사용하여 수행되었습니다: 95°C에서 초기 변성은 3분간 진행하고, 이어서 95°C에서 10초, 60°C에서 30초간 40주기를 수행했습니다. 본 연구에서 사용된 프라이머 서열은 보충 표 1에 나열되어 있습니다. 어닐링/확장 단계에서 형광 신호가 수집되었습니다. TNF-α와 IL-6의 발현 수준은 내부 참조 유전자 GAPDH로 정규화되었습니다. 상대 유전자 발현은 2−ΔΔCt 방법으로 계산되었습니다.
통계 분석
모든 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시됩니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 10.1.2)를 사용하여 수행되었습니다. 분석 전에 정규성 분포를 평가하였다. 여러 그룹 간 차이는 일방향 분산분석(ANOVA)을 사용한 후 Tukey의 사후 검정을 통해 다중 비교를 수행하였습니다. p < 0.05 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
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생체 활성 성분 및 표적 유전자 식별
기준을 충족하는 YGP 내 생물활성 성분 총 126개(OB ≥ 30%, DL ≥ 0.18)가 확인되었습니다. 예측된 표적 유전자 208개에 해당합니다. GeneCards 데이터베이스에서는 전립선염과 관련된 9,845개의 유전자가 발견되었습니다. 벤 분석 결과 YGP가 예측한 표적과 전립선염 관련 유전자 사이에 180개의 중복 유전자가 발견되어, 이 공유 표적이 YGP의 전립선염 치료 효과를 매개할 수 있음을 시사합니다(그림 1). 허브 성분별 분포(괄호 안의 값은 각 허브별로 확인된 성분 수를 나타냅니다)는 다음과 같았습니다: Angelica sinensis (3), Eucommia ulmoides (26), Aconitum carmichaelii (7), Lycium barbarum
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전립선염은 전립선 실질(중엽) 내에 염증 세포가 증가하는 것으로 병리학적으로 정의됩니다28,29. 500만 명 이상의 한국 남성을 대상으로 9년간 추적한 연구에서, Kim 등은 다변량 분석을 통해 전립선염이 전립선암 발병 위험을 크게 높인다는 것을 확인했습니다30. 그러나 현재 임상 관리는 제한적이며, 특히 비세균성 전립선염에서는 치료 옵션이 여전히 최적이 아니기 때문입니다 31,32. 이러한 맥락에서 식물치료적 중재는 항염증 특성과 비교적 우수한 안전성 프로필로 인해 점점 더 주목받고 있습니다. 본 연구에서 퀘르세틴은 네트워크 약리학 분석을 통해 YGP에서 핵심 활성 화합물 중 하나로 확인되었으며, 이는 염증
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저자들은 이 연구에서 이해 상충이 없다고 보고했습니다.
저자들은 중앙대학 기초 연구 기금(2022-JYB-JBZR-037)으로부터 재정 지원을 제공해 주신 것에 깊이 감사드립니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4% 파라포름알데히드 | 비요타임 | P0099-3L | |
| 알파폴드 단백질 구조 데이터베이스 | 알파폴드 단백질 구조 데이터베이스 | https://alphafold.ebi.ac.uk/ | |
| BeyoFast SYBR 그린 qPCR 믹스 (2배) | 비요타임 | D7260 | |
| 생물정보학 온라인 플랫폼 | 생물정보학 온라인 플랫폼 | http://www.bioinformatics.com.cn/ | |
| 카라기난 | 오리리프 | S30559 | |
| CB-독2 | CB-독2 | http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php | |
| 사이토스케이프 | 사이토스케이프 | https://cytoscape.org/ | |
| 유전자 카드 | 유전자 카드 | https://www.genecards.org/ | |
| 헤마톡실린과 이오신(H& E) 염색 키트 | 비요타임 | C0105S | |
| 메타스케이프 | 메타스케이프 | https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1 | |
| 중성 발삼 | 서비스바이오 | WG10004160 | |
| 파라핀 왁스 (임베딩용) | 서비스바이오 | RP-15 | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 (100X) | 에피자임 | GRF101 | |
| 쥐 IL-6 ELISA 키트 | 비요타임 | PI328 | |
| 쥐 TNF-&α; 유니폼 | 베이징 4A 바이오테크 주식회사 | CRE0003 | |
| RNAeasy 동물용 롱 RNA 분리 키트 스핀 컬럼 포함 | 비요타임 | 그리고 nbsp; R0026 | |
| 스트링 | 스트링 | https://string-db.org/ | |
| TCMSP | TCMSP | https://www.tcmsp-e.com/#/database | |
| 유니프로트 | 유니프로트 | https://www.uniprot.org/ |