마우스 피질의 심층 경두개골 영상을 위한 헤드 마운트 광학 투명 두개골(HOTS) 창

요약

이 프로토콜은 최적화된 2단계 두개골 청소 절차를 기반으로 한 헤드마운트 광학 투명 두개골(HOTS) 창을 설명합니다. 이 접근법은 매우 투명한 두개골을 만들어 성체 쥐 대뇌 피질을 최대 ~800 μm 깊이까지 2광자 영상화할 수 있게 합니다.

초록

성체 쥐 대뇌 피질의 고해상도 2광자 영상은 두개골에서 나오는 빛 산란으로 인해 신호가 약화되고 생체 내 영상 깊이가 제한되어 심각하게 제한됩니다. 두개골 청소 방법이 온전한 두개골을 통해 피질에 광학적 접근을 가능하게 하는 방법이 개발되었지만, 제한된 청소 시간과 최적의 제거 칵테일로 인해 실용적인 성능이 제한됩니다. 여기서는 헤드마운트 광학 투명 두개골(HOTS) 창을 구현하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방식에서는 머리에 장착된 모자를 사용해 두개골 위에 정화 용액을 유지함으로써 장기간 마취나 신체적 제약을 피하고, 깨어 있을 때 자유롭게 행동하는 쥐가 몇 시간 동안 두개골을 정리할 수 있게 되었습니다. 추가로, 시약(HOTS-S1: 10% wt/v EDTA, 15% wt/v D-만노스, 10% wt/v 설폴란, 0.5% wt/v Tween 20; HOTS-S2: 70% wt/v D-만노스, 5% wt/v 설폴란, 0.5% wt/v 트윈 20) 체계적 화학적 스크리닝을 통해 최적화됨. 두개골 노출 및 안정화, 머리 장착 캡 제작 및 장착, 투명 시약의 전달 및 재충전, 그리고 이후 영상 촬영 준비를 포함한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 6주 된 쥐(~20g)에서 HOTS 프로토콜은 피아(pia) 아래 최대 ~800 μm 깊이까지 2광자 이미징을 지원하는 매우 투명한 두개골을 일상적으로 생성하며, 개방형 두개골 창에 근접하는 성능에 근접합니다. HOTS 윈도우는 Thy1-GFP-M 마우스에서 구조적 이미징을, Thy1-GCaMP6s 마우스에서 기능성 칼슘 이미징을 가능하게 합니다. 우리는 편리하고 최소 침습적인 접근법으로서 HOTS 창이 심부 경두개골 영상과 광유전학, 광약리학 및 기타 빛 기반 조작을 생 체 내에서 크게 촉진할 것이라고 믿습니다.

서론

피질 신경세포의 생체 내 모니터링은 뇌 구조와 기능을 이해하는 데 필수적입니다^. 2광자 현미경(TPM)은 이러한 생체 내 연구의 핵심 도구입니다 ^2,3. 하지만 불투명한 두개골에서 나오는 강한 빛 산란으로 인해 영상 품질과 깊이가 심각하게 제한^됩니다.

개방형 두개골⁶과 얇아진 두개골 창 ^7,8은 피질에 대한 광학 접근을 크게 개선하며 널리 사용되고 있지만, 두 방법 모두 본질적인 한계가 있습니다. 개방 두개골 창은 급성 뇌 손상과 염증 반응을 유발할 수 있으며,^두개골 얇아짐은 기술적으로 까다롭고 균일한 두께를 달성하기 어렵습니다^11,12.

생체 내 두개골 광학 클리어 기법은 성체 마우스에서 축삭 해상도로 2광자 영상을 가능하게 하는 최소 침습적 대안을 제공합니다. 하지만 달성 가능한 영상 깊이는 제한적입니다(일반적으로 PIA 아래 150–400 μm 지점)12,13,14,15. 실제로 두개골 클리어는 보통 마취 하에서 단단한 머리 고정 상태에서 짧은 시간 내에 제한되며, 두개골 골 구성에 대한 클리어링 칵테일의 체계적 최적화는 아직 탐구되지 않았습니다^{12, 13, 14, 15}.

이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 이전에 자유롭게 행동하는 쥐에서 장시간 오프라인 두개골 정리를 지원하는 헤드마운트형 광학 투명 두개골(HOTS) 창을 개발했습니다(그림 1A)¹⁶. 이 접근법은^{이전 연구}16에서 체계적인 화학 스크리닝을 통해 최적화된 시약(S1 및 S2)을 이용한 2단계 클리어 절차를 사용합니다. 클리어링 시약의 체계적 최적화와 HOTS 윈도우의 클리링 효능, 가역성, 생체 안전성, 생 체 내 영상 성능의 특성 규명은 이전 연구¹⁶에서 보고되었으며, HOTS 처리 후 긍정적인 인상교세포 반응도 입증되었습니다. 여기서는 성체 쥐에서 심층 경두개골 2광자 영상을 가능하게 하는 HOTS 창을 설정하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 대표적인 준비 과정에서 영상 깊이는 pia 아래 ~800 μm까지 도달하며, 이는 개폐 두개골 창으로 달성할 수 있는 깊이와 거의 일치합니다. HOTS 윈도우는 Thy1-GFP-M 마우스에서 심층 구조 영상을, 깨어 있는 Thy1-GCaMP6s 마우스에서 기능성 칼슘 영상을 가능하게 합니다.

프로토콜

모든 동물 관리 및 실험 절차는 광둥성 동물 관리 및 이용위원회의 승인을 받았으며, 중국과학원 선전첨단기술연구소 동물실험윤리위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

참고: 이 프로토콜은 두개골 두께가 약 100 μm인 6주 된 쥐(체중 ~20g)에 최적화되어 있습니다.

1. 두개골 제거 용액 준비

1. 두개골 정리 용액 S1 (10% wt/v EDTA, 15% wt/v D-만노스, 10% wt/v 설폴란, 0.5% wt/v Tween 20; RI: 1.38; 최종 pH: 7.0-7.4)
   1. 수산화나트륨(NaOH) 0.35g 무게를 주세요. 비커에 20mL 탈이온수에 넣고 완전히 녹을 때까지 저어줍니다. 이로 인해 용액의 pH가 올라가 EDTA의 후속 용해가 촉진됩니다.
      참고: NaOH는 부식성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험복, 안구 보호구)를 착용하고 화학 훈기 후드에 넣어 다루세요.
   2. NaOH 용액에 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 4g을 첨가합니다. 비커를 40°C 물에 넣고 EDTA가 완전히 녹을 때까지 계속 저어줍니다.
   3. 혼합물을 실온까지 식힙니다. 용액에 D-만노스 6g, 설폴란 4g, Tween 20 0.2g을 추가합니다. 모든 성분이 완전히 녹을 때까지 실온에서 저어줍니다.
   4. 탈이온수를 넣어 최종 부피를 40mL로 만듭니다. S1을 얻기 위해 충분히 섞으세요.
      참고: S1은 상온에서 몇 달간 보관할 수 있습니다.
2. 두개골 정화 용액 S2 준비 (70% wt/v D-만노스, 5% wt/v 설폴란, 0.5% wt/v 20 Tween 20; 최종 RI: 1.44; 최종 pH: 7.0-7.4)
   1. D-만노스 28g, 설폴란 2g, Tween 20 0.2g을 무게로 젬어 깨끗한 비커에 옮기세요.
   2. 약 30mL에 탈이온수를 넣고 상온에서 모든 성분이 완전히 녹을 때까지 저어줍니다.
   3. 탈이온수를 추가하여 최종 부피를 40mL로 만들고 충분히 혼합하여 S2를 얻습니다.
      참고: 부드러운 가열(25–30 °C)과 지속적인 교반은 D-만노스의 용해를 가속화합니다. S2는 상온에서 몇 달간 보관할 수 있습니다.

2. 수술 준비

1. 모든 수술 기구를 오토클레이브하고 작업 공간을 75% 알코올로 철저히 소독하세요.
2. 복강내 주사로 1% (w/v) 펜토바르비탈나트륨(체중 20g당 150–200 μL)을 투여하여 마취합니다.
   참고: 다른 가역적 마취제도 펜토바르비탈 나트륨의 대체제로 사용될 수 있습니다.
3. 발가락 꼬집기 반사 검사를 통해 마취 깊이를 모니터링하고, 수술 시작 전에 쥐가 완전히 마취되었는지 확인하세요.
4. 마우스를 입체 프레임에 넣고 귀 막대로 머리를 고정하세요.
5. 온열 패드를 사용해 체온을 37°C로 유지하세요.
6. 각막 건조를 막기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르세요.
   참고: 마취 과다복용과 호흡 억제를 방지하기 위해 호흡과 반사 신경을 면밀히 관찰하세요.

3. 수술 및 헤드플레이트 장착

1. 두개골 노출 및 세척 (그림 1Ba)
   1. 가늘게 쓰는 겸자와 수술용 가위를 사용해 등 두개골 전체를 제거하세요. 측두근 가장자리를 드러내고 목 근육 쪽으로 뒤쪽으로 피부를 다듬으세요.
   2. 가는 겸자를 사용해 두개골 표면에서 골막을 부드럽게 제거하세요.
   3. 촉촉한 면촉 어플리케이터로 두개골 표면을 닦고 부드러운 바람으로 두개골을 말리세요.
   4. 대뇌 피질의 기능 영역을 정밀하게 위치시키려면 입체정관 장치를 사용해 두개골 표면에 1mm 간격의 기준점을 표시하세요.
2. 치과용 시멘트 및 헤드플레이트 적용 (그림 1Bb)
   1. 제조사의 지침에 따라 치과용 시멘트를 준비하세요. 안정적인 부착을 위해 접착력이 강하고 내구성이 좋은 치아 시멘트를 장기간 고정에 적합하게 하는 것이 권장됩니다.
   2. 노출된 두개골 표면과 주변 조직에 얇은 치과 시멘트를 발라주고, 클리어링 창 부위는 코팅하지 않고 유지하세요.
      참고: 치과용 시멘트의 분말과 액체 성분을 1:1 부피 비율로 혼합한 후, 시멘트가 이숅이 끝에 달라붙을 때까지 약 10초를 기다린 후 적용하세요. 이로 인해 차량의 유연성이 줄어들고 핸들링이 향상됩니다. 시공 시, 주변 부분에서 지정된 클리어 창 쪽으로 시멘트를 발라주고, 창문 부분은 시멘트를 완전히 없게 유지하세요. 치유 부위는 두개골 표면의 치과 실란트(치아 시멘트 및 부드러운 라이너 재료) 경계에 의해 정의됩니다. 따라서 크기는 조절할 수 있지만, 두개골 봉합사나 모자의 크기에 의해 제한됩니다. 한 반구에서 일반적으로 적용할 때, 제거된 영역은 보통 지름 ~3–5mm입니다.
   3. 치과용 시멘트를 사용해 두개골에 고정하는 작은 티타늄 헤드플레이트(이후 영상 촬영 시 맞춤 고정용 헤드 홀더)를 고정합니다.
      참고: 헤드 고정에는 다양한 헤드플레이트 디자인이 적용될 수 있습니다. 이 연구에서는 상업적으로 구할 수 있는 헤드플레이트와 맞춤형 2홀 티타늄 플레이트가 모두 성공적으로 사용되었습니다. 설계와 상관없이, 헤드플레이트는 이후 촬영을 위한 충분한 기계적 안정성을 제공해야 하며, 의도한 클리어링/촬영 창을 방해해서는 안 됩니다.

4. HOTS 창 생성

1. 두개골을 자기 경화 치아 연성 라이너로 밀봉하세요 (그림 1Bc)
   1. 치과 시멘트가 약 5분간 완전히 경화된 후, 클리어링 윈도우 부분을 제외한 시멘트 층을 얇게 자기 경화 치아 연질 라이너 재질로 덮어 두개골 위에 연속적인 밀봉을 만듭니다.
      참고: 부드러운 라이너 재질은 밀봉을 개선하고 클리어링 시약에 장기간 노출될 때 누수를 줄여줍니다.
   2. 자가 경화 치아용 소프트 라이너 재료를 계획된 투명 창문 가장자리 주변에 부드럽게 성형하여 캡을 위한 평평한 밀봉면을 만듭니다.
2. 캡 장착 (그림 1Bd)
   1. 일회용 플라스틱 피펫(폴리에틸렌, PE)의 머리를 잘라서 뚜껑이 닫힌 상단과 하단이 열린 작은 원통형 캡을 만듭니다. PE는 우수한 화학적 안정성을 보이며, 투명화 과정에서 S1 또는 S2 정화 용액과의 눈에 띄는 분해나 반응이 없습니다.
      참고: 1 mL 전사 피펫 전구의 머리에서 잘라낸 캡은 일반적으로 지름 ~12mm, 높이 ~10–14 mm입니다.
   2. 캡을 지정된 클리어 윈도우 위에 올려놓고 부드러운 라이너 재질에 부드럽게 눌러주세요.
      참고: 모자가 클리어된 부위보다 크며, 클리어된 부위에 사용하지 않는 두개골 아래 부분은 치과 실란트로 시바를 통해 두개골이 클리어되는 것을 방지할 수 있습니다.
   3. 캡을 바닥 주변에 부드러운 라이너 소재로 고정하여 캡과 두개골 사이의 접합부가 완전히 밀봉되도록 하세요.
   4. 1mL 주사기와 26G 바늘을 사용해 캡 벽에 하나 이상의 작은 구멍을 뚫어 주입 및 제거액 추출을 위한 포트 역할을 합니다.
   5. 부드러운 라이너 소재가 완전히 경화되도록 하세요. 캡이 단단히 고정되어 있고 인터페이스에 보이는 빈틈이 없는지 확인하세요.
   6. 마우스를 입체성 프레임에서 꺼내 마취에서 완전히 회복할 때까지 따뜻한 케이지에 넣으세요.
      참고: 이 지점은 적절한 정차 지점입니다. 치과 시멘트와 부드러운 라이너 재료가 완전히 경화된 후에 두개골 클리어 시술을 시행하세요. 저희 병원에서는 HOTS 창을 오후에 설치하고, 수술에서 완전히 회복한 다음 날 아침 두개골 정리를 진행합니다. 또는 HOTS 창문 설치 후 약 15분 후에 두개골 정리를 시작할 수도 있습니다. HOTS 창문 설치 시에는 두개골이 구조적으로 온전하게 유지되지만 골막은 제거됩니다.

5. 깨어 있는 자유롭게 행동하는 쥐의 두개골 청소

참고: 정리 단계 동안 쥐는 깨어 있고 집 우리 안에서 자유롭게 행동합니다. 용액 주입과 헤드 마운트 캡을 통한 교환 시에만 짧은 이소플루란 마취를 사용하세요.

1. S1의 초기 부하
   1. 마우스를 유도 챔버에 넣고 3–4% 이소플루란을 공기 중 300–500 mL/분의 유량으로 짧은 마취를 유도하여 마우스가 움직이지 않을 때까지 진행합니다. 유지 마취는 하지 않았습니다.
   2. 마우스를 부드럽게 고정하고 손으로 헤드마운트 캡을 안정시키세요.
   3. 1mL 주사기와 26G 바늘을 사용해 약 1mL의 S1을 천천히 헤드 마운트 캡에 주입하세요.
   4. 쥐를 홈 케이지로 돌려보내고 S1이 두개골에 2시간 동안 작용하도록 하세요.
      참고: S1과 S2 부화 기간 동안에는 쥐를 개별적으로 표준 케이지에 넣어 보관하세요.
2. 신선한 시즌 1
   1. 초기 S1 로딩 후 2시간 후에 아이소플루란으로 다시 잠시 마취합니다.
   2. 캡에서 1mL 주사기로 S1을 흡인하세요.
   3. 1mL 주사기로 신선한 S1을 채우세요.
   4. 마우스를 다시 케이지로 돌려놓고 S1이 2시간 더 행동하도록 하세요.
   5. 초기 부하 4시간 후에 5.2.1–5.2.4 단계를 반복하여 두 번째 S1 교체를 수행합니다.
   6. 두 번째 치환 후에는 S1이 총 노출 시간인 6시간에 도달할 때까지 계속 작용하도록 두세요.
      참고: 이 프로토콜(1 mL S1 6시간)은 6주 된 쥐(~20g)에 최적화되어 있습니다. 두꺼운 두개골을 가진 나이 든 동물의 경우 S1 잠복 기간이 점진적으로 길어질 수 있습니다. 모든 조정은 동물 복지와 최종 영상 품질을 면밀히 모니터링하여 두개골 부드럽게 변하지 않도록 해야 합니다.
3. S2의 적용
   1. S1 치료 6시간 후에는 잠시 이소플루란으로 마취하세요.
   2. 캡에서 1mL 주사기로 S1을 흡입한 후 0.7mL S2로 교체하세요.
   3. 마우스를 다시 케이지로 돌려놓고 S2가 두개골에 1시간 동안 작용하게 하여 투명도를 높이고 굴절률 매칭을 제공합니다.
      참고: 이러한 조건에서 S1과 S2의 합산 정화 단계는 보통 7시간 이내에 완료됩니다(6시간 S1 + 1시간 S2). 성공적인 제거는 출혈 없이 투명한 두개골 표면으로 표시됩니다. 정화 후 두개골이 약간 부드러워질 수 있습니다; 미세한 겸자로 부드럽게 만지면 약간의 순응성을 보이지만 구조적으로는 온전해야 합니다. 두개골 표면에 과도한 압력을 가하지 않도록 하세요.

6. 영상 준비

1. 영상 촬영을 위한 마취 및 머리 고정
   1. S2 인큐베이션 종료 시, 체중 20g당 150–200 μL 용량의 1%(w/v) 펜토바르비탈 나트륨을 복막 내 주사로 마취합니다.
   2. 발가락 꼬집는 반사 검사로 적절한 마취를 확인하세요.
   3. 타이타늄 헤드플레이트를 맞춤 제작된 헤드 홀더에 나사로 고정해 마우스 헤드를 고정하세요.
   4. 영상 촬영 중 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르세요.
   5. 온열 패드를 사용해 체온을 ~37 °C로 유지하세요.
2. 투명해진 두개골 표면 노출 (그림 1Be, Bf)
   1. 주사기로 캡에서 S2 용액을 흡입하세요.
   2. 플라스틱 캡을 가늘게 잘라서 겸자로 제거하되, 두개골에 과도한 힘을 주지 않도록 하세요.
   3. 클리어 창을 둘러싼 부드러운 라이너 재질을 부드럽게 벗겨내어 클리어된 두개골 부위를 완전히 드러내세요.
   4. 영상 촬영 중 굴절률 일치 침지 역할을 하기 위해 투명한 두개골에 소량의 S2 용액을 직접 발라줍니다.
      참고: 본 연구에서는 표준 수중 물에 담긴 대물렌즈가 사용되었으며, 여기에는 16×/NA 0.8 대물렌즈(N16XLWD-PF, 니콘)와 25×/NA 1.1 대물렌즈(N25X-APO-MP, 니콘)가 포함됩니다. S2를 침지 매체로 사용할 때는 구면 수차를 줄이기 위해 S2의 굴절률에 맞는 적절한 설정으로 대물렌즈의 교정 칼라를 조정하세요. 여기서 실험된 두개골은 약 2시간 동안 2광자 영상을 촬영할 수 있을 만큼 충분한 광학 선명도를 유지했으며, 수지돌기 척추 관찰 중 명확한 이미지 품질 저하는 없었습니다. 약 2일 후에는 추가 영상 촬영을 위해 재촬영이 필요했으며, 재촬영 시간이 초기 세척보다 훨씬 짧아 동일한 동물에서 효율적으로 반복 촬영할 수 있었습니다.
3. 깨어 있는 고정 머리 영상 (선택 사항)
   참고: 깨어 있는 영상을 위해서는 실험 전에 마우스를 머리 고정에 익숙하게 하세요. 이소플루란으로 마우스를 잠시 마취한 후, 이식된 헤드플레이트를 홀더에 15–30분간 고정한 후 2–3일 동안 반복합니다.
   1. 다루기 편리하게 짧은 이소플루란 마취를 사용하세요. 이식된 헤드플레이트만 홀더에 고정하여 몸이 러닝 휠이나 플랫폼 위에서 자유롭게 움직일 수 있도록 하세요.
   2. 6.2.1–6.2.4 단계를 따라 클리어된 두개골 표면을 노출시키고 S2를 적용한 후 영상 촬영을 하세요.

7. 회복

1. 영상 촬영 후에는 두개골 표면에 남아 있는 S2 용액을 부드럽게 흡인하여 제거하세요.
2. 깨끗한 두개골 부위를 인산염 완충식염수(PBS)로 여러 차례 헹구어 두개골의 원래 불투명 상태가 점진적으로 회복되도록 하세요.
3. 두개골과 주변 조직에서 남은 체액을 멸균 면봉으로 부드럽게 말려 뼈에 기계적 손상을 방지하세요.
4. 동물을 이후 실험을 위해 살려두는 경우, 생존 기간 동안 뼈를 보호하기 위해 두개골 창문 위에 생체 적합성 실란트 Kwik-Cast(WPI) 층을 발라야 합니다.
5. 보호층이 완전히 경화되도록 기다려 주세요.
6. 마우스를 머리 받침대에서 분리해 따뜻한 우리에 넣으세요. 마취에서 완전히 회복할 때까지 동물을 관찰한 후 다시 집 우리로 돌려보내세요.

결과

프로토콜에 따라 헤드마운트 광학 투명 두개골(HOTS) 창은 성체 쥐에서 두개골의 무결성을 유지하면서 심두개골 2광자 영상을 가능하게 합니다. 성공적인 준비는 두 가지 주요 결과로 나타난다: (1) 피질 혈관이 제거 시 두개골을 통해 명확히 보인다(그림 1Bf), (2) 제거된 두개골에 약간의 움푹 들어간 부분이 나타나 효과적인 탈석화와 콜라겐 이완을 나타낸다. HOTS 창은 모세혈관 출혈을 방지하기 위해 온전한 두개골 위에 위치시키고 봉합사에서 멀리 떨어져 있어야 하며, 이는 HOTS 창문 파손의 흔한 원인입니다. 또 다른 흔한 고장 모드는 캡-소프트 라이너 재료 인터페이스가 잘못 밀봉된 곳에서 시약이 누출되어 투명성이 완전히 떨어지는 것입니다.

광학 투명 효과를 평가하기 위해 체 외 및 생체 내 투명도...

토론

HOTS 방법은 머리에 장착된 광학 투명 두개골(HOTS) 창을 사용하여 클리어링 시약이 담긴 캡과 2단계 두개골 클리어 절차를 결합하여 성체 쥐의 두개골 투명도를 높이면서도 두개골의 무결성을 유지합니다. 표준 프로토콜(6주 된 마우스의 경우 S1에 6시간, S2에 1시간)에 따르면, 결과된 윈도우는 심층 경두개내 2광자 영상을 신뢰성 있게 지원했고, pia 아래 ~800 μm 아래까지 구조를 시각화할 수 있게 했습니다.

안정적이고 투명한 윈도우를 얻기 위해서는 여러 절차적 단계가 매우 중요합니다. 두개골은 깨끗하고 건조해야 하며, 두피와 골막은 치아 시멘트가 뼈에 단단히 붙어 이후 영상 촬영 시 헤드플레이트를 단단히 고정하도록 조심스럽게 제거해야 합니다. 시멘트 층은 노출된 뼈와 주변 조직을 덮어 단단한 기초를 제공해야 합니다. 이후 치아 시멘트 위와 창문 주변에 얇은 자기 경화 치아 소프트 라이너 재료를 덮어 이후 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1mL 일회용 피펫	베이징 바이오탑 및 nbsp; 과학   & 기술  주식회사	해당 없음
덴탈 시멘트	상하이 롱샹 치과재료 유한회사.	해당 없음
D-만노스	맥클린	D813082
EDTA	알라딘	엘 16428
이소플루란	후륜구동	해당 없음
퀵-캐스트	WPI	해당 없음	생체 적합성 있는 실란트
나오	맥클린	S832169
자가 경화  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 치과  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 부드러운 라이너 재질	양마후 바이오테크놀로지(헤비) 유한회사.	해당 없음
펜토바르비탈 나트륨	바이오파이크	해당 없음
입체 이동 장치	후륜구동	해당 없음
멸균 일회용 주사기	미난크	해당 없음	1 mL; 26G 바늘
설폴란	맥클린	S817950
Thy1-GFP-M 마우스		해당 없음	제공됨; 양잔 교수 작성
Thyl-GCaMP6s  쥐들	잭슨 연구소
트윈 20세	시그마-베텍	V900548
수중 침수 목표	니콘	N25X-APO-MP	25×/NA 1.1 목표
수중 침수 목표	니콘	N16XLWD-PF	16×/NA 0.8 objective