광학 회절 단층촬영을 이용한 실시간 라벨 없는 영상화 및 대식세포 형태역학의 정량적 분석

요약

이 프로토콜은 대식세포 형태역학의 실시간 영상 및 정량적 분석을 위한 라벨 없는 광학 회절 단층촬영 기반 워크플로우를 설명합니다. 이 방법은 단일 세포의 형태와 이동을 지속적으로 추적할 수 있게 하여, 장기 생세포 영상 촬영 중 예상 면적, 경계, 평균 이동 속도를 시간 측정으로 제공합니다.

초록

본 연구는 대식세포의 시간 의존적 형태학적 변화를 관찰하기 위한 무표지 광학 회절 단층촬영(ODT) 기반 워크플로우를 확립합니다. 이 방법은 안정적인 환경 조건 하에서 단일 세포의 형태와 이동을 장기간 지속적으로 기록할 수 있게 하며, 예상 면적, 둘레, 평균 이동 속도 등 정량적 매개변수를 추출할 수 있게 합니다. 이 워크플로우는 외부 표지 없이 단일 세포 수준에서 동적 세포 행동을 포착할 수 있는 실용적인 접근법을 제공합니다. RAW264.7 대식세포를 모델로 삼아, 지다당류 자극과 바칼린 전처리를 이용한 타임랩스 영상을 수행하여 다양한 조건에서 동적 세포 변화를 포착하였습니다. 대표적인 세포들이 선정되어 추적 및 정량 분석이 이루어졌습니다. 결과는 이 워크플로우가 안정적인 장기 단일 세포 추적을 지원하며, 세포 형태와 운동성의 시간적 변화를 반영함을 보여줍니다. 이 접근법은 다양한 자극에 반응하는 동적 세포 행동을 관찰할 수 있는 라벨 없는 방법을 제공하며, 기존의 엔드포인트 기반 검사를 보완하는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 또한 세포 형태역학 연구를 위한 다른 부착 세포 유형에도 적용될 수 있습니다.

서론

대식세포는 선천 면역 반응과 조직 항상성에서 중심적인 역할을 하며, 그 기능 상태는 미세 환경 자극에 반응하여 역동적으로 변화할 수 있습니다. 전통적으로 대식세포는 염증성 또는 항염증/수리 관련 표현형을 채택하는 것으로 설명되어 왔습니다 ^1,2. 그러나 점점 더 많은 증거가 대식세포 활성화가 이산 이진 상태가 아니라 연속적이고 가소성 과정임을 시사합니다3,4. 다양한 자극 하에서 대식세포는 시간이 지남에 따라 점진적인 변화를 겪으며, 세포 형태와 이동 행동의 변화가 동반됩니다⁵. 따라서 단일 세포 수준에서 형태학적 및 이동 변화를 시간 분해 특성화하는 것은 동적 세포 반응을 연구하는 데 중요한 접근법을 제공합니다.

현재 대식세포 상태 연구의 주요 방법은 면역염색, 유세포분석, 전사체 또는 단백질체 분석에 의존^합니다. 이 방법들은 일반적으로 고정된 샘플이나 이산 시간점을 기반으로 하여, 동일한 셀 내에서 실시간 조건⁷에서 연속적인 변화를 추적하는 데 한계가 있습니다. 형광 기반 생세포 영상은 동적 관찰을 가능하게 하지만, 장기 실험 중 광독성과 광표백의 영향을 받을 수 있습니다 ^8,9. 광학 회절 단층촬영(ODT)은 세포의 3차원 굴절률 분포를 재구성하여 정량적인^{구조 정보를 제공하는} 라벨 없는 영상 기법입니다. 외부 표지가 필요 없기 때문에 ODT는 장기 생세포 영상에 적합하며 세포 행동에 대한 교란을 줄입니다. 최근 몇 년간 ODT는 다양한^{셀 모델의} 동적 연구에 적용되어 왔으며, 이전 연구들은 주로 영상 능력과 구조적 특성화에 초점을 맞추고 있습니다. 반면, 본 연구는 정의된 시험관 자극 조건 하에서 대식세포 형태역학의 장기적이고 시간 분해된 단일 세포 분석을 위한 표준화된 라벨 없는 워크플로우를 확립합니다.

이 워크플로우는 in vitro RAW264.7 대식세포 모델과 지질다당류(LPS) 자극과 Baicalin(BAI) 전처리를 사용하여 시연되었습니다. BAI는 워크플로우를 시연하기 위한 정의된 조건을 설정하기 위한 대표적인 실험 변조기로 사용되었습니다. 연속 영상을 통해 예측 면적, 경계, 평균 이동 속도 등 단일 세포의 정량적 매개변수를 추출하여 형태학적 및 행동 변화를 시간 분석으로 특성화할 수 있습니다. 이 접근법은 기능 상태나 분극을 정의하기보다는 동적 표현형 변화에 대한 기술적 분석을 제공하는 것을 목표로 하며, 시간적 정보를 제공함으로써 엔드포인트 기반 분석에 보완적인 방법으로 활용될 수 있습니다. 이 워크플로우는 이 모델 시스템에서 검증되었으며, 다른 부착 셀 유형에도 적용 가능할 수 있습니다.

프로토콜

1. 대식세포 배양

주의: 모든 시술은 실험실 장갑과 실험복을 착용한 채 생물안전 캐비닛 안에서 수행하세요.

1. 완전 배양 배지(고포도당 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM)에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 준비합니다.
2. RAW264.7 대식세포 바이알을 37°C 수욕에서 1분 미만 해동합니다.
3. 세포 현탁액을 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 고포도당 DMEM으로 옮깁니다.
4. 300 × g 에서 원심분리기를 5분간 사용하세요.
5. 상원액은 버리세요.
6. 세포를 새로운 완전 배지에 다시 부유시킵니다.
7. 씨앗 세포를 60mm 접시에 2–5 × 10개의⁵ 셀씩 접시당 넣습니다.
8. 세포를 37°C에서 5% CO₂로 배양합니다.
9. 해동 후 12–24시간 이내에 배지를 바꾸지 마세요.
10. 매체는 2-3일마다 교체하세요.
11. 거꾸로 현미경을 사용해 세포 형태를 관찰합니다.
12. 80–90% 합류 시 통과 세포는 부드러운 피펫팅으로 이루어집니다.
    참고: 트립신 사용을 피하세요. 6번부터 18번까지의 세포를 사용하세요. 실험을 위해 형태가 균일하고 공화가 없는 세포를 선택하세요. 세포주는 STR 프로파일링으로 인증되었고 품질 관리 검사를 받았습니다. 상세 보고서와 영어 요약은 보충 파일에 제공되어 있습니다.

2. 세포 처리

1. 부드럽게 피펫팅하여 로그 성장 단계의 세포를 수집합니다.
2. 세포를 완전한 배지에 재현탁하세요.
3. 셀 카운터를 사용해 셀 밀도를 측정하세요.
4. 세포 밀도를 4 ×^{10 4} cells/mL로 조절하세요.
5. 각 35mm 접시에 2mL의 세포 현탁액을 씨앗 넣습니다.
6. 접시를 두 그룹으로 나누세요: (i) LPS 그룹, (ii) BAI + LPS 그룹.
7. 세포를 37°C에서 5% CO₂와 함께 12–16시간 배양합니다.
8. DMSO에서 50 mM BAI 스톡 용액을 준비하세요. BAI 재고 용액은 −20 °C에 보관합니다.
9. BAI를 BAI + LPS 그룹에 최종 농도 100 μM까지 첨가합니다. BAI 스톡 용액을 배양액에 직접 희석하여 최종 작업 농도를 얻습니다.
10. LPS 그룹에 같은 양의 DMSO를 추가하세요.
11. LPS 스톡 용액(1 mg/mL)을 완전한 배지에 준비합니다.
12. 두 그룹에 LPS를 최종 농도인 1 μg/mL로 첨가합니다. LPS 스톡 용액을 배양 배지에 직접 희석하여 최종 작업 농도를 얻습니다.
13. 즉시 영상 촬영을 진행하시고 영상 촬영 중에는 배지를 바꾸지 마세요.

3. 광학 회절 단층촬영 획득

1. ODT 영상 시스템을 켜고 환경 제어 모듈을 시작하세요.
2. 스테이지 온도를 37°C로 설정하세요.
3. CO₂ 농도를 5%로 설정하세요.
4. 시스템이 최소 20분 이상 평형을 맞출 때까지 기다려 주세요.
5. 조달 소프트웨어를 열어보세요.
6. 배양 접시를 영상 단계에 올려놓으세요.
7. 셀을 찾기 위해 60배 대물렌즈(NA = 1.42)를 사용하세요.
8. 영상 촬영을 위해 경계가 명확한 분리된 세포를 선택하세요.
9. 영상 촬영 간격을 8분으로 설정하세요.
10. 총 프레임 수를 181개로 설정하세요.
11. 타임랩스 촬영 중에도 초점을 유지할 수 있도록 자동 초점 기능을 활성화하세요.
12. 타임랩스 수집 시작.
13. 획득 시 시스템 안정성을 모니터링하세요.
    참고: 초점 드리프트를 최소화하기 위해 실험 전반에 걸쳐 자동 초점 안정화가 적용되었습니다.

4. 이미지 재구성 및 정량적 분석

1. 이미지 획득 후 소프트웨어가 자동으로 이미지 재구성을 수행합니다.
2. 내장된 표준 알고리즘을 사용했습니다.
3. 진행 바가 완성될 때까지 기다리세요.
4. 분석 소프트웨어(Intellyseg, v2.1.0)를 열어보세요.
5. 원시 데이터셋을 가져오려면 '원시 데이터 가져오기'를 선택하세요.
6. 목표 폴더를 탐색 중입니다.
7. 대상 파일을 선택하고 데이터셋을 가져오세요.
8. "셀"을 클릭하면 데이터셋 간에 일관된 설정으로 자동 분할을 수행합니다.¹³.
9. 다음 기준에 따라 셀을 선택하세요: (i) 인접 셀과 겹치지 않음, (ii) 이미지 경계와 접촉하지 않음, (iii) 시계열 전반에 걸쳐 지속적으로 추적 가능함.
10. 데이터셋 간 일관된 분석을 위해 시야각당 고정된 셀 수(n = 8)를 선택하세요.
11. "장기 추적" 모듈을 열어보세요.
12. 시작 프레임과 엔드 프레임이 등장합니다.
13. "Track"을 클릭하면 연속된 프레임¹⁴ 간의 셀 위치 일관성을 기반으로 트래킹을 시작합니다.
14. 궤적 연속성을 보장하기 위해 추적 오류를 수동으로 수정하기: (i) 잘못된 마스크를 우클릭하여 "항목 삭제"를 선택, (ii) "수동 세그멘테이션"을 열기, (iii) "셀"을 선택하고 "추가"를 클릭, (iv) "클릭" 또는 "박스"를 사용해 올바른 마스크를 추가하기.
15. "내보내기"를 클릭한 후 "데이터 내보내기"를 선택하세요.
16. "비디오 내보내기"를 선택하고 출력 요소를 선택하세요.
17. 여기서 시작과 끝 프레임이 등장합니다.
18. 저장 경로와 파일 형식을 선택하세요.
19. "확인"을 클릭하면 영상을 내보내세요.
20. "내보내기"를 클릭한 후 "차트 시스템"을 선택하세요.
21. "트랙 차트"를 선택하세요.
22. 세분화 카테고리로 "셀"을 선택하세요.
23. 여기서 트래킹 프레임 범위가 등장합니다.
24. 출력 매개변수(예: 면적, 주변 영역)를 선택하세요.
25. "이미지 내보내기 또는 엑셀"을 클릭하고 파일을 저장하세요.
26. 전체 시간 순서에 걸친 중심체 변위를 바탕으로 각 셀의 평균 이동 속도(μm/h)를 계산합니다.

5. 데이터 제시

1. 정량적 측정은 기술적으로 제시됩니다. 통계적 추론은 수행되지 않았습니다. 각 처리 그룹은 5개의 독립 표본을 포함했습니다.
   실험 워크플로우의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 주요 시약, 기기 및 소프트웨어는 재료표에 나열되어 있습니다. 영상 조건은 표 1에 요약되어 있습니다.

결과

ODT 기반 워크플로우의 성능을 평가하기 위해, 두 개의 치료군(LPS 및 BAI + LPS)에 대해 타임랩스 영상이 수행되었으며, 각 그룹당 5개의 독립 샘플을 사용했습니다. 모든 샘플은 동일한 영상 조건에서 채취되었습니다. 장기 단일 세포 추적 및 정량 분석에 따른 높은 작업량으로 인해, 각 그룹에서 대표 샘플 1개를 선정하여 단일 세포 분석 및 시각화를 수행하였습니다. 결과는 기술적으로 제시되며 통계적 추론을 목적으로 하지 않습니다.

타임랩스 형태학적 역학

타임랩스 ODT 영상은 이 방법이 단일 세포 형태학적 변화를 연속적으로 기록할 수 있음을 입증했습니다(그림 2). 분석된 샘플에 대응하는 대표적인 타임랩스 비디오는 보조 영상 1 (LPS, 샘플 1)과 보조 영상 2 (BAI + ...

토론

본 연구는 단일 세포 수준에서 대식세포 형태역학의 연속 영상 및 정량 분석을 위한 라벨 없는 ODT 기반 워크플로우를 확립합니다. 이 접근법은 장기 생세포 영상 촬영 중 예상 면적, 경계, 평균 이동 속도를 시간 분해 측정할 수 있게 합니다. 세포 시딩 밀도는 세분화 및 추적 성능에 영향을 미치는 핵심 요소입니다. 밀도가 높으면 세포가 겹치고, 밀도가 낮으면 분석 가능한 세포 수가 줄어듭니다. 따라서 영상 촬영 전에 시딩 조건을 최적화해야 합니다. 영상 간격은 시간 해상도, 데이터 양, 장기 세포 추적의 연속성을 균형 있게 맞추기 위한 예비 실험을 바탕으로 결정되었습니다. 짧은 구간은 시간 해상도를 높이지만 데이터 크기와 광독성 위험도 증가하며, 긴 구간은 동적 변화 포착 능력을 줄일 수 있습니다.

장기적인 획득을 위해서는 안정적인 환경 조건이 필요합니다. 실험 내내 온도, CO₂ 농도, 최소한의 기계적 교란을 유지해야...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ODT 이미징 시스템	Pellucid Optics	MH-PanoView	라벨 없는 생체 세포 이미징에 사용됨
획득 소프트웨어	Pellucid Optics	Lucida-Pano v2.1.0	이미지 획득에 사용됨
분석 소프트웨어	Pellucid Optics	Intellyseg v2.1.0	이미지 재구성, 분할 및 추적에 사용됨
RAW264.7	우한 지산 바이오테크놀로지	STCC20020P	인체 대식세포 라인, 체외 분극 및 이미징 실험에 사용됨.
바이칼린 (BAI)	상하이 위안예	JB246114	세포 전처리에 사용됨
리포폴리사카라이드 (LPS)	Solarbio	L8880	대식세포 자극에 사용됨
DMEM 배지	Gibco	C11995500BT	세포 배양 배지
태아 우 혈청	Procell	164210	세포 배양 보충
페니실린–스트렙토마이신 (100x)	Procell	PB180120	세포 배양용 항생제
60 mm 배양 접시	Corning	CLS430166	세포 배양에 사용됨
35 mm 유리 바닥 접시	Cellvis	D35-10-1.5-N	ODT 이미징에 사용됨
역전 현미경	OLYMPUS	CKX53	일상적인 세포 관찰 및 배양 중 모니터링에 사용됨.
세포 카운터	RWD 생명과학	C100	세포 밀도 결정에 사용됨