인간 전사체 데이터의 통합 생물정보학 분석은 폐선암에서 세 가지 주요 진단 및 예후 바이오마커를 규명합니다

요약

이 연구는 TCGA-LUAD와 GEO GSE115002 전사체 데이터를 사용하여 폐선암의 진단 및 예후 바이오마커를 규명하였습니다. B3GNT3, FERMT1, SPP1 은 상향 조절되어 종양과 정상 조직을 구분하였습니다. 이 유전자들은 상피-중간엽 전이와 면역 억제와 관련이 있습니다. 유전자 발현과 TNM 단계를 결합한 노모그램은 신뢰할 만한 예측 가치를 보여주었습니다.

초록

폐선암(LUAD)은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 수술, 표적 치료, 면역치료의 발전에도 불구하고, 고급 LUAD의 5년 생존율은 여전히 20% 미만으로 남아 있어 조기 발견과 예후를 위한 신뢰할 수 있는 분자 바이오마커의 긴급한 필요성을 나타냅니다. 이 연구에서 저자들은 세 가지 지속적으로 상향 조절되는 유전자가 LUAD의 효과적인 진단 및 예후 바이오마커로 작용할 수 있다고 가설을 세웠습니다. 저자들은 두 독립 코호트인 TCGA-LUAD(535개의 종양, 59개의 정상 샘플)와 GSE115002(52개의 종양, 52개의 정상 샘플 일치)의 전사체 데이터를 분석하여 차별 발현 유전자를 선별하였습니다. 세 가지 핵심 유전자인 B3GNT3, FERMT1, SPP1은 LUAD 종양에서 두 데이터셋 모두에서 일관되게 과발현되었습니다. 이 유전자들은 TCGA-LUAD에서 AUC 값이 0.95 이상, GSE115002에서 높은 정확도로 우수한 진단 성능을 보였습니다. 생존 분석 결과, 각 유전자의 높은 발현이 전체 생존 기간과 무질병 생존 기간의 단축과 유의한 관련이 있음을 보여주었으며, 다변량 Cox 회귀분석은 이들의 독립적인 예후 가치를 검증하였습니다. 기능 풍부 분석 결과, 이 세 유전자는 상피-중간엽 전이, 세포외 기질 재형성, 면역 억제에 관여하며, 모두 LUAD 침윤 및 전이와 밀접하게 관련되어 있음을 보여주었습니다. 저자들은 세 유전자와 TNM 단계를 결합한 예후 노모그램을 추가로 구축하여 0.743의 일치 지수를 달성하고 우수한 예측 성능을 보였습니다. 이 발견들은 B3GNT3, FERMT1, SPP1 이 LUAD의 진단 및 예후 바이오마커로서 위험 계층화 및 관리에 대한 임상 응용을 뒷받침한다는 것을 확인시켜 줍니다.

서론

폐암은 전 세계 암 사망의 주요 원인으로, 2020년 약 180만 명의 사망자를 차지했습니다. 폐선암(LUAD)은 전체 폐암 사례의 거의 40%를 차지합니다². 수술, 표적 치료, 면역치료의 발전에도 불구하고, 진행된 LUAD의 5년 생존율은 여전히 20% 미만으로 남아 있습니다^3,4. 조기 발견과 정확한 예후를 위한 신뢰할 수 있는 분자 바이오마커가 시급히 필요합니다. 고처리량 시퀀싱과 암 게놈 아틀라스(TCGA), 유전자 발현 옴니버스(GEO)와 같은 공개 데이터베이스는 암의 체계적인 전사체 프로파일링을 가능하게 합니다 ^5,6. 통합 교차 코호트 생물정보학은 후보 바이오마커 발견의 신뢰성을^{향상시킵니다. 5}.

LUAD에는 세포 증식, EGFR 신호 전달, 면역 탈출⁷ 등 많은 유전자와 경로가 관련되어 있습니다. 하지만 임상 적용에 적용된 것은 거의 없습니다. 유전자 서명과 임상병리학적 특징, 특히 노모그램을 결합한 위험 모델은 LUAD⁸의 예후 정확도를 향상시킵니다. B3GNT3, FERMT1, SPP1 은 개별적으로 암 진행과 연관되어 있으나, LUAD에서의 진단, 예후, 면역-미세환경 조절 가치의 결합은 독립 코호트에서 체계적으로 검증되지 않았습니다. 본 연구는 이 세 유전자를 통합된 크로스 플랫폼 분석으로 통합하여 LUAD의 통합 바이오마커 패널로 제공하며, 임상적으로 적용 가능한 예후 노모그램을 제공합니다.

B3GNT3는 PD-L1을 안정화하고 면역 회피를 촉진하는 글리코실트랜스퍼라제를 암호화합니다 ^9,10. FERMT1(킨들린-1)은 인테그린 활성화를 조절하며 비소세포폐암(NSCLC)에서 전이를 촉진합니다^11,12. SPP1(골세포 세포 기질 재형성, 상피-중간엽 전이(EMT), 화학요법 저항성을 매개합니다 13,14,15. 생체 시계 관련 유전자는 LUAD 예후와 진단을 예측하는 데도 기여했으며¹⁶, LUAD의 성별 차이는 다중 옴믹스 통합 단백질 신호 네트워크를 통해 밝혀졌습니다¹⁷. B3GNT3와 SPP1은 분비되거나 막 국소화되어 최소 침습 바이오마커로서의 잠재적 사용을 지지합니다. 효과적인 LUAD 분류와 바이오마커 식별은 겹치는 특징 선택 방법을 통해서도 달성할 수 있으며(¹⁸), 다중 옴 상호작용은 폐암 진행에 중요한 기능적 역할을 합니다⁽¹⁹). 포괄적인 다체체학적 통합을 통해 확인된 미토콘드리아 유전자 서명은 LUAD 예후와 개인 맞춤형 치료에도 가치를 지닙니다²⁰. B3GNT3와 SPP1은 분비되거나 막 국소화되어 최소 침습 바이오마커로서의 잠재적 사용을 지지합니다. 이 연구는 통합 생물정보학을 이용해 견고한 LUAD 바이오마커를 식별하고, 진단 및 예후 성능을 평가하며, 생물학적 기능과 면역 연관성을 탐구하고, 임상적으로 유용한 예후 노모그램을 구축하는 것을 목표로 했습니다.

프로토콜

1. 데이터 소스 및 전처리

1. R (버전 4.1.3; 윈도우 10 프로).
2. GSE115002 경우, limma(버전 3.52.3)를 이용한 분위수 정규화를 적용합니다.
3. TCGA를 위한 저발현 유전자 필터링: CPM > 0.5 유전자를 ≥50% 샘플에서 유지합니다.
4. GSE115002 발현이 낮은 유전자를 필터링: 평균 신호 >50을 가진 유전자를 유지하세요.
5. log₂의사 개수를 +1로 변환하는 식의 값.
   참고: LUAD 유전자 발현 및 임상 데이터는 TCGA-LUAD(버전 33.0, GDC 포털, 2025년 8월 7일 다운로드)와 GSE115002(Agilent 마이크로어레이, GEO, 2025년 8월 7일 다운로드)에서 수집되었습니다. TCGA-LUAD는 535개의 종양과 59개의 정상 샘플을 포함했습니다. GSE115002 52개의 종양과 52개의 정상 샘플을 포함하였습니다.

2. 차별발현 유전자의 식별

1. 차별 발현 분석에는 TCGA RNA-seq에는 DESeq2(버전 1.36.0)를, 차별 발현 분석에는 GSE115002에 LIMMA(버전 3.52.3)를 사용하세요. 벤자미니-호흐버그 방법을 사용하여 조정 P-값(FDR)을 계산합니다.
2. 데이터셋 간 비교 가능성을 보장하기 위해, 통합된 |log₂FC| ≥ 1.0은 두 학년 모두에 적용되었습니다. DEG는 FDR < 0.05와 |log₂FC| ≥ 1.0. VennDiagram(버전 1.7.3)을 사용하여 겹치는 DEG를 식별하였습니다. B3GNT3, FERMT1, SPP1 은 암과 관련된 것으로 알려진 일관되게 상향 조절된 후보로 선정되었습니다.

3. 진단적 가치 평가

1. 각 후보 유전자에 대해 ROC 곡선을 구성합니다.
2. 유덴 지수를 사용하여 최적의 컷오프 값을 결정합니다.
3. 각 유전자별로 AUC, 민감도, 특이도를 계산하세요.
4. 다변량 로지스틱 회귀분석을 이용해 통합 진단 패널을 구축하세요.
   참고: ROC 분석에는 pROC 패키지 v1.18.0이 사용되었습니다. 이항 계열을 가진 glm 함수를 사용하여 진단 모델을 구성하였습니다.

4. 생존 분석

1. 중앙값 발현을 사용하여 환자를 고발현군과 저발현군으로 층화합니다.
2. 각 유전자에 대해 Kaplan–Meier 생존 곡선을 생성합니다.
3. 생존 차이를 비교하기 위해 로그 랭크 검정을 수행하세요.
4. 단변량 콕스 회귀분석을 수행하세요.
5. 다변량 콕스 회귀분석을 수행하세요.
6. 회귀 모델에 임상 공변량을 포함하세요.
7. Schoenfeld 잔차를 사용하여 비례 위험 가정을 검증합니다.
8. 세 유전자 위험 점수를 계산하세요.
   참고: Survival v3.3.1과 survminer v0.4.9가 사용되었습니다. 상변량에는 나이, 성별, T 단계, N 단계, M 단계가 포함되었습니다. 위험 점수는 다음과 같이 계산되었습니다:
   위험 점수 = (0.328 × B3GNT3) + (0.331 × FERMT1) + (0.321 × SPP1). (1)

5. 유전자 집합 풍부화 및 기능 주석

1. DEG를 사용하여 GO 농축 분석을 수행합니다.
2. DEG를 이용한 KEGG 경로 농축 분석을 수행합니다.
3. 유전자 집합 풍부 분석(GSEA)을 수행하세요.
4. 후보 유전자 발현과 피어슨 상관관계에 따라 유전자를 순위 매깁니다.
5. 조정된 P < 0.05를 사용하여 중요한 용어를 식별합니다.
   참고: clusterProfiler v4.6.2는 GO 및 KEGG 분석에 사용되었습니다. GSEA에는 FGSEA v1.22.0과 MSigDB Hallmark v7.5가 사용되었습니다.

6. 상관관계 및 네트워크 분석

참고: 피어슨 상관관계법은 정규 분포 유전자 발현에 사용되었으며; 면역 세포 분획에 대한 스피어먼 상관관계. PPI 네트워크는 STRING(버전 11.5, 신뢰도> 0.7)을 사용하여 생성되었고, Cytoscape(버전 3.9.1)에서 시각화되었습니다. 면역 침윤은 CIBERSORT(절대 모드, 100가지 순열)를 사용해 추정하였다. 단세포 RNA 시퀀싱은 NSCLC 미세환경에서 지위적 전이를 드러내는 것으로 밝혀졌으며, 이는 면역 침윤 분석과 관련이 있습니다^21,22. 통합 단세포 분석은 LUAD 23,24,25에서 CD8+ 메모리 세포와 같은 면역 세포의 역할을 더 해부할 수 있습니다.

7. 노모그램 구성 및 검증

참고: 노모그램 변수는 다변량 Cox 유의성(P < 0.05)을 기준으로 선정되었습니다: T 단계, N 단계, B3GNT3, FERMT1, SPP1. 노모그램은 RMS(버전 6.5.0)를 사용해 구축되었습니다. 내부 검증은 1000 부트스트랩 재샘플링과 교체 방식을 사용했습니다. 보정 곡선과 결정 곡선 분석(DCA)은 rmda(버전 1.7)를 사용하여 수행되었습니다. 계산 환경에는 R 4.1.3, Windows 10 Pro, Bioconductor 3.15가 포함되었습니다. 분석 스크립트는 합리적인 요청 시 https://github.com/[편집]/LUAD-biomarker-2025에서 이용할 수 있습니다.

8. 통계 분석

참고: 모든 통계 검정은 양측 검정이었습니다; P < 0.05는 유의미한 것으로 간주되었습니다.

결과

LUAD에서의 전역 유전자 발현 변화

폐 선암 조직과 정상 폐 조직 간의 전사체 비교 결과, 광범위한 유전자 발현 변화가 확인되었습니다. 그림 1A는 TCGA-LUAD 데이터셋에서 차등 발현 유전자의 화산 그래프를, 그림 1B는 GSE115002 데이터셋의 유전자를 보여줍니다. TCGA-LUAD 코호트(그림 1A)에서는 1865개의 유전자가 유의하게 상향 조절되었고, 1247개의 유전자가 하향 조절되었습니다. GSE115002 코호트(그림 1B)에서는 645개의 유전자가 상향 조절되었고 609개의 유전자가 하향 조절되었습니다. 두 데이터셋에서 총 421개의 유전자가 일관되게 상향 조절되었습니다. 이 중복 유전자 중 B3GNT...

토론

노모그램은 TCGA-LUAD 코호트를 기반으로 한 다변량 Cox 회귀분석을 사용하여 구성되었습니다. 예측 인자로는 병리적 T 단계, 병리적 N 단계, 그리고 B3GNT3, FERMT1, SPP1의 유전자 발현 상태(중간 발현에 따라 높은 /낮은 것으로 분류됨)가 포함됩니다. 각 환자에 대해 각 변수의 개별 점수를 합산하여 "총 점수" 값을 생성하는데, 이는 추정된 1년, 2년, 3년 전체 생존 확률에 해당합니다. 총점이 높을수록 사망 위험이 증가함을 의미합니다. 이 도구는 개별 생존 예측을 제공하며 LUAD 위험 계층화를 지원합니다. 머신러닝은 LUAD 예후^{와 치료에서} 다양한 세포사멸 패턴을 밝혀내는 데 사용되었으며^, 이는 노모그램 모델을 더욱 최적화할 수...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
공개된 데이터셋	TCGA-LUAD 데이터셋	The Cancer Genome Atlas (TCGA) 포털 (https://portal.gdc.cancer.gov/); 535 LUAD 종양 샘플, 59 인접 정상 폐 조직 샘플 (RNA-시퀀싱 카운트/FPKM 값 + 임상 데이터: 생존, TNM 분기)	전사체 및 임상 데이터는 차등 발현, 생존 및 노모그램 분석용; 기본 연구 코호트
	GSE115002 데이터셋	Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE115002); Agilent 마이크로어레이, 52 LUAD 종양 조직, 52 일치하는 인접 정상 폐 조직 (치료 경험 없는 1차 종양)	차등 발현, 진단 성능 및 면역 침윤 분석을 위한 독립 검증 코호트
바이오인포매틱스 소프트웨어 & 프로그래밍 환경	R 프로그래밍 언어	버전 4.1	모든 전사체, 통계 및 그래픽 분석의 핵심 플랫폼
	R 패키지(차등 발현)	DESeq2, limma	DESeq2: TCGA RNA-seq 원시 카운트 차등 발현 분석; limma: GSE115002 마이크로어레이 정규화 및 차등 발현 분석(Benjamini–Hochberg FDR 수정)
	R 패키지(진단 분석)	pROC	ROC 곡선 구성, AUC(95% CI) 계산, 진단 성능 평가를 위한 최적 절단값 결정(Youden’s 지수)
	R 패키지(생존 분석)	survival, survminer	Kaplan–Meier 생존 곡선 생성, log-rank 검정, 단변량/다변량 Cox 비례 위험 회귀(HR + 95% CI); 환자 중앙값 유전자 발현에 따른 분류
	R 패키지(기능 풍부화)	clusterProfiler, fgsea	clusterProfiler: GO(BP/CC/MF) 및 KEGG 경로 풍부화 분석(조정된 P < 0.05); fgsea: MSigDB 홀마크/KEGG 유전자 세트에 대한 GSEA(FDR < 0.25)
	R 패키지(노모그램 구성 & 검증)	rms	예후 노모그램 개발(유전자 발현 + TNM 단계 통합); Harrell’s C-index 계산, 편향 수정을 위한 부트스트랩 재샘플링(1000회 반복), 보정 곡선 생성
	R 패키지(통계 & 시각화)	ggplot2, ComplexHeatmap, corrplot	화산도 플롯, 거품 플롯(풍부화), 히트맵(면역 침윤 상관), 산점도(유전자 공동 발현) 생성; Pearson/Spearman 상관 분석
바이오인포매틱스 데이터베이스 & 도구(네트워크/면역 분석)	STRING 데이터베이스	신뢰도 점수 > 0.7	B3GNT3/FERMT1/SPP1 및 1차 상호작용자의 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 구성
	Cytoscape	-	PPI 및 유전자 공동 발현 네트워크 시각화(상관 강도에 따른 가중치, 허브 유전자 식별)
	면역 분해 알고리즘	CIBERSORT	LUAD 샘플에서 면역 세포 침윤 풍부도(M2 대식세포, CD8+ T 세포, 호중구, NK 세포 등) 추정; 후보 유전자 발현과의 상관관계
기타 도구	Microsoft Office/LaTeX	-	원고 준비, 그림 조립 및 표 형식화; 통계 결과 편집

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