갈색 지방세포와 AGPAT2 결핍 프레디포세포 구별에서의 외인성 미토콘드리아 전달

요약

인간과 쥐 기원의 외인성 미토콘드리아는 전지방세포를 분화하여 내화할 수 있으며, 영상 및 유전학 도구를 사용하여 지방 생성 분화 전반에 걸쳐 추적할 수 있습니다. 이 미토콘드리아들은 내인성 미토콘드리아 네트워크와 물리적으로 상호작용하지만, 성숙한 갈색 지방세포와 관련된 마커의 발현을 증가시키지는 않습니다.

초록

미토콘드리아는 주요 신호 허브이며; 그러나 미토콘드리아 질량 팽창이 분화에 기계적으로 필수적인지는 아직 미해결 질문입니다. AGPAT2는 용인산을 인산으로 전환시키는 촉매를 촉진하며, 이 결핍은 지방 조직 결핍과 미토콘드리아 질량 감소와 관련된 지방 생성 저하를 초래합니다. 미토콘드리아 질량 확장이 지방 생성에 미치는 영향은 외인성 미토콘드리아를 분화 중인 갈색 지방세포로 옮겨 평가하였다. 미토콘드리아 이식이 AGPAT2 결핍 세포의 지방 생성 저하를 구할 수 있는지도 조사되었습니다. 인간과 쥐 미토콘드리아는 성공적으로 이식되어 분화된 생쥐 전지방세포의 내인성 미토콘드리아 네트워크에 통합되었고, 갈색 지방 생성 과정 내내 지속되었습니다. 이동된 미토콘드리아를 유지하기 위해서는 지방 생성 분화가 필요했다. 미토콘드리아 전달은 성숙한 갈색 지방세포의 분자 표지나 지질 방울 함량의 발현을 변경하지는 않았으나, 종 의존적으로 지질 방울 크기의 상대적 분포에는 영향을 미쳤다. Agpat2^-/- 전지방세포에서는 미토콘드리아 이식이 지방 생성을 구하지 못하여, 미토콘드리아 질량 확장만으로는 이 모델에서 지방이영양증 기전을 되돌리기에 충분하지 않음을 시사합니다. 이 결과는 외인성 인간 및 쥐 미토콘드리아가 분화 지방세포의 미토콘드리아 네트워크에 포함될 수 있지만, 지방 생성 프로그램에 직접적인 영향을 미치지는 않음을 시사합니다.

서론

주요 생체에너지 역할을 넘어, 미토콘드리아는 세포 분화 ^1,2,3,4를 포함한 여러 세포 과정에서 신호 전달 허브 역할을 합니다. 갈색 지방 조직(BAT)은 열생성 활성을 지원하기 위해 유의미하게 높은 미토콘드리아 질량을 가지고 있어, 전신 에너지 균형과 비만 발병 기전에서 중요한 역할을 한다⁵. 미토콘드리아 질량은 생합성과 미토포지의 균형에 의해 조절되지만, 갈색 지방세포 분화 중 미토콘드리아 질량 확장이 지방 생성에 기능적으로 필요한지, 아니면 단지 이 과정의 결과인지는 불분명하다.

세포 간 생리학적 미토콘드리아 전달은 시험관 내와 생체 내에서 모두 문서화되었으며, 비만과 인슐린 저항성과 관련된 지방 조직 기능 장애를 포함한 병리적 조건에서 조직 적응에 기여합니다 ^6,7. 더 나아가, 시험관 내 인공 미토콘드리아 이식은 수용 세포의 호흡 능력을 향상시키는 것으로 나타났습니다⁸. 이 발견들은 미토콘드리아 이동이 세포 대사 기능을 변화시킬 수 있으며, 생체에너지 스트레스 조건에서 조직 적응에 기여할 수 있다는 개념을 지지합니다 ^9,10,11. 핵 및 미토콘드리아 전사 프로그램을 활성화하여 내인성 미토콘드리아 생합성을 자극하는 약리학적 또는 유전학적 전략과 비교할 때, 미토콘드리아 이식은 수용 세포에 소기관을 직접 전달하여 전사 조작과 독립적으로 미토콘드리아 질량의 신속한 변형을 가능하게 합니다^12,13. 이 접근법은 미토콘드리아 질환의 결함을 교정하는 데 중요하지만, 약리학적 또는 유전학적 접근법의 잠재적 비표적 효과 없이 미토콘드리아 작용을 연구할 수 있게^합니다.

본 연구에서는 외인성 미토콘드리아 전달을 통해 미토콘드리아 질량을 인위적으로 증가시키는 것이 갈색 지방세포를 구분하는 데 미치는 영향을 조사했습니다. 이 접근법은 미토콘드리아 질량이 지방 생성 프로그램에 미치는 영향을 직접 평가할 수 있게 했습니다. 이를 위해 중간엽 줄기세포를 위해 원래 개발된 미토콘드리아 전달 프로토콜이 인간 간 세포와 쥐 전지방세포를 모두 미토콘드리아 기증자^{로 사용하여 적응} 되었습니다. 분화 중인 마우스 세포에서 인간 미토콘드리아를 추적하는 방법이 유전학적 도구와 영상 기법을 결합하여 개발되어, 두 기원의 미토콘드리아가 내인성 미토콘드리아 네트워크에 통합되어 지방 생성 분화 과정 내내 지속됨을 입증했습니다.

낮은 미토콘드리아 질량과 관련된 결함 지방 생성을 모델링하기 위해, 1-아실글리세롤-3-인산-O-아실트랜스퍼라제 2(AGPAT2)-결핍(Agpat2^-/-) 마우스에서 유래한 갈색 지방세포를 구분하였습니다. AGPAT2는 지방 조직에서 매우 많이 발현되며, 글리세로지질 생합성 경로에서 인산의 형성을 촉매합니다. AGPAT2 결핍은 인간과 쥐 모두에서 심각한 지방이영양증을 유발하며, 흰색 및 갈색 지방세포 모델에서 미토콘드리아 질량 감소와 함께 지방 생성을 손상시킵니다 16,17,18. 외인성 미토콘드리아를 분화 전지방세포에 통합하면 지질 방울 크기 분포가 약간 변했으나, 성숙한 갈색 지방세포 표지자의 발현을 증가시키거나 Agpat2^-/- 전지방세포의 지방생성 손상을 구하지는 못했습니다.

프로토콜

동물 시술은 칠레 가톨릭 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인되었으며, 프로토콜 210609003. 이 연구에는 혼합 C57BL/6J와 129J 유전적 배경에서 유래한 야생형 및 Agpat2^-/- P0.5 신생아 마우스(남녀 모두)를 사용하였습니다. 개인 보호 장비(PPE): 실험실 가운, 안전 안경, 니트릴 장갑을 착용하세요. 추가 프로토콜 세부사항은 보충 파일 1 과 이 프로토콜에 필요한 버퍼는 표 1 을 참조하십시오.

전자현미경 준비, 파라포름알데히드 고정, 핵산 추출 과정에서 발생하는 모든 유해 화학 폐기물은 기관 환경 보건 및 안전(EHS) 규정을 준수하여 명확히 라벨링된 경로로 엄격히 분리되어야 합니다. 어떠한 경우에도 이 시약들은 실험실 싱크대나 공공 하수도로 배출되어서는 안 됩니다. 발생하는 모든 유해 화학 폐기물은 기관별 EHS 분류에 따라 분리되어야 합니다.

1. 세포 배양

1. 원발 지방세포의 분리, 분화 및 유지 (iBAT)
   참고: 절차에 대한 간략한 설명은 보충 파일 1 을, 필요한 해의 구성은 표 1 을 참조하십시오. 시험 관 내 갈색 지방 생성 분화 프로토콜에 대한 완전하고 상세한 설명은 Figueroa 등¹⁹에서 확인할 수 있습니다.
   1. Figueroa 등에서 기술한 수술 및 효소 소화 절차를 거친 신생아 마우스(P0.5) 마우스의 보갑간 갈색 지방 조직(iBAT)에서 전지방세포를 분리^합니다.
   2. 분화 칵테일 및 배지 교환 일정에 따라 갈색 지방세포 배양을 구분하고 유지하세요.
      참고: 성공적인 지방 생성 분화를 위해서는 지방 생성 유도를 시작하기 전에 배양 양이 90–100% 합류율에 도달하는 것이 매우 중요합니다.
2. HepG2 배양
   1. DMEM에서 HepG2 세포를 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B를 보충하여 배양합니다. 세포를 5%_CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 37 °C에서 유지합니다.
      참고: 이 세포들은 군집을 이루어 성장하며, 다층 성장으로 인해 밀도가 높음에도 불구하고 아준 융합 형태로 보일 수 있습니다.

2. 미토콘드리아 분리 및 전이

1. 미토콘드리아 분리
   참고: 모든 단계는 4°C 또는 얼음 위에서 생물안전 캐비닛 내에서 수행하십시오. 준비 과정을 2시간 이내에 사용하세요.
   1. 100mm 배양 접시에 10개의⁶ 개 기증자 세포(HepG2 또는 전지방세포)를 씨앗 2× 씨앗. 세포가 80%(HepG2) 또는 100%(전지방혈구) 합류율에 도달할 때까지 배양합니다.
   2. 5%_CO2 인큐베이터에서 FBS 무첨가 배지에서 37°C, 30분간 100 nM MitoTracker Deep Red FM을 사용한 기증자 세포를 염색합니다.
   3. 세포를 성장 배지로 2번 세척해 과도한 염료를 제거하세요.
   4. 트립신으로 세포를 분리하고 현탁액을 수집한 후 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
   5. 이 펠릿을 1mL의 미토콘드리아 분리 완충제(MIB)에 재현탁하고, BSA, 프로테아제 억제제, 인산효소 억제제를 보충합니다. 부탁액을 결핵 주사기로 5번 통과시켜 원형질막을 파괴합니다. 현탁액을 인슐린 주사기로 최소 10번 이상 통과시켜 용액이 연한 갈색이 되고 뭉치가 보이지 않을 때까지 균질화합니다.
      참고: 웨스턴 블롯 분석을 위해서는 전체 용해액의 50 μL을 분리하여 -20 °C에 저장하세요.
2. 균질액을 900 × g 에서 4 °C에서 11분간 원심분리합니다.
   참고: 900 × 회전 후 상정액이 흐려지지 않는다면, 세포 용해는 불완전할 가능성이 큽니다.
   1. 상원액을 10,000 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리기로 채취하여 미토콘드리아를 펠릿으로 만듭니다. 미토콘드리아 펠릿을 MIB와 BSA 보충으로 3번 세척하세요.
   2. BSA 프리 MIB 100 μL 최종 현탁 시행. BCA 단백질 분석법을 사용하여 단백질 농도를 정량합니다.
3. 전세포에서의 미토콘드리아 전달 분석법(MTA)
   1. 시드 수혜자 전지방세포는 12웰 플레이트(현미경 촬영용 18mm 커버슬립 포함) 12웰 플레이트에서 5×^{10 5} 세포/웰에서 분석.
   2. 분리된 기증 미토콘드리아를 10⁵ 세포당 10 μg의 미토콘드리아 단백질 비율로 수혜자 배지에 직접 첨가합니다. 미토콘드리아를 분배하기 위해 접시를 부드럽게 흔드세요. 분석 전 37°C에서 5% CO₂를 포함한 가습 인큐베이터에서 24–120시간(분화 1, 3, 5일차에 해당)을 배양합니다.

3. 미토콘드리아 산소 소비량과 MTA 효율

1. 미토콘드리아 호흡계
   1. 외부 순환 수욕을 25°C로 설정하고, 측정을 시작하기 전에 챔버 재킷의 안정적인 열 평형을 확인하세요.
   2. 기기의 획득 소프트웨어를 사용하여 2점 액체 상 보정을 수행합니다.
      1. 공기 포화 보정(하이포인트): 챔버에 500 μL의 공기 포화 탈미네랄수를 추가합니다. 자기 교반기를 60rpm으로 설정하고 신호가 안정될 때까지 기록하세요(>1,500 mV).
      2. 무산소 보정(저점 기준): 챔버에 소량(~3 mm 직경의 황산나트륨)을 첨가하여 남은 공기를 밀어냅니다. 신호가 안정적인 기준선 정체(기저 신호의 ~1%, ~20 mV)로 떨어질 때까지 기록합니다.
   3. 실시간 녹화 시작(총 실행 시간: ~10분).
   4. 안정적인 선형 측정값이 나올 때까지 3분간 기록하세요.
   5. 분리된 미토콘드리아를 200 μL 미토콘드리아 분석제(MAS)²⁰에 5 mM 글루타메이트와 2.5 mM 말레이트를 보충하여 재현탁합니다.
      참고: 본 연구에서는 총 미토콘드리아 펠릿을 두 개의 100mm 세포판에서 추출했습니다.
   6. 서스펜션을 옥시그래프 챔버로 옮기고 챔버 밀봉 플런저를 단단히 닫아 기포가 남지 않도록 하세요.
   7. 산소 소비량을 3분 동안 기록하세요.
   8. 150 μM ADP를 추가하여 미토콘드리아 결합호흡을 유도하고 3분간 ATP 합성 결합호흡을 측정합니다.
   9. 각 호흡 단계에 해당하는 안정적이고 선형적인 구간을 수동으로 정의하세요. 소프트웨어가 계산한 자동 기울기 값을 추출하는데, 이는 nmol∙^mL-1∙^min-1 단위의 산소 소비율로 표현됩니다.
      참고: 인터플레이트 챔버 청소 시에는 탈미네랄 물 1mL로 챔버를 2번 헹구고 내부가 완전히 건조하도록 하세요. 다음 플레이트로 넘어가기 전에 챔버에 100 μL의 PBS를 추가하세요.
2. 유세포검사
   참고: 세포 및 생체에너지의 완전성을 유지하기 위해 모든 샘플을 시술 기간 내내 얼음 보관하세요.
   1. 미토콘드리아를 분리하고 2.2절에 설명된 대로 35mm 배양 접시에서 미토콘드리아 이식 분석(MTA)을 수행하며, 이전에 MitoTracker Deep Red FM으로 표지된 기증 세포를 사용합니다.
   2. 배양지를 흡입하고 세포 단층을 멸균 PBS 1mL로 한 번 세척합니다.
   3. 0.25% 트립신-EDTA 500 μL을 추가하고 37 °C에서 배양하여 현미경으로 세포 분리가 완전히 관찰될 때까지 배양합니다.
   4. 1mL의 완전 배양지(DMEM 10% FBS)를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다. 전체 부피를 15mL 원뿔 튜브로 옮겨 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
   5. 흡인으로 상정액을 버리고 세포 펠릿을 남깁니다. 부드럽게 피펫팅하여 500μL 얼음 차가운 PBS에 펠릿을 재현탁합니다.
   6. 640 nm 레이저가 장착된 유세포 측정기를 사용하여 샘플을 분석하세요(유세포 분석 획득 및 분석에 관한 자세한 내용은 보충 파일 1 참조).
      1. 전방산란(FSC)과 측면산란(SSC) 플롯을 사용해 세포 집단을 정의하고, 이물질과 세포 중복선을 배제하는 게이팅 전략을 적용합니다.
      2. 광도 채널(670/30 nm 방출 필터)의 형광 강도를 정량하여 내부화된 MitoTracker 표지 미토콘드리아를 검출합니다.
      3. Floreada.io 를 사용하여 분석을 수행하세요(게이팅 프로토콜 세부 사항은 보충 파일 1 참조).
         참고: 배경 자가형광의 기준선을 설정하기 위해 음성 대조군(MTA가 없는 수용 세포)을 포함하세요.
3. 공초점 현미경 및 전자 현미경
   1. 생세포 영상 분석
      1. P0.5 신생아 마우스에서 유래한 1차 전지방세포를 18mm 커버슬립이 포함된 12웰 플레이트에 씨앗하며, 이는 1절에 상세히 설명된 특정 세포 밀도 및 배지 요구사항에 따라 수행됩니다.
      2. 미토콘드리아를 분리하고 2절에 명시된 대로 이전에 MitoTracker Deep Red FM으로 표지된 기증자 세포를 사용하여 미토콘드리아 이식 분석법(MTA)을 수행합니다.
      3. 미토콘드리아 흡수를 위해 37°C의 가습 인큐베이터에 5%_CO2 를 넣어 24시간 동안 유지하세요.
      4. FBS 프리 배양지에 스톡을 희석하여 70 nM MitoTracker Green 작업 용액을 준비합니다.
      5. 12웰 플레이트에서 배지를 흡입하고 70 nM MitoTracker Green 용액으로 교체하세요. 플레이트를 37°C에서 5%_CO2 가 포함된 가습 인큐베이터에서 25분간 배양하여 전체 미토콘드리아 네트워크를 상쇄합니다.
      6. 염색액을 제거하고 1mL의 따뜻한 완전 배양지로 커버슬립을 2번 세척하세요.
      7. 최종 부피를 페놀 적색이 없는 완전 배지로 교체하여 획득 시 배경 자가형광을 최소화합니다.
      8. 커버슬립이나 플레이트를 공초점 현미경 스테이지로 옮깁니다. 현미경의 인큐베이션 챔버를 37°C,_CO2 5%의 일정한 환경을 유지하도록 설정하세요.
      9. 원적색(MitoTracker Deep Red FM)과 녹색(MitoTracker Green) 채널 모두에 대해 적절한 여기/방출 설정을 사용하여 즉시 이미지를 촬영하세요. 추가 내용은 보충 파일 1 을 참조하십시오.
         참고: 모든 염색 및 취급 단계는 저조도 환경에서 수행하여 형광체의 광표백을 방지하십시오. 미토콘드리아 형태의 최적 해상도를 위해 고수치 개구부(NA) 오일 침지 대물렌즈(60배 또는 100배)를 사용하세요.
   2. 고정 세포를 이용한 공초점 면역형광 분석법
      참고: 세포 고정 이후, 독성 파라포름알데히드 및 글루타알데히드 용액은 비할로겐화 유기물로 분류됩니다. 핵산 추출 부산물은 엄격한 분리가 필요하며, 페놀/클로로포름 혼합물은 할로겐 유기물로 폐기되어야 하며, 구아니디늄 기반 완충제는 부식성 유기물로 분류됩니다.
      1. 1절에 설명된 12mm 커버슬립이 포함된 12웰 플레이트에 P0.5 신생아 마우스에서 유래한 1차 전지방 세포를 씨앗으로 옮깁니다.
      2. 미토콘드리아를 분리하고 2절에 명시된 절차에 따라 미토콘드리아 이식 분석법(MTA)을 수행합니다.
      3. 미토콘드리아 흡수를 위해 24시간 배양하세요.
      4. 보충 파일 1에 설명된 프로토콜을 따라 갈색 지방 생성 분화를 유도하며, 필요한 완충제 조성은 표 1을 참조하십시오.
      5. 분화 7일째(168시간)에 세포를 고정하세요. 배양지를 흡입하고 웰당 4% 파라포름알데히드(PFA) 500 μL를 첨가합니다. 상온에서 20분간 배양하세요.
      6. 커버슬립은 웰당 1mL의 얼음 차가운 PBS를 넣어 두 번 세척하세요. 커버슬립을 0.05% 사포닌과 0.2% BSA가 포함된 PBS에 실온에서 1시간 배양하여 세포를 투과성 및 차단합니다. 접시를 궤도 셰이커 위에 올려 부드럽게 저어주세요.
      7. 세포를 1mL PBS로 2번 세척하세요. 핵과 지질 방울을 동시에 염색하세요. 블로킹/투과화 완충액에 Hoechst 33342 1 μg/mL와 BODIPY 1 μg/mL를 도포합니다. 상온에서 30분간 배양하여 플레이트가 빛으로부터 보호되도록 하세요.
      8. 커버슬립을 얼음 차가운 PBS 1mL로 2번 세척하세요. 커버슬립을 깨끗한 유리 슬라이드에 부착하세요. 10 μL 마운턴트를 슬라이드에 바르고 커버슬립 셀 면을 아래로 향하게 하여 마운팅 매체에 올려놓습니다. 샘플을 상온의 어두운 환경에서 하룻밤 건조한 후 영상 촬영을 하세요.
      9. 공초점 현미경으로 이미지를 획득하세요. Hoechst와 BODIPY의 방출 스펙트럼에 맞춰 보정된 두 개의 형광 채널을 사용하세요. 추가 영상 정보는 보충 파일 1 을 참조하십시오.
      10. ImageJ v1.54s를 사용하여 지질 방울 분석을 수행하세요. 지질 방울 채널을 열고 Freehand 선택 과 ROI 관리자 도구를 사용해 개별 방울을 수동으로 식별한 뒤, Analyze | 명령어를 측정하세요 .
      11. RStudio v4.5.2 환경 내 보충 파일 2 에 제공된 R 스크립트를 사용하여 결과 데이터를 처리하고 분석합니다.
          참고: 대표성 있는 샘플링을 위해 커버슬립당 10배 배율로 정확히 다섯 장의 이미지를 촬영하세요. 제공된 스크립트와의 호환성을 위해 R 버전 4.5.2 이상을 사용하세요.
   3. 투과 전자현미경(TEM)
      참고: 전자현미경 부산물의 경우, 고독성 오스뮴 테트록사이드와 비소 함유 나트륨 카코딜레이트 완충제는 독성 중금속 폐기물로 수집되어야 하며, 우라닐 아세테이트는 기관 방사선 안전 프로토콜 하에 방사성 중금속 폐기물로 별도로 관리됩니다.
      1. 2구역에서 분리된 미토콘드리아를 10,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 콤팩트 펠릿을 얻습니다.
      2. 0.1M 카코딜레이트 완충제(pH 7.0)에 2.5% 글루타르알데히드를 첨가하여 펠릿을 고정합니다. 4°C에서 2시간 배양하세요.
         참고: 항상 글루타알데히드 정액을 다루고 화학 훈기 후드 내에서 초기 고정 단계를 수행하세요. 눈 보호를 위해 니트릴 장갑과 고글을 착용하세요. 가열된 글루타알데히드는 매우 자극적인 증기를 방출하므로 가열원과의 접촉을 피하세요.
      3. 미토콘드리아 준비물을 0.05M 나트륨 카코딜레이트 완충제로 3× 10분 정도 세척한 후, 완충제 교체 사이에 펠릿을 유지하기 위해 잠시 원심분리합니다.
      4. 시료에 1% 수용성 오스뮴 테트록사이드(OsO₄)를 첨가하여 시료를 고정합니다. 상온에서 15분간 배양하세요.
         참고: 오스뮴 테트록사이드는 인증된 완전 작동하는 화학 연기 후드 안에서만 개봉 및 취급해야 합니다. 실험복, 안전 고글 또는 전면 보호막, 두꺼운 또는 이중 니트릴 장갑을 착용하세요(물이 튀면 즉시 교체하세요. OsO₄ 는 시간이 지나면서 얇은 니트릴을 침투할 수 있습니다).
      5. 샘플을 2중증류수로 3분 × 5분간 세척하세요. 펠릿에 1% 수용성 우라닐 아세테이트로 15분간 염색하세요.
         참고: 일회용 플라스틱 뒷면 벤치지 작업하세요. 실험실의 특정 구역을 방사성 염색용으로 지정하세요. 이중 장갑, 실험복, 안전 고글을 착용하세요. 시술 후에는 손을 꼼꼼히 씻으세요.
      6. 등급 에탄올 시리즈를 사용해 준비물을 탈수합니다. 펠릿을 30%, 50%, 70%, 95%, 100% 에탄올에 각각 5분씩 배큐하세요.
      7. 미토콘드리아 분획을 삽입하세요. 1:1 에폰/에탄올 용액에서 30분간 배양한 후, 순수 에폰 수지로 1시간 동안 배양하세요.
      8. 샘플을 임베딩 몰드로 옮겨 60°C 오븐에서 48시간 중합합니다.
      9. 수지 블록을 울트라미크토옴에 부착하고 초박방(80nm) 절단을 합니다.
      10. 구간을 격자에 모으세요. 그리드에 1% 수용성 우라닐 아세테이트로 4분간 염색하세요. 이중 증류수로 씻어내세요.
      11. Reynolds의 방법²¹ 후 5분간 시트레이트를 사용해 납 스테인을 사용했습니다. 깨끗이 헹구세요. TEM을 사용해 격자를 시각화하세요. 레이놀즈 방법과 TEM 이미지 획득에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1 을 참조하십시오.

4. 분자 정량화

1. 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 표준 곡선
   1. HepG2 세포를 100mm 배양 접시 다섯 개에 씨앗합니다. 배양균이 합류점의 80%에 도달할 때까지 부양하세요.
   2. 2절에 상세히 설명된 기술적 절차를 따라 채취한 세포에서 미토콘드리아를 분리합니다.
   3. 4.2.6절에 설명된 산-구아니디늄-페놀-클로로포름 방법을 사용하여 생성된 미토콘드리아 펠릿에서 총 DNA를 추출합니다. 마이크로볼륨 UV-VIS 분광광도계를 사용해 DNA 농도를 측정하고 순도를 평가합니다((A₂₆₀/_{A 280} 및 (A₂₆₀/A₂₃₀ 비율).
   4. 뉴클레아제가 없는 물을 희석제로 사용하여 연속 희석 시리즈를 준비합니다. DNA 스톡을 희석하여 반응 부피당 1, ^10-1, ^10-2, ^10-3, ^10-4, ^10-5 ng의 최종 양을 얻습니다. 다음 단계로 넘어가기 전에 각 희석을 5초간 소용돌이로 돌리며 완전한 균일성을 확인합니다.
      참고: 표준 곡선의 농도 범위는 특정 샘플 농도와 최종 PCR 반응량을 기준으로 조정하세요.
2. 수용 세포에서 인간 mtDNA 검출
   1. 1절에서 명시한 밀도 및 배지 조건에 따라 P0.5 신생아 마우스에서 유래한 1차 전지방세포를 60mm 배양 접시에 씨앗 투여합니다.
   2. 기증자 HepG2 세포에서 미토콘드리아를 분리하고 2절에 자세히 설명된 미토콘드리아 이식 분석법(MTA)을 수행합니다.
   3. 배양물을 37°C, 5%_CO2에서 24시간 배큐하세요.
   4. 1절에 설명된 배지 교환 프로토콜을 따라 24–120시간(1, 3, 5일차)에 갈색 지방 생성 분화를 유도합니다.
   5. 배양지를 흡인하고 2mL의 얼음 차가운 PBS로 세포를 2번 세척하세요.
   6. 산-구아니디늄-페놀-클로로포름 방법을 사용하여 총 DNA를 추출합니다^{. 22}.
      참고: 유독 페놀 증기를 흡입하지 않도록 항상 연기 후드 내에서 상분리 및 상분리를 수행하세요. 이중 니트릴 장갑이나 내구성이 강한 화학물질 저항성 장갑을 사용하세요.
   7. 상 분리를 수행하고 간상 위에 위치한 전체 수상 전체를 폐기합니다.
      핵심 단계: 오염을 막기 위해 수상을 완전히 제거하고 하류 qPCR을 위한 높은 DNA 순도를 보장합니다.
   8. 초기 추출 시약 1mL당 100% 에탄올 0.3mL를 첨가합니다. 튜브를 막고 역전으로 힘차게 섞으세요.
   9. 상온에서 3분간 방치한 후 2,000 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리하여 DNA를 알릿으로 만듭니다.
   10. 페놀-에탄올 상원액을 별도의 튜브로 옮겨 단백질 분리를 시도하세요. DNA 펠릿을 추출 시약 1mL당 0.1 M 시트레이트 나트륨(10% 에탄올, pH 8.5)에 재현탁합니다.
   11. 상온에서 30분간 두고, 몇 번 부드럽게 뒤집은 후 2,000 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상원액은 버리세요.
   12. 시트산나트륨 세척 단계를 두 번 더 반복하세요.
   13. 결과 펠릿을 초기 추출 시약 1mL당 75% 에탄올 2mL로 세척합니다.
   14. 실온에서 20분간 두고, 2,000 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리합니다.
   15. 상원액을 버리고 펠릿을 10분간 자연 건조하세요. 8 mM NaOH 0.3–0.6 mL를 첨가하고 펠릿이 사라질 때까지 반복적으로 위아래로 피펫팅하여 DNA를 용해시킵니다.
   16. 12,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 불용성 이물질을 제거합니다. 상청액을 멸균 튜브로 옮기고 HEPES를 사용해 pH를 7–8로 조절합니다.
   17. 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 DNA 농도와 순도((A(260)/A(280) 및 (A(260)/A(230) 비율)를 측정합니다.
   18. 주형을 핵효소가 없는 물에 총 DNA 15ng로 희석합니다. 4.3절에 명시된 광학 96웰 플레이트를 사용하여 인간 mtDNA에 대한 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 수행합니다.
   19. 로그 회귀 모델을 적용하여 증폭 결과를 분석합니다.
       참고: DNA 농도와 해당 임계 주기(Ct) 값을 변수로 사용하여 로그 회귀 분석을 수행하십시오.
3. 유전자 발현을 위한 RT-qPCR
   1. 세포 준비 및 분화
      1. 1.1절에 자세히 설명된 60mm 배양 접시에서 P0.5 신생아 마우스에서 유래한 1차 전지방세포.
      2. 미토콘드리아를 분리하고 2절의 절차에 따라 미토콘드리아 이식 분석법(MTA)을 수행합니다. 배양을 24시간 동안 부화하세요.
      3. 1절 프로토콜에 따라 분화 1일, 3일, 5일차에 샘플링하여 24–120시간 동안 갈색 지방 생성을 유도합니다.
   2. 총 RNA 분리
      1. 배양지를 제거하고 10⁶ 개 세포×당 1mL의 산-구아니디늄-페놀-클로로포름 추출 시약 1mL를 접시에 직접 첨가합니다. 용해액이 균일해질 때까지 반복 피펫팅으로 샘플을 균질화합니다.
         참고: 유독 페놀 증기를 흡입하지 않도록 항상 연기 후드 내에서 상분리 및 상분리를 수행하세요. 이중 니트릴 장갑이나 내구성이 강한 화학물질 저항성 장갑을 사용하세요.
      2. 추출제 시약 1mL당 클로로포름 0.2mL를 첨가합니다. 튜브를 단단히 덮고 손으로 15초간 세게 흔듭니다. 상온에서 3분간 두고, 12,000 × g에서 4°C에서 15분간 원심분리합니다.
      3. 상부 수상을 조심스럽게 뉴클레아제가 없는 새로운 튜브로 옮기세요. 인터페이즈와의 접촉을 피하세요. 샘플은 얼음 보관하세요.
      4. 추출제 시약 1mL당 이소프로판올 0.5mL를 첨가합니다. 부드럽게 반전하여 실온에서 10분간 배양하세요.
      5. 12,000 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리기로 RNA를 펠릿으로 분비합니다. 상청액을 역전시켜 버리세요.
      6. RNA 펠릿을 75% 에탄올 1mL로 세척하세요. 소용돌이를 잠시 수행하고 7,500 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리합니다.
      7. 상청액을 버리고 RNA 펠릿을 실온에서 10분간 자연 건조시킵니다. 펠릿을 뉴클레아제가 없는 30 μL 물에 재현탁합니다. 샘플을 60°C에서 15분간 배양하여 완전한 용해를 보장합니다.
      8. 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 RNA 농도와 순도(A₂₆₀/_{A 280} 비율)를 측정합니다.
      9. 아가로스 겔 전기영동을 통해 RNA 무결성을 검증하세요.
   3. DNase 처리
      1. 각 RNA 샘플에 10× DNase 버퍼 0.1 부피와 DNase 효소 1 μL을 첨가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞으세요. 반응을 37°C에서 30분간 배양합니다.
      2. 슬러리가 균질할 때까지 플릭하거나 소용돌이로 DNase 불활성화 시약을 재현탁합니다. 불활성화 시약(RNA 샘플 0.1 부피 또는 2 μL 중 더 큰 양)을 추가하고 충분히 혼합합니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 이 기간 동안 시약을 3번 튕겨 시약을 현탁 상태로 유지하세요.
      3. 원심분리기 10,000 × g에서 1.5분간 사용. RNA 함유 상정액을 새로운 관으로 옮깁니다.
         중요한 단계: 이후 cDNA 합성을 억제하므로 DNase 불활성화 시약이 전달되지 않도록 주의하세요.
   4. 역전사 (RT)
      1. 처리된 RNA를 정량하고 뉴클레아제가 없는 물에 희석하여 20 μL 반응당 최대 2 μg의 총 RNA를 사용한다.
      2. 제조사의 지침에 따라 얼음 위에 RT 마스터 믹스를 준비하세요. 혼합물을 반응관에 분사하고 RNA 샘플을 추가하세요.
      3. 열 사이클러에 접속하여 키트 제조사에서 지정한 역전사 프로그램을 실행하세요.
   5. 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)
      1. 4.3.4절에서 생성된 cDNA를 PCR 템플릿으로 사용하세요. cDNA를 뉴클레아제 없는 물에 희석하여 10 μL 반응당 20 ng의 작동 농도로 만듭니다. 모든 시약은 얼려 두세요.
      2. SYBR Green, 프라이머, 뉴클레아제가 없는 물을 포함한 마스터 믹스를 준비하세요. 피펫팅 손실에 대한 초과 부피도 포함하세요. 각 광학 qPCR 플레이트의 웰에 반응 혼합물의 10 μL을 투여합니다.
      3. 광학 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 원심분리기를 잠시 사용해 바닥에 액체를 모으세요. 플레이트를 실시간 PCR 기기에 입력하고 빠른 사이클링 모드를 사용해 증폭을 수행합니다.
      4. 임계 주기(Ct) 값을 결정하고 ΔΔCt 방법을 사용하여 상대 정량화를 수행합니다. 증폭 특이성을 확인하기 위해 연기 종료 시 녹는 곡선 분석을 포함하세요.
         참고: 표적 mRNA 풍부도를 내인성 가정 유전자로서 36B4 mRNA 수준으로 정규화하세요. qPCR 플레이트는 설치 후 2시간 이내에 검사하세요; 그렇지 않으면 밀봉판을 4°C에서 보관하세요.
4. 서부 블롯
   1. BCA 분석법을 사용하여 전세포 및 미토콘드리아 추출물의 단백질 농도를 정량합니다(2.1.8 및 2.1.12절 참조).
   2. 샘플당 30 μg의 단백질을 준비하고 적절한 용량의 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼(예: Laemmli 버퍼)를 추가합니다.
   3. 샘플을 95°C에서 5분간 가열하여 변성시키거나(또는 막 단백질의 특정 온도 요구사항을 따릅니다).
   4. 샘플을 폴리아크릴아마이드 젤의 웰에 적재하세요. 염료 전면이 젤 바닥에 도달할 때까지 일정 전압(예: 80–120 V)으로 단백질을 분리합니다.
   5. PVDF 막을 100% 메탄올에 1분간 담근 후 전이 버퍼에서 평형을 맞춰 활성화합니다.
   6. 이식 샌드위치를 조립하여 젤과 막 사이에 기포가 없도록 하세요.
   7. 단백질을 400 mA에서 2시간 동안 전기블롯하여 PVDF 막에 옮깁니다. 과정 내내 시스템을 4°C로 유지하세요.
   8. 비특이적 결합 부위를 차단하는데, 이 5% 무지방 우유는 0.1% Tween 20(TBS-T)이 포함된 Tris 완충 식염수에 조제하여 1시간 실온에서 배양합니다.
   9. 막을 1차 항체(블로킹 용액에 1:1,000 희석)를 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 저어줍니다.
   10. 멤브레인을 TBS-T로 3× 15분 정도 세척하세요.
   11. 고추냉이 과산화효소(HRP) 결합된 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 인큐베이팅.
   12. 멤브레인을 TBS-T로 3번 세척한 후, 마지막으로 1× TBS로 5분간 세척하세요.
   13. 향상된 화학발광(ECL) 기질을 사용하여 단백질 밴드를 시각화합니다. 디지털 영상 시스템을 사용해 신호를 캡처하세요.
       참고: 폴리아크릴아마이드 겔 비율(예: 8%, 10%, 12%)을 표적 단백질의 분자량에 따라 조정하세요. 전기전사 장치에 능동 냉각 시스템이 없다면, 매시간 얼음 용기를 교체하고 챔버를 얼음 욕조에 담가두세요. 시각화가 지연되면 막을 4 °C의 1× TBS에 저장합니다.

결과

미토콘드리아 추출과 구조적 및 호흡기 완전성

미토콘드리아 질량 증가가 갈색 지방 생성에 미치는 영향을 평가하기 위해, 미분화 전지방세포에서 미토콘드리아 이식 분석(MTA)을 수행하였습니다(그림 1A). 미토콘드리아는 1차 쥐 전치세포(mMito)와 인간 간 HepG2 세포주(hMito)에서 분리되었습니다. 웨스턴 블롯 분석 결과, 두 제제 모두 전체 세포 추출물에 비해 미토콘드리아 마커 TOMM20이 매우 풍부함을 보였다(그림 1B). 분리된 분획에 대한 투과 전자현미경(TEM) 분석에서는 보존된 미토콘드리아 형태와 일치하는 명확한 이중 막 구조가 확인되었습니다(그림 1C). 산소 측정 검사 결과, 미토콘드리아 제제를 배지에 첨가한...

토론

지방 생성에 미토콘드리아 이식의 생물학적 함의가 있습니다

우리의 결과는 인간과 쥐 양쪽에서 유래한 외인성 미토콘드리아가 분화된 전지방세포의 내인성 미토콘드리아 네트워크에 포함될 수 있지만, 미토콘드리아 질량의 인위적 증가만으로는 갈색 지방 생성 프로그램을 촉진하기에 충분하지 않음을 보여줍니다. 이 발견들은 갈색 지방 생성의 특징적인 미토콘드리아 확장이 기전적 제한 요인이나 주요 동기가 아니라 세포 분화의 결과임을 시사합니다. 이러한 관찰은 MTA가 분화를 유의미하게 촉진하거나 대사 재프로그래밍을 유도한 다능성 줄기세포 연구들과는 대조된다^23,24. 본 연구에서는 이전에 확립된 전지방세포로 특징지어졌던 BAT 기질 혈관 분획(SVF)에서 마우스 미토콘드리아를 분리하

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 mm plate	SPL 생명과학	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 mm glass coverslips	Marienfeld	111520
12-well plate	SPL 생명과학	30012SPL
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Invitrogen	28908
18 mm glass coverslips	HART	-
24-well plate	SPL 생명과학	30024SPL
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610158
35 mm plate	SPL 생명과학	20035SPL
6-well plate	SPL 생명과학	30006SPL
60 mm culture dish	SPL 생명과학	20060SPL	Used for primary preadipocyte and DNA/qPCR experiments; supplier/catalog not provided
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulin)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	Used for RNA integrity verification; supplier/catalog not provided
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7077
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Axio Observer inverted microscope stand	Carl Zeiss	431007-9901-000	Added from Supplemental Methods
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	Added from Supplemental Methods; catalog not provided
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	Added from Supplemental Methods
BD LSRFortessa X-20 cell analyzer	BD Biosciences	-	Existing entry standardized to match supplemental file
BioRender	BioRender	-	Used to create Figure 1 workflow
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transcription Kit	Invitrogen	4374966
Cell Strainer 100 μm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 μm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM Powder, High Glucose, Pyruvate	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, no phenol red	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	Solvent for induction medium; supplier/catalog not provided
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	Flow cytometry analysis software
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antibody	Santa Cruz	sc-32233
Glucose	Gibco	15023-021
Glutamate	Sigma	G1626
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	Statistical/logarithmic regression analysis software
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	Lipid droplet image analysis software
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin syringe	Cranberry	AAJECIN3	Used for cell homogenization; supplier/catalog not provided
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
LAMP-1 Antibody	Abcam	ab25245
Lane Marker Reducing Sample Buffer	Thermo Scientific	39000
Malate	Sigma	M1000
MgCl2	Calbiochem	208291	Component of mitochondrial assay solution; supplier/catalog not provided
MgSO4	Sigma	M2643
Microvolume UV-Vis spectrophotometer	NanoDrop	ND-1000	Used for DNA/RNA quantification; supplier/catalog not provided