고고도 저산소 상태 시뮬레이션은 쥐의 상처 치유를 지연시킵니다

요약

이 연구는 고고도 저기압 저산소 상태에서 상처 치유 지연의 쥐 모델을 개발하고 예비적으로 검증하였습니다.

초록

고지대 저기압 상태는 상처 저산소증 장기화와 치유 장애를 초래할 수 있으나, 표준화된 모델은 여전히 드물다. 본 연구에서는 상처 지연 치유 모델을 개발하고, 통제된 저기압 시스템을 이용해 고지대 저산소증을 시뮬레이션하여 예비 검증하였습니다. 쥐들은 3000m(기압: 70.1 kPa, 부분산소압: 14.7 kPa)에서 8000m(기압: 35.6 kPa, 부분 산소압: 7.5 kPa)까지의 시뮬레이션 고도에 배치되어 안전 임계치를 결정하고 산화 스트레스와 피부 저산소증을 평가하였다. 결과는 시뮬레이션 고도 6000m에서 사망 위험이 증가하는 반면, 5000m 이하에서는 관용이 관찰되었다. 고도 상승은 산화 스트레스 악화와 피부 저산소증 증가와 관련이 있었으며; 상처 치유에 고도 의존적 지연, 관류 감소, 콜라겐 재형성 억제, 염증 반응 악화를 보였습니다. 혈관 재생 인자의 상향 조절에도 불구하고 미세혈관 밀도는 감소했습니다. 전반적으로 본 연구는 고지대 저산소증 유발 만성 상처의 기전과 개입을 조사하는 데 적합한 쥐 모델을 개발하고 예비 검증하였습니다.

서론

피부 상처 복구는 광범위하고 중요한 임상적 도전 과제입니다. 급성 외상부터 다양한 치유되지 않는 상처에 이르기까지, 이러한 상태들은 의료 시스템과 환자의 삶의 질에 지속적인 부담을 안겨줍니다 1,2,3,4,5,6. 상처 치유는 단일한 사건이 아니라 매우 조율되고 겹치는 다단계 과정입니다: 염증 세포, 기질 세포, 각화세포, 미세혈관이 함께 세포외 기질과 다양한 신호 네트워크의 공동 조절 하에 장벽을 재구축하고 조직을 재구성합니다 7,8,9,10 . 수리는 에너지를 많이 소모하고 내부 환경에 극도로 민감하기 때문에, 산화 스트레스 증가, 면역 조절 장애, 미세순환 관류 기능 저하 등 전신 대사 및 생리적 상태의 변화는 정상 수리 연쇄 반응을 여러 지점에서 방해하여 염증 장기, 재생 부족, 비정상적인 재형성으로 이어질 수 있습니다 9,11,12,13^{,14, 15}.

산소 공급은 상처 수리 과정을 제한하는 핵심 요인으로, 에너지 대사와 세포 이동/증식에 관여하며, 저산소 신호 전달 경로를 통해 혈관 신생과 염증 반응을 조절합니다 16,17,18. 초기 상처 단계의 일과적 저산소는 저산소 유발 인자를 안정시키고 적응적 수리 프로그램을 시작합니다. 그러나 저산소증이 과도하거나 지속될 경우, 혈관신생 신호가 보상적으로 상향 조절될 수 있음에도 불구하고 효과적인 미세혈관 재건으로 전환되지 못할 수 있습니다. 한편, 대식세포 표현형 전환과 염증 퇴행은 불균형에 더 취약해지며, '저산소-염증-혈관 재생 결핍'이라는 악순환을 형성합니다^19,20,21,22. 이는 특히 고지대 환경에서 중요하다. 대기압 감소는 흡입 산소 분압을 낮추고, 지속적인 저산소증을 유발하여 상처 치유 장애와 감염 관련 합병증 위험을 높인다 23,24,25,26.

고지대에 노출되면 인간에게 현저한 저산소 스트레스 반응이 유발됩니다²⁷. 고지대 환경은 지속적인 조직 저산소증, 부적절한 관류 부족, 상처 부위의 염증 반응을 초래할 수 있습니다²⁸. 이러한 병태생리학적 변화는 과도한 활성 산소 종을 촉진하고, 프로테아제를 활성화하며, 세포 노화를 유도하는 동시에 중간엽 줄기세포의 기능을 방해하여 치유 과정을 저해할 수 있습니다^29,30. 고지대 노출이 인간 피부 상처 치유에 미치는 영향을 직접 평가한 연구는 아직 제한적입니다. 따라서 저기압 저산소 동물 모델을 사용하면 고도 관련 요인이 상처 수리에 미치는 영향을 검증하는 데 도움이 될 수 있습니다.

고정 고도에서 연구된 이전 동물 모델들은 상처 치유 지연을 보고한 바 있습니다; 그러나 고도 의존적 영향, 저기압 상태에 장기간 노출되는 안전 기준, 그리고 국소 피부 저산소증의 직접적인 증거는 명확하지 않다²⁶. 더욱이, 치유 장애에 대한 체계적인 평가가 부족하여 근본 메커니즘에 대한 연구와 잠재적 개입 표적 식별에 제한이 있습니다³¹. 본 연구에서는 저기압 조절 시스템을 기반으로 한 피부 상처 모델을 개발하고 예비 검증하여 통제된 조건에서 고고도 저기압 저산소증을 시뮬레이션하였습니다. 단계별 모의 고도 노출 전략을 사용하여 지속적 저기압 노출의 안전 범위를 정의하고 전신 지표를 통해 저기압 저산소증의 생물학적 영향을 평가했습니다. 무엇보다도, 우리는 생체 내에서 저기압 환경이 국소적인 피부 산소 공급 제한을 실제로 일으킨다는 것을 추가로 확인했습니다. 이후 지속적인 저기압 저산소증이 상처 봉합을 고도에 따라 지연시키며, 조직학적 변화와 주요 경로 이상을 동반함을 입증했습니다. 전반적으로 본 연구는 고고도 저산소증과 관련된 만성 상처에 대한 동물 모델 플랫폼을 개발하고 예비 검증하여 기전 규명과 후속 치료 전략의 체계적 평가를 가능하게 했습니다³².

프로토콜

동물을 대상으로 한 모든 실험 절차는 중국전자과학기술대학교(No. 106142025091534170)와 육군의과대학(No. AMUWEC20265509). 이 연구에 포함된 실험 설계 및 분석의 그래픽 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 또한, 이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

실험동물과 윤리적 선언
이 연구는 중국 청두 다수오 실험동물 주식회사에서 구입한 수컷 스프래그-도울리(SD) 쥐를 사용하였습니다. 모든 동물은 실험 전 표준 조건에서 7일간의 적응 기간을 거쳤습니다.

포함 및 제외 기준
동물 포함 기준은 다음과 같았습니다: 수컷 SD 쥐, 생후 6주에서 8주, 체중 200–250g, 건강해 보이고 정상적인 행동을 보이며 피부 병변이나 감염이 없는 경우.

동물 제외 기준은 다음과 같았습니다: 상처 모델링 후 명백한 감염이 보이는 상처; 비표준 치유 상처나 열상; 실험 중 사망 또는 마취로 인한 사고사.

데이터 포인트 제외 기준은 다음과 같았습니다: 광범위한 딱지, 모발 폐색, 또는 조명 불균형이 있는 상처 이미지; 레이저 스펙클 대비 영상(LSCI) 이미지에서 움직임 아티팩트를 보여주는 것; 명백한 주름, 파편화, 또는 결손된 표적 부위를 보이는 조직 절편; 명백한 용혈 혈청 샘플; 과다 노출 또는 잘못된 항체 위치 측정이 있는 면역형광(IF) 또는 면역조직화학(IHC) 영상

제외 처리:
모든 제외된 동물 또는 데이터 포인트에 대해, 각 그룹의 최종 유효 표본 크기가 모든 평가 분석에서 N ≥ 3인지 확인하기 위해 보조 실험을 통해 유효한 데이터를 다시 얻었습니다.

저압 조절 시스템과 모의 고고도 저산소 환경
저기압 조절 시스템을 사용하여 고고도 저산소 환경을 시뮬레이션하여 구축하였습니다. 이 시스템은 객실 내 공기압을 정밀하게 조절하여 서로 다른 고도에 해당하는 대기압을 재현함으로써 주변 산소 분압을 낮추고 통제된 저산소 노출을 유도합니다(그림 2A).

객실 압력은 3000m, 4000m, 5000m, 6000m, 7000m, 8000m의 고도를 시뮬레이션하도록 조정되었으며, 자세한 매개변수는 표 1에 제공되었다. 실험 내내 SD 쥐들은 실험 배정에 따라 그룹으로 배치되었습니다. 객실 운영 중에는 내부 압력, 온도, 습도를 지속적으로 모니터링하여 압력을 제외한 모든 환경 조건이 표준 실험실 주거와 유사하도록 했습니다. 주거 환경은 22–24°C의 온도, 50%–60%의 상대 습도, 12시간 내내 빛과 어둠 주기를 유지했고, 표준 식사와 식수를 무료로 이용할 수 있었습니다.

저기압 노출의 안전성 평가 및 생존 분석
지속적인 저압 노출의 안전 마진을 평가하기 위해, 쥐들은 개별적으로 번호를 매기고 컴퓨터가 생성한 무작위 수열 알고리즘(엑셀의 RAND 함수)을 사용해 실험 그룹에 무작위로 배정했습니다. 이 배정은 이후 동물 관리, 데이터 수집 또는 결과 평가에 관여하지 않은 연구자가 수행했습니다. 고지대 경사에 노출된 기준 동물 연구를 바탕으로, 각 그룹의 표본 크기는 12³³명으로 설정되었습니다. 쥐들은 해발 500m의 노르믹 대조군과 3000m, 4000m, 5000m, 6000m, 7000m, 8000m의 모의 고도 그룹으로 나뉘었습니다. 각 그룹의 쥐들은 각자의 환경에 30일 동안 지속적으로 보관되었습니다. 2일마다 저압 조절 시스템이 잠시 30분간 해수면 상태로 복원되어 우리 청소와 식량 및 물 공급이 가능합니다. 감압 및 재감압 동안 압력 변화 속도는 약 분당 300m로 유지되어 기압 외상 위험을 최소화합니다. 이 기간 동안 모든 쥐의 전반적인 상태와 사망 현상을 매일 관찰하고 기록했습니다. 생존 곡선은 Kaplan-Meier 방법으로 그렸고, 그룹 간 생존 차이를 비교하기 위해 로그 랭크 검정을 수행하였다.

혈청 산화 스트레스 관련 표지자의 검출
저압 노출 21일째에는 마취 상태의 쥐에서 정맥 혈액 샘플을 채취하였습니다. 상온에 보관한 후, 혈청은 원심분리(1,000 × g , 4 °C에서 15분간 가열)하여 -80 °C에서 보관하여 후속 사용을 위해 보관했습니다. 해당 분석기 키트를 사용하여 락테이트 탈수소효소(LDH), 말론디알데히드(MDA), 슈퍼옥사이드 디뮤타제(SOD)의 혈청 농도를 측정하였습니다.

피부 조직의 저산소 상태 평가
저산소 감지 키트는 피부 조직의 저산소증을 평가하는 데 사용되었습니다. 간단히 말해, 저기압 노출 4일차와 7일째에 쥐들에게 복강 내 피모자드(60 mg/kg)를 주사했으며; 쥐들은 주사 후 1시간 만에 안락사되었고, 등을 부린 피부 조직을 채취하여 분석했습니다. 상세한 안락사 절차는 다음과 같습니다: 미국 수의의학회(ABA)의 안락사 지침에 따르면, 동물은 유도 챔버에 넣어 4–5% 이소플루란이 함유된 산소를 사용해 마취를 유도했습니다. 동물이 의식을 잃으면 이소플루란 농도를 2–3%로 낮추고 최소 10분간 유지합니다. 경추 탈구를 확인 방법으로 시행하기 전에, 심장 박동과 호흡이 멈췄는지 확인해야 합니다. 조직 샘플은 액체 질소에 냉동 보존되어 -80 °C에서 보관되어 이후 사용되었습니다. 절편은 냉동 조절기 미세절기를 사용해 준비되었습니다. 조직 내 저산소 부위를 표지하기 위해 IF 염색이 시행되었습니다.

모든 형광 이미지는 자동 슬라이드 스캐너를 사용해 촬영되었습니다. 형광 파라미터 설정은 다음과 같았습니다: DAPI(여기 파장 365 nm ± 10 nm, 방출 파장 440 nm ± 40 nm), Cy3(여기 파장 542–566 nm, 방출 파장 579–611 nm), Cy5(여기 파장 628 nm, 방출 파장 692 nm). 저산소증 신호는 ImageJ 소프트웨어를 사용해 정량적으로 분석되었습니다.

쥐의 전층 피부 상처 모델
지속적인 저기압 상태에서 피부 상처 치유 변화를 평가하기 위해, 상처 모델링을 하기 전에 쥐들을 먼저 그룹화하여 환경에 적응시켰습니다. 쥐들은 개별적으로 번호를 매기고, 컴퓨터가 생성한 랜덤 숫자 연속(엑셀의 RAND 함수)을 사용해 3000m, 4000m, 5000m 고도를 시뮬레이션하는 정상산소 대조군 또는 저압 노출군에 무작위로 배정되었습니다. 무작위 배정은 이후 상처 생성, 수술 후 관리, 결과 평가에 관여하지 않은 연구자가 수행하였습니다. 각 그룹의 상세 매개변수는 다음과 같습니다: 정상산소 대조군은 해발 500m(대기압: 101 kPa, 부분 산소압: 21 kPa)에 위치했으며; 3000m 그룹(70.1 kPa, 14.7 kPa); 4000m 그룹(61.6 kPa, 13.1 kPa); 그리고 5000m 그룹(54 kPa, 11.3 kPa)입니다.

7일간의 적응 기간 후, SD 쥐는 마취 상태에서 2% 이소플루란을 흡입하여 마취 상태로 유지되었습니다. 동시에 표시된 수술 부위에 에피네프린을 함유한 5% 리도카인(희석 비율: 1:100,000)을 국소 침투하여 수술 전후 진통과 지혈을 제공합니다. 생검 펀치(밑부분에 직경 10mm 원형 칼날)를 사용해 피부 절개를 만듭니다. 생검 펀치를 쥐의 등쪽 피부에 대고, 부드럽게 회전시켜 원형 칼날이 피부를 점차 자르고 표면 피하 근막에 도달하도록 합니다. 생검 펀치를 제거하면 지름 약 10mm의 규칙적인 원형 피부 절개가 형성됩니다.

상처가 생긴 후, 각 그룹의 쥐들은 원래 환경에 돌려 실험 종료 지점까지 유지되어, 상처 치유 과정이 미리 정해진 산소 조건 하에서 진행되도록 했습니다.

상처 치유 과정의 거시평가
상처 사진은 상처 형성 후 0일, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일째에 균일한 조명과 일정한 영상 거리 하에 촬영되었습니다. 상처 면적은 이미지 J를 사용하여 측정되었습니다. 간략히 각 시점에서 얻은 상처 이미지는 이미지 J에 가져와 눈금에 맞게 보정되었으며, 상처 경계를 수동으로 윤곽 표시하여 상처 부위³⁴를 결정했습니다. 상처 치유 계산은 다음과 같았습니다: 상처 치유 (%) = (초기 상처 부적 − 현재 상처 부적) / 초기 상처 부적 × 100%.

상처 미세순환 평가
상처 치유 7일째에 상처 부위의 미세순환 혈액 관류를 LSCI 시스템을 사용해 평가하였다. 검사 전, 쥐들은 2% 이소플루란으로 흡입하여 마취를 받고 체온을 유지하기 위해 온도 조절 수술대에 고정되었습니다. 등쪽 상처 부위는 완전히 노출되어 있었고, 레이저 스펙클 프로브는 상처 위 약 20cm 수직으로 위치했습니다. 프로브 출력은 110 mW, 샘플링 주파수는 30 Hz, 노출 시간은 3초로 설정되었습니다. 어두운 환경에서 상처 부위의 혈류 관류 가시 컬러 이미지를 확보하세요. LSCI 소프트웨어를 사용해 혈류 관류 가짜 색상 이미지에 상처 부위를 수동으로 윤곽을 표시하세요; 소프트웨어는 해당 부위의 혈류 관류 값을 3초 단위(임의의 단위 [A.U.])에 자동으로 계산합니다. 마지막으로, 관류 값을 적절한 소프트웨어로 내보내 플롯을 작성하세요.

조직학적 염색 및 콜라겐 재형성 분석
동물들은 지정된 시점에 안락사되었고, 온전한 상처와 주변 피부 조직은 채취, 고정, 탈수, 파라핀 삽입, 절개 수술이 이루어졌습니다. 헤마톡실린 및 에오신(HE): 상처 폭, 재상피화 범위, 재생된 표피 두께를 평가하는 데 사용; 매슨의 삼색 염색법: 콜라겐 섬유 침착 평가와 콜라겐 부피 분율 계산에 사용됨; Sirius 레드 스테인: 편광 현미경 하에서 콜라겐 타입 I(COL I)와 콜라겐 타입 III(COL III)를 구별하고 COL I/COL III 비율을 계산하는 데 사용됩니다.

면역조직화학 염색
파라핀 절편은 IHC 또는 IF 염색 전에 탈액, 재수화, 항원 채취를 거쳤습니다. 1차 항체는 4°C에서 하룻밤 배양한 후 해당 2차 항체를 추가하였습니다. 특정 항체 정보와 해당 희석 수치는 재료표에 제공되어 있습니다. IHC 절편은 DAB로 개발되었고, IF 절편은^35,36번 핵에 대해 DAPI 염색이 적용된 형광 2차 항체를 사용했습니다. 모든 이미지는 동일한 조건에서 촬영되었으며 ImageJ 소프트웨어를 사용해 정량화되었습니다.

통계 분석
모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 제시됩니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 단일 시점에서 여러 그룹 간 비교를 위해서는 일방향 분산분석(ANOVA)을 적용했으며, 유의미한 전체 차이가 발견되면 이후 집단 간 분석에 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하였습니다. 여러 시점에 걸쳐 상처 치유 데이터를 평가한 경우, 치료군과 시간을 독립적인 요인으로 포함하여 주요 효과와 상호작용을 평가하기 위해 양방향 ANOVA를 수행하였습니다. 사후 분석도 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 수행되었습니다. 통계적 검정력을 추가로 평가하기 위해, G*Power 소프트웨어에서 주요 평가 지점(14일차 상처 치유)을 기반으로 사후 검정력 분석이 수행되었습니다.

생존 분석에서는 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생존 곡선을 그렸고, 그룹 간 생존 차이를 비교하는 데 로그 랭크 검정을 사용했습니다. 여러 그룹 간의 쌍별 비교에서는 Bonferroni 보정을 적용하여 다중 비교에서 발생한 유형 I 오류 위험을 통제하였습니다. 모든 통계 검정은 양측 검정이었으며, P < 0.05는 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다.

상처 부적 측정, 조직학적 및 면역조직화학적 정량 분석, LSCI 분석을 포함한 모든 결과 평가는 연구 그룹 배정에 눈을 가린 단일 연구자가 수행하였습니다.

결과

저압에 의해 유발된 지속성 저산소증에 대한 안전 마진의 검증
Kaplan–Meier 생존 분석은 시뮬레이션 고도가 상승함에 따라 생존 곡선이 점진적으로 하강하는 것을 보여주었으며, 사망 사건은 6000m 그룹에서 처음 관찰되었습니다(그림 2B). Bonferroni 보정과의 쌍별 비교에서는 대조군과 6000m에서 8000m 그룹 간 생존율에 통계적으로 유의미한 차이가 없었습니다. 30일째 기준으로 대조군, 3000m, 4000m, 5000m그룹, 6000m그룹, 7000m그룹, 8000m그룹의 최종 생존율은 각각 100%, 100%, 100%, 100%, 83.33%, 75.00%, 58.33%였습니다. 30일 노출 기간 동안 모의 고도≤5,000m에 노출된 쥐에서는 생존 위험 증가가 유의미하지 않았습니다. 이 생존 데이터를 바탕으로 후속 연구의 실험 상한선이 정의되었습니다. 50...

토론

고지대 환경은 조직 저산소증, 혈액 관류 감소, 염증 반응을 유발하여 상처 치유 과정을 저해하며, 이는 과도한 활성산소 생성, 프로테아제 활성화, 세포 노화, 중간엽 줄기세포 기능 장애를 촉진합니다 27,28,29,30. 현재 인간 연구가 고지대 영향에 한계가 있는 상황에서, 고산 저산소증을 모방하는 표준화된 동물 모델의 개발은 매우 중요합니다.

생존 분석 결과, 최대 5000m까지 30일간 연속 노출은 사망 위험을 유의미하게 증가시키지 않는 반면, 고도가 높아질수록 누적 생존 위험이 발생함이 입증되었습니다. 고도≥6000m에서 시뮬레이션된 그룹의 사망자는 주로 첫 며칠 내에 집중되었다. 이는...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자동 슬라이드 스캐너	올림포스	VS200	조직 절편 스캐닝
소 혈청 알부민 (BSA)	서비스바이오	GC305010	IHC/IF용 차단 시약
CD206 항체	단백질 기술	18704-1-AP	M2 대식세포 검출 (희석 1:200)
CD31 항체	앱캠	ab182981	미세혈관 밀도 검출 (희석 1:800)
CD86 항체	화비오	ER1906-01	M1 대식세포 검출 (희석 1:200)
CK19 항체	화비오	ET1601-6	재상피화 평가 (희석 1:200)
DAB 기판 키트	ZSGB-BIO	ZLI-9018	IHC 염색을 위한 염색 기질
FITC 결합 염소-토끼 방지 IgG	서비스바이오	GB22303	IF용 형광 2차 항체 (희석 비율 1:100)
G*파워	독일 뒤스부르크-에센 대학교	www.gpower.hhu.de	통계적 검정력 계산
그래프패드 프리즘 소프트웨어	그래프패드 소프트웨어	https://www.graphpad.com/	통계 분석 및 그래프 생성
헤마톡실린 염색 용액	J& K 사이언티픽	LM10N13	H& E 염색
HIF-1&알파; 항체	바이오스	BS-0737R	저산소증 관련 신호 감지 (희석 1:100)
HRP 결합 염소-항토끼 IgG	서비스바이오	GB23303	IHC에 대한 2차 항체 (희석 1:100)
저기압 조절 시스템	상하이 위옌 인스트루먼트 유한회사.	LP-1500	점진적으로 고고도 저기압성 저산소증을 시뮬레이션하는 데 사용됨
Hypoxyprobe-1 키트	히폭시프로브 주식회사	HP1-100	생체 내 저산소증 감지에 사용됨
IF555 티라마이드 신호 증폭 키트	서비스바이오	G1233	형광 신호 증폭 증폭에 사용됨
IL-10 항체	화비오	HA722032	항염증 사이토카인 검출 (희석 1:100)
IL-1&베타; 항체	화비오	HA723965	염증성 사이토카인 검출 (희석 1:100)
ImageJ 소프트웨어	미국 국립보건원(NIH)	https://imagej.net/ij/download.html	이미지 정량화
이소플루란	RWD 라이프 사이언스 주식회사	R510-22-16
Ki-67 항체	화비오	HA721115	각질세포 증식 검출 (희석 1:400)
레이저 스펙클 혈류 영상 시스템	RWD 라이프 사이언스 주식회사	RFLSI ZW	평가 사항은... 혈액 관류
LDH 분석 키트	난징 건청 생명공학 연구소	A005-1-2	혈청 LDH 측정값
마손 S 트리크롬 스테인 키트	서비스바이오	G1006-100ML	콜라겐 침착 분석
MDA 분석 키트	난징 건청 생명공학 연구소	A003-1-1	지질 과산화 평가
시리우스 레드 스테인 키트	서비스바이오	G1078-100ML	콜라겐 I/III 구분
SOD 분석 키트	난징 건청 생명공학 연구소	A001-1-1	혈청 SOD 활성 측정
TNF-&α; 항체	화비오	ER65189	염증성 사이토카인 검출 (희석 1:200)
VEGF-A 항체	화비오	ET1604-28	혈관신생 관련 신호전달 검출 (희석 1:200)