1β-하이드록실-5α-클로로-8-에피-잔타틴은 IKKα/β를 표적으로 하고 NF-κB 신호 경로를 억제하여 염증 반응을 억제합니다

요약

세스퀴터펜 락톤 XTT는 대식세포에서 지지다당류(LPS)에 의해 유발되는 염증 반응을 효과적으로 완화합니다. XTT는 IKKα/β를 표적으로 하여 MAPK 활성화에 영향을 주지 않으면서 NF-κB 신호를 억제하여, 시험관 내에서 강력한 항염증 효과를 발휘합니다.

초록

핵인자-κB(NF-κB) 연쇄 반응의 조절 장애는 염증성 질환의 진행과 밀접하게 연관되어 있습니다. IκB 키나제(IKK)는 NF-κB 활성의 중심 조절자로 잘 확립되어 염증 병리 치료에 매력적인 치료 후보자입니다. 세스퀴테르펜 락톤 1β-하이드록실-5α-클로로-8-에피-잔타틴(XTT)은 강력한 항암 효과를 내는 것으로 문서화되어 있습니다. 그러나 항염증 작용과 그 근본적인 분자 기전은 아직 명확하지 않습니다. 이 연구에서 XTT는 지다당류(LPS) 활성화된 RAW264.7 대식세포에서 질소 산화물(NO)과 프로스타글란딘 E2(PGE₂) 합성을 현저히 억제했습니다. XTT는 또한 유도성 일산화질소 합성효소(iNOS), 사이클로옥시게나제-2(COX2), 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6)의 LPS 유발 mRNA 농도를 상당히 낮췄습니다. 더불어, XTT는 LPS 처리로 유도되는 iNOS와 COX2의 단백질 수치를 하향 조절했습니다. 기전 수준에서 XTT는 미토젠 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 연쇄 반응의 활성에 유의미한 변화를 주지 않았습니다. 반대로 XTT는 IKKα/β와 상호작용하여 LPS에 의해 인산화 및 억제성 κBα(IκBα)의 분해를 강하게 차단하여 NF-κB 핵 전위를 손상시켰다. 이 데이터를 종합해 보면, XTT는 IKKα/β를 표적으로 하고 NF-κB 신호를 차단함으로써 시험관 내에서 강력한 항염증 효과를 유발합니다. 이 결과는 XTT가 항염증제 개발에 유망한 선도 화합물로 작용할 수 있음을 시사합니다. 직접적인 IKKα/β 억제와 치료 잠재력을 검증하기 위해서는 추가적인 생화학적 및 생체 내 연구가 필요합니다.

서론

염증은 감염, 조직 손상 및 기타^{환경 문제에 대응}할 수 있도록 하는 엄격히 조절된 생물학적 과정입니다. 급성 염증 반응은 일반적으로 보호 효과가 있지만, 염증 경로의 지속적인 활성화는 조직 항상성을 방해하고 염증성 장질환(IBD)과 류마티스 관절염(RA)을 포함한 만성 질환의 발병 및 진행에 기여할 수 있습니다^2. 수많은 세포 내 신호 전달 네트워크가 염증 조절에 참여하며, 그중 핵 인자-κB(NF-κB) 경로는 가장 광범위하게 연구된 경로 중^{하나입니다.}

NF-κB 계열의 구성원들인 p50, p52, p65(RelA), RelB, c-Rel은 면역과 염증에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는 이량체 전사 인자 역할을 합니다. 기저 조건에서는 NF-κB 이합체가 κB(IκB) 단백질 억제제와 결합하여 세포질 내에서 비활성 상태로 유지됩니다. 지지다당(LPS) 또는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)과 같은 염증 매개체에 의해 자극된 후, IκB 키나아제(IKK) 복합체가 활성화되어 IκBα를 인산화하여 유비퀴틴화와 분해를 일으킵니다. 이 과정은 NF-κB 복합체가 핵 내에 축적되어 염증 매개체와 사이토카인의 전사를 시작할 수 있게 합니다⁶. 과도하거나 지속적인 NF-κB 활성화는 다양한 염증 및 자가면역 질환과 밀접한 관련이 있기 때문에, IKK 신호 전달 수준에서의 약리학적 개입이 상당한 관심을 받고 있습니다 ^7,8,9.

천연 제품은 오랫동안 항염증^치료제를 포함한 약물 개발에 중요한 공급원이었습니다. 1β-하이드록실-5α-클로로-8-에피-잔타틴(XTT)은 Xanthium sibiricum^11,12에서 분리된 세스퀴테르펜 락톤입니다. 이전 연구들은 XTT가 ROS 매개 ERK/p38 MAPK 활성화와 글루타치온 고갈에 의한 JAK2/STAT3 억제를 통해 인간 간세포암세포에서 세포 증식을 억제하고 세포 그러나 XTT의 항염증 잠재력과 관련 분자 기전은 아직 잘 이해되지 않았습니다.

현재 연구 결과는 XTT가 시험관 내에서 상당한 항염증 효과를 보인다는 것을 보여줍니다. 기전 연구는 XTT가 IKKα/β와 상호작용하여 NF-κB 신호를 억제하여 활성화된 대식세포에서 염증 반응을 억제함을 보여줍니다. 이러한 발견은 XTT가 항염증제 개발에 유망한 선도 화합물일 수 있음을 시사합니다.

프로토콜

이 연구는 확립된 상업용 세포주만 포함했으며, 인간 참가자, 임상 샘플, 동물 실험은 포함하지 않았습니다. 따라서 기관 윤리 승인과 사전 동의는 필요하지 않았습니다. 모든 실험은 기관 실험실 안전 지침에 따라 수행되었습니다. 유해 물질은 지정된 연기 후드에서 취급되었으며, 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용했습니다. 화학 및 생물학적 폐기물은 기관 규정에 따라 처리되었습니다. 프로토콜에 사용되는 화학물질, 키트 및 시약은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 세포 배양
RAW264.7 마우스 대식세포, HeLa 인간 자궁경부암세포, HEK293T개의 인간 배아 신장 세포가 중국과학원 세포은행(상하이, 중국)에서 구입되었습니다. 모든 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 Dulbecco's 변형 독수리 배지(DMEM)에서 유지되었습니다. 배양 환경은 37°C, 5% CO₂, 포화 습도로 설정되었습니다.

2. 세포 생존 가능성 분석
세포 생존 가능성은 세포 계수 키트-8(CCK-8) 검사 법을 통해 평가하였습니다. RAW264.7 세포(2.5 × 10⁴ 셀/웰)를 96웰 플레이트에 플레이트링하고 37°C에서 하룻밤 배양했습니다. 그 후 세포들은 LPS 유무 중 24시간 동안 다양한 농도의 XTT로 처리되었습니다(0.5 μg/mL). LPS 농도와 치료 기간은 예비 실험에서 중등도 염증 반응을 유도하면서도 유의미한 세포독성을 유발하도록 최적화되었습니다. 이후 각 웰에 10 μL CCK-8 시약이 첨가되었고, 판은 2시간 동안 37°C에서 유지되었다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 540 nm 거리에서 흡광도를 측정했습니다.

3. 세포 배양 배지 내 NO 및 PGE₂ 수치 측정
RAW264.7 세포는 24웰 플레이트에 2.5 × 10⁵ 셀/웰 밀도로 플레이트링되어 37 °C에서 하룻밤 배양했습니다. 세포는 LPS 자극 2시간 전 XTT 또는 추가로 24시간 동안 TNF-α(15 ng/mL)로 사전 처리되었습니다. 염증 도전 이전에 XTT와 세포 표적 간의 적절한 상호작용을 위해 2시간 전의 치료 기간이 선택되었습니다. 배양 배지 내 산화질소(NO)와 프로스타글란딘 E₂(PGE₂) 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 정량화되었습니다.

4. 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)
RAW264.7 세포(2×^{10개 6} 개 세포)를 6웰 플레이트에 하룻밤 동안 플래팅하고, LPS 챌린지(0.5 μg/mL) 전 2시간 동안 다양한 용량의 XTT로 전처리하여 24시간 동안 진행했습니다. 총 RNA는 제조사 지침에 따라 TRIzol 시약을 사용해 분리되었습니다. RNA 농도와 순도는 분광광도계를 사용해 평가되었고, 후속 분석에는 A260/A280 비율>1.8 시료가 사용되었습니다.

총 RNA(2 μg)는 cDNA 합성 키트를 사용해 최종 반응량 20 μL로 역전사하여 cDNA로 전환했습니다. 실시간 PCR은 SYBR Green 화학을 사용하여 실시간 PCR 검출 시스템에서 수행되었습니다. 프라이머 서열은 다음과 같다:

아이노스 포워드: 5′-GGA TCT TCC CAG GCA ACC A-3′
INOS 역: 5′-AAT CCA CAA CTC CCA CCA AGA TT-3′

COX2 포워드: 5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
COX2 후진: 5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′

IL-1β 전방: 5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β 역방향: 5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′

IL-6 포워드: 5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3′
IL-6 후진: 5′-TCT GAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′

TNF-α 포워드: 5′-CAC GCT CTT CTG TCT-3′
TNF-α 역방향: 5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′

GAPDH 포워드: 5′-TGC ACC ACC AAC TGC TTA- GC-3′
GAPDH 후진: 5′-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3′

PCR 증폭 절차는 다음과 같이 수행되었습니다: 95°C에서 5분간 초기 변성, 이후 95°C에서 15초, 60°C에서 30초간 39회 사이클을 거쳤습니다. 상대 유전자 발현 수준은 GAPDH 내제어 기준으로 2^−ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였다.

5. 서부 블로팅
처리 후 RAW264.7 세포는 프로테아제와 인산효소 억제제가 포함된 RIPA 버퍼에서 균질화되었습니다. 이 억제제들은 단백질 분해와 탈인산화를 방지하기 위해 사용 직전 신선하게 준비되었습니다. 총 단백질 수치는 BCA 검사 키트를 사용하여 정량화하였습니다. 10% 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 같은 양의 단백질을 분리하여 니트로셀룰로오스 막에 전달하였습니다. 이식 후, 막은 TBST에서 추출한 5% 탈지유로 차단을 위해 배양한 후, 1:1,000 희석된 1차 항체로 4°C에서 밤새 탐침하였습니다. 다음으로 고추냉이 과산화효소 결합된 2차 항체(1:5,000 희석)로 실온에서 1시간 동안 막을 탐침했다. 단백질 밴드는 화학발광 검출 시스템을 사용해 검출되었고, 밴드 강도는 덴시토메트릭 정량화 를 통해 분석되었습니다.

6. 면역형광 분석
HeLa 세포는 6웰 플레이트에 시딩된 후 4시간 동안 XTT(8 μM)로 전처리한 후 TNF-α 자극(15 ng/mL)을 30분간 투여했습니다. 이 4시간 전인 잠복 기간은 NF-κB 활성화 전 표적 교전 효과를 극대화하기 위해 선택되었습니다. 세포는 4% 파라포름알데히드로 15분간 고정하고, 0.25% Triton X-100으로 15분간 실온에서 투과시켰습니다. 2% 소 혈청 알부민(BSA)과 10% 염소 혈청을 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 희석한 것으로 차단한 후, 세포는 항p65 1차 항체(1:250 희석)와 4°C에서 하룻밤 배양한 후, TRITC 결합 2차 항체(1:1,000 희석)로 실온에서 1시간 탐침하였다. 핵은 DAPI(0.5 μg/mL)로 5분간 어두운 환경에서 카운터 염색을 했습니다. 형광 이미지는 형광 현미경으로 촬영되었습니다. HeLa 세포는 세포질 대 핵 비율이 크기 때문에 p65 핵 전위의 시각화가 용이하게 선택되었습니다.

7. 세포질 및 핵 분획
HeLa 세포는 4시간 동안 XTT로 사전 인큐베이팅된 후 TNF-α(15 ng/mL)로 30분간 자극되었습니다. 세포를 수집하여 차가운 PBS로 세척한 후, 제조사 지침에 따라 상업용 핵 및 세포질 단백질 추출 키트를 사용해 세포질 및 핵 단백질 추출을 위해 처리되었습니다. 모든 시술은 단백질의 무결성을 유지하기 위해 얼음 위에서 진행되었습니다.

8. 셀룰러 열 이동 분석법(CETSA)
CETSA는 앞서 설명한 대로¹⁴번 진행되었습니다. 약 1× 10^{개의 7} HeLa 세포를 수집하여 프로테아제 억제제가 포함된 500 μL 냉각 PBS에 재현탁한 후, 액체 질소에서 세 번의 동결-해동 사이클을 거쳐 용해했습니다. 세포 용해액은 20,000 × g에서 4°C에서 15분간 원심분리했습니다. 결과된 상청액은 두 그룹으로 균등하게 분할되어 XTT(100 μM) 또는 DMSO를 상온에서 1시간 동안 처리했습니다. XTT(100 μM)는 CETSA 실험에서 검출 민감도를 높이기 위해 적용되었습니다. 샘플은 7개의 튜브에 분할되어 지정된 온도에서 3분간 가열된 후, 상온에서 추가로 3분간 배양했습니다. 면역블롯 분석을 위해 용해성 단백질 분획을 수집하였다.

9. 분자 도킹
분자 도킹 분석은 앞^{서 설명한} 대로 수행되었습니다. IKKβ의 결정 구조(PDB ID: 3BRT 및 4KIK)는 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 수집되었습니다. 단백질 구조는 PyMOL(버전 2.3.4)으로 전처리되어 물 분자, 원래의 리간드, 불순물을 제거한 후 수소 원자 추가가 이루어졌습니다. 가스티거 충전량을 계산하고, AutoDock Tools(버전 1.5.6)를 사용해 활성 포켓을 식별했습니다. 단백질 구조는 PDBQT 형식으로 저장되었습니다.

XTT 구조는 Chem3D(버전 15.1)에서 생성되었으며 에너지 최소화 를 통해 최적화되었습니다. 반유연한 도킹은 AutoDock Vina(버전 1.1.2)를 사용해 수행되었습니다. 격자 박스는 활성 포켓을 완전히 덮도록 설계되었고, 나머지 모든 매개변수는 기본 설정으로 유지되었습니다. 결합 에너지가 가장 낮고 구조가 가장 안정적인 도킹 포즈가 선정되어 분석되었습니다. 발표된 기준에 따르면 결합 에너지가 −5 kcal/mol 미만이면 강한 결합 친화력을 나타내는 것으로 간주되었습니다. PyMOL은 결합 모드를 시각화하고 수소 결합, 소수성 상호작용, 반데르발스 상호작용, 잠재적 결합 부위를 평가하는 데 추가로 활용되었습니다.

10. 통계 분석
모든 통계 분석은 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 세 개의 독립 실험에서 나온 평균 ± 표준오차(SEM)로 제시됩니다. 통계적 유의성은 분산 일방향 분석(ANOVA)을 사용한 후 던넷의 사후 검정을 통해 평가하였습니다. p < 0.05 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

XTT는 LPS 또는 TNF α 자극된 RAW264.7 대식세포에서 NO와 PGE₂ 생성을 억제했습니다
XTT의 항염증 효과가 세포독성과 독립적인지 확인하기 위해, LPS의 유무와 관계없이 XTT 치료 후 RAW264.7 세포 생존력을 평가하였다. 0.5에서 8 μM 농도에서 세포 생존율의 현저한 감소가 관찰되지 않아, 이 화합물이 실험 조건에서 잘 내약되었음을 나타냈다(그림 1). 이 결과를 바탕으로 2–8 μM 농도가 이후 분석을 위해 선정되었습니다.

LPS 자극은 배양지 내 NO와 PGE₂의 축적을 현저히 증가시켰습니다. XTT 전처리는 두 반응을 농도에 따라 감소시켰으나, 자극받지 않은 세포에는 거의 효과가 없었다. RAW264.7 세포를 TNF-α로 도전했을 때도 유사한 NO 생성 감소가 관찰되었습니다. 또한 형태학적 검사...

토론

세스퀴터펜 락톤은 소독, 항염증, 해열 및 해독 등 다양한 약리학적 작용을 가진 천연 제품의 한 군입니다^. 이전 연구들은 Xanthium sibiricum에서 분리된 XTT(Xanthanolide형 세스퀴테르펜 락톤)가 인간 간세포암세포에서 강력한 항증식 및 세포자자사 촉진 효과를 보인다는 것을 보여주었습니다¹³. 이 연구는 LPS 자극 RAW264.7 대식세포에서 XTT의 항염증 특성을 평가하고, 그 기저 분자 메커니즘을 추가로 탐구하였습니다. 활성화된 대식세포는 염증 매개체와 사이토카인을 생성하여 염증 신호를 증폭시킵니다. 이 생물학과 일치하듯, LPS 자극은 NO와 PGE₂ 생성을 증가시킨 반면, XTT는 iNOS와 COX2 발현과 함께 두 매개체 모두 감소시켰다.^16,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Enhanced chemiluminescence reagent D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P90720	발광 신호 탐지
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies	Signalway Antibody  (Nanjing)	L30118	1차 항체에 특이적으로 결합
p65 1차 항체	Bioworld	BS4139	NF-κB p65 서브유닛 단백질을 특이적으로 인식
분광광도계	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000	SCR_018042
0.45 μM  Ployvinylidence fluoride membrane	Millipore	PR05509	단백질 분자 흡착
1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin	Chengdu Institute of Biology		천연 단량체 화합물
All-in-One cDNA Synthesis SuperMix	Bimake (Shanghai)	B24408	역전사
BAY11-7082	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	SF0011	IκB/IKK 억제제
Bcl2  항체	Signalway Antibody  (Nanjing)	32012	AB_3751037
Bicinchoninic Acid (BCA) kit	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0010S	총 단백질 정량
CCK-8 약제	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	C0038	세포 생존율 측정
발광 탐지 시스템	Millipore, Bedford, USA	P90720	발광 신호 획득 및 처리
COX-2 항체	Signalway Antibody  (Nanjing)	33345	AB_3676692
DMSO	Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd.	A100231-0500	화합물 용해
GAPDH 항체	Signalway Antibody  (Nanjing)	41549	AB_3751036
겔 이미징 기기	E-BLOT	Touch Imager Pro	이미지 획득 및 분석
기울기 PCR 기기	Biometra TADVANCED	Biometra Tadvanced 96SG	기울기 어닐링 온도
Griess 약제	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	S0021S	NO 정량
Human cervical carcinoma HeLa cells	The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	SCSP-504	Human-derived cells
Human TNF-α	Novus Biologicals	210-TA	염증 유발 시토카인
iNOS 항체	Signalway Antibody  (Nanjing)	48309	AB_2943634
레이저 공초점 역행 현미경	Olympus	FV1000	SCR_016840
LPS ( E.coli 055:B5)	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd	L6529	염증 모델 설정
Murine macrophage RAW264.7 cells	The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	SCSP-5036	Mouse-derived cells
핵 및 세포질 단백질 추출 키트	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0027	세포질 및 핵 단백질 분리
PD98059	Selleck Chemicals  (Shanghai)	S1177	MEK 억제제
P-ERK (Thr202/Thr185) 항체	Signalway Antibody  (Nanjing)	12548	ERK 단백질의 인산화 수준 검출
p-IKKα/β (Ser176/Ser177) 항체	Signalway Antibody  (Nanjing)	11931	AB_3751034
p-IκBα (phospho-Ser32)항체	Signalway Antibody  (Nanjing)	13776	AB_3751033
p-JNK (T183/T221) 항체	Signalway Antibody  (Nanjing)	13371	AB_3718662
p-p38 MAPK (Thr180) 항체	Signalway Antibody  (Nanjing)	11581	AB_3751032
Prostaglandin E2 매개변수 분석 키트	R&D Systems	KGE004B	AB_2894942
PS1145	Selleck Chemicals  (Shanghai)	S7691	특정 IKK 억제제
Rapid SDS-PAGE 겔 준비 키트	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0018S	단백질 분리
Real-Time PCR 시스템	Bio-Rad	CFX96	SCR_018064
RIPA 버퍼	Bimake (Shanghai)	P0013C	세포 용해
SB203580	Selleck Chemicals  (Shanghai)	S1076	p38 MAPK 억제제
SP600125	Selleck Chemicals  (Shanghai)	S1460	JNK 억제제
SYBR Green	Bimake (Shanghai)	B21202	실시간 정량용
TRITC-conjugated goat anti-mouse IgG	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	A0568	AB_2893016
TRITC-conjugated 2차 항체	Beijing Baiao Leibo Technology Co., Ltd.‌	ZN1992	AB