LAIP/DfN 및 CD34+CD38 - 백혈병 줄기세포 풍부 인구를 이용한 급성 골수성 백혈병 측정 가능한 잔여 질환을 위한 다기관 유동 세포 검사

요약

이 프로토콜은 백혈병 관련 면역표현형/정상과 다른 질환(LAIP/DfN) 분석과 표현형상 정의된 CD34⁺CD38⁻ 백혈병 줄기세포 풍부 집단을 사용하여 급성 골수성 백혈병 잔존 질환 측정 가능한 질환 정량화를 위한 다기관 유동 세포검사 워크플로우를 설명합니다.

초록

ELN 2025 지침에 따라 급성 골수성 백혈병(AML) 임상시험에서 치료 반응 평가를 위해 측정 가능한 잔여질환(MRD) 추적 관찰이 권장됩니다. 본 연구의 목적은 AML 임상시험에 참여하는 30개 프랑스 혈액학 실험실에서 조화로운 MRD 흐름 접근법을 사용하여 환자를 표준화된 추적 관찰을 시행하는 것이었습니다. 비교 가능한 결과를 얻기 위해 네트워크는 웻 랩 절차부터 임상 보고서까지 권고안을 마련했습니다. ELN의 권고에 따라 3관 패널을 설계하여, CD34⁺CD38⁻ 구획에서 백혈병 관련 면역표현형/정상과 다른 유형(LAIP/DfN) 패턴을 식별하여, 혈액 관련 면역표현형/정상과 다른 유형(LAIP/DfN) 패턴을 규명하였습니다. CD34/CD38/CD45/CD117의 뼈대를 사용했으며, 첫 번째 난관의 계통 표지자, 두 번째 난관의 LSC 관련 표지자, 세 번째 난관의 단핵 및 분화 표지자가 완성되었다. 이 패널은 8, 10, 12색 포맷으로 사용할 수 있으며 여러 기존 유세포계 플랫폼에 구현됩니다. 각 플랫폼에 맞게 유세포계 설정을 제안합니다.

네 플랫폼 간 감도 조화는 8피크 무지개 비즈를 사용해 수행되었습니다. 대량 용해 후 면역염색이 시행되었습니다. 플랫폼 간 편향을 감지하기 위해, 네 개의 플랫폼에서 신선한 건강한 골수 샘플을 병행하여 염색 지수를 테스트하였습니다. 프로토콜의 모든 단계를 검증하기 위해 실험실 간에 일반 골수 품질 관리 샘플을 공유하여 습식 외부 품질 평가(EQA)를 수행했습니다. 마지막으로, 센터에서 얻은 데이터 분석 전략의 표준화를 MRD FCS 데이터 파일을 공유하여 건조 EQA를 사용해 평가하였습니다. 이 다센터 접근법의 실현 가능성은 기기 민감도와 시료 준비의 조화, 그리고 분석 조작자에 대한 교육과 체계적인 교육을 필요로 합니다.

서론

측정 가능한 잔존 질환(MRD)은 치료 중이나 치료 후에도 지속되며 형태학적으로 검출되지 않는 소수의 백혈병 세포를 의미하며, 특히 골수 내 5% 미만의 배반 개수가 완전히 관해된 경우에 그렇습니다. 임상 급성 골수성 백혈병(AML) 임상시험에서 MRD 모니터링은 ELN 2025 지침에 따라 치료 반응 평가를 위해 권장됩니다^. 역전사효소 PCR(RT-qPCR) 및 차세대 시퀀싱(NGS) 등 분자생물학 방법 외에도, 다중 매개변수 유세포분석(MFC)이 일반적으로 사용되는 접근법입니다^.

특히 임상시험에서 일관된 MRD 결과를 얻기 위해서는 두 가지 전략이 가능합니다: MRD 측정을 단일 실험실에 중앙집중화하거나, MRD 결정에 관여하는 여러 실험실 간 재현성을 보장하는 프로토콜을 구현하는 것입니다. 샘플 수, 시험 규모, 실험실이 더 크거나 작은 샘플 부피를 처리할 수 있는 능력이 이러한 전략 선택에 영향을 미칠 수 있습니다. 다센터 전략을 선택할 경우, 세포계 플랫폼 간 차이와 사이트 간 비교 분석의 필요성을 해결해야 합니다.

이를 위해 ELN 권고와 이전 보고서를 바탕으로 30개 프랑스 혈액학 실험실에서 구현된 백혈병 관련 면역표현형/정상과 다른 분석(LAIP/DfN) 분석과 표현형상 정의된 CD34⁺CD38⁻ 백혈병 줄기세포(LSC) 풍부 검출을 결합한 표준화된 다센터 및 다플랫폼 MRD 흐름 접근법을 설명합니다 ^3,4.

유세포검사는 진단 시 환자의 모반에 나타나는 특정 표지자인 LAIP를 포함하는 백혈병 '서명'을 정의할 수 있게 합니다. 치료 후 MRD 플로우를 통해 진단 시 발견된 LAIP를 모니터링할 수 있습니다. 백혈병 모반은 치료적 압력 하에서 면역 표현형을 진화하고 변형시킬 수 있으므로, 두 번째 전략인 DfN 접근법을 체계적으로 도입해야 하며, 이는 정상적인 조혈과 구별되는 특성을 가진 세포를 식별하는 데 의존합니다. 이 기술은 질병 진행 및 치료 과정에서 배반에 새로운 마커가 나타나는지 감지할 수도 있습니다.

프랑스 AML 유량 그룹에서는 패널 설계가 이전에 발표된 HOVON 백혈병-세포 패턴 정의 연구를 기반으로 하였습니다. 보편적인 LSC 또는 LAIP 마커는 없으므로, LAIP, DfN, CD34⁺CD38⁻ LSC 풍부 집단을 동시에 식별할 수 있는 3관 패널을 설계했습니다. 모든 난관에서 CD34/CD38/CD45/CD117을 기반으로 한 백본이 사용되었으며, 첫 번째 난관에는 계통 마커, 두 번째 난관에는 LSC 관련 마커, 세 번째 난관에는 단핵구 계통 또는 분화 마커가 있어 단핵성 모종성 모반에서 LAIP 정의를 완성했습니다. 세 가지 튜브 모두 진단 시와 추적 관찰 시 채취됩니다.

백혈병 발생의 병태생리를 고려할 때, 관심은 폭발 전체를 연구하는 것에서 가장 미성숙한 부분을 백혈병 줄기세포 풍부 집단으로 식별하는 쪽으로 옮겨갔습니다. 딕과 동료들은 면역결핍 쥐에서 백혈병을 유발할 잠재력을 가진 CD34⁺CD38⁻ LSCs를 기술함으로써 백혈병의 이질성을 입증했다 ^5,6. 진단 및 추적 관찰 시 LSC 정량화에서는 ELN DAVID 작업 그룹 ^1,7 내에서 항체 패널과 분석 전략의 표준화를 위한 노력이 진행되고 있습니다. 현재 HOVON과 ALFA 두 패널은 이분법적 LSC 마커를 사용하여 CD34⁺CD38^{− 공간 내} 정상 조혈줄기세포와 LSC 풍부 집단을 구분^{하고 있습니다.}

여기서 설명하는 방법은 표준화된 샘플 준비, 공통 항체 패널 설계, 플랫폼 적응 민감도 설정, LAIP/DfN 및 CD34⁺CD38⁻ LSC 강화 분석, 외부 품질 평가, 그리고 다기관 AML MRD 흐름 모니터링을 위한 조화로운 임상 보고를 결합한 것입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 프랑스 대학 병원 센터의 윤리 위원회의 권고와 지침을 따릅니다. 모든 환자는 프랑스 법률에 따라 사전 동의서에 서명했습니다. 연구 프로토콜은 헬싱키 선언(HDF-AML 관측소, CNIL 2214454v0)에 따라 CHU 리옹 인간윤리위원회와 릴 CHU 기관심사위원회 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 동종이식편의 경우, 기증자는 유럽 기반 인터넷 기반 ProMISE 데이터베이스에 포함되었고, 개인 데이터 수집에 대한 사전 동의를 제공했습니다. 데이터 추출 및 분석은 지역 윤리 위원회(CNIL2093819)에 따라 수행되었습니다. 네트워크 검토에 사용되는 모든 FCS 플로우 파일은 파이썬 스크립트를 통해 완전히 익명화되었습니다.

1. 세포계 설정

1. 8피크 무지개 비즈를 사용해 각 세포계에 맞는 목표값을 결정합니다.
2. 각 기계는 표 1에 표시된 목표 값에 맞춰 설정하세요. 각 채널이 목표 값± 5%에 도달하도록 하세요. 각 플랫폼의 종방향 민감도를 유지하기 위해 이 설정을 체계적으로 검증하세요.
3. 각 항체에 대해 단일 염색관을 사용해 보상 매트릭스를 구축하고, 각 플랫폼에 따라 보상 구슬 및/또는 세포를 사용합니다.
4. 설정 및 보상 행렬을 MRD LAIP/DfN, LSC, MonoGran(T1, T2, T3)으로 식별하는 분석법 또는 프로토콜로 저장하세요. AML MRD 유량 정량화를 위해 이 분석법 또는 프로토콜을 사용하여 획득하세요.

2. 습식 실험실 절차

1. 골수 흡인검사
   1. 진단 시점과 모니터링 시점(MRD1, MRD2, MRD3, MRD4, 재발 포함)에서 1-2 mL의 EDTA 골수를 채취하세요.
   2. 튜브를 기준 유동 실험실로 24-48시간 이내에 보내세요.
2. 형태학적 검사를 위한 골수 도말 검사 준비
   1. 골수 흡인액 한 방울을 유리 슬라이드에 떨어뜨립니다. 커버슬립이나 다른 슬라이드를 사용해 샘플을 부드럽게 펴 바르세요.
   2. 30분 건조 후 May-Grünwald-Giemsa(보충 파일 1)로 얼룩을 염색하세요.
3. 벌크 해상
   1. 15mL의 NH₄Cl 용해액을 1-2mL의 골수 샘플에 첨가합니다. 부드럽게 섞고 실온에서 10분간 배양하세요.
   2. 실온에서 450 × g에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.
   3. 세포 펠릿을 10mL의 PBS/0.1% BSA에 재현탁합니다. 450 × g에서 실온에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 버립니다.
   4. 세포 펠릿을 PBS에서 30 ×¹⁰ 6 WBC/mL 농도로 재현탁합니다.
4. 세포 현탁액의 면역염색
   1. 플랫폼에 따라 T1, T2, T3 튜브에 단클론 항체를 분포합니다(표 2). 항체 표에서 각 항체에 대해 클론, 부피, 카탈로그 참조, 공급자를 제공하세요.
      참고: 브릴리언트 바이올렛 염료를 사용할 각 튜브마다 항체를 넣기 전에 브릴리언트 스테인 버퍼를 사용하세요.
   2. 100 μL 세포 현탁액에 튜브당 2-3 ×10 6^{개의 용해} 세포를 추가합니다. 항체와 함께 세포를 실온에서 어두운 곳에서 15분간 배양하세요.
   3. 세포를 3mL PBS로 세척하세요. 450 × g에서 5분간 원심분리기를 하고 상청액을 버리세요.
   4. 염색된 세포를 300 μL PBS에 재현탁합니다.
      참고: 미리 혼합된 항체 혼합 또는 검증된 건조 항체 튜브를 사용할 수 있습니다.

3. 유세포계 획득

1. MRD 검사 또는 획득 프로토콜을 열어 MRD LAIP/DfN 및 LSC 측정을 위한 적응된 설정과 보상 행렬을 포함하세요.
2. 진단 시점과 MRD 추적 시료에서 각 튜브에 최소 500,000에서 1,000,000 WBC를 확보하여 MRD 세포의 군집 형성과 저수준 MRD에 대한 신뢰도를 높입니다.
   참고: LSC 측정을 위해서는 LSC 정량에 적합한 민감도를 얻기 위해 튜브 2에서 최소 1,000,000 백혈구를 확보해야 합니다(LOQ 0.002%, LOD 0.001%)^10,11.
3. 진단 및 MRD 샘플의 FCS 데이터 파일을 저장하세요. 획득 날짜와 환자 식별을 기록하여 추적 후 MRD 및 LSC 분석을 용이하게 합니다.

4. 분석 전략

1. 각 센터에서 사용하는 분석 소프트웨어에 맞게 미리 정의된 조화 게이팅 전략을 포함하는 공통 템플릿과 공통 점-플롯 시퀀스를 사용하세요.
2. LAIP, DfN, LSC 분석의 세 가지 접근법을 사용하여 게이팅 전략을 적용하여 백혈병 세포를 CD34⁺CD38^- 분획에서 확인합니다.
3. 호염기구, 형질세포 수지상세포, 혈단세포, 형질세포, 적혈세포, 혈소판 덩어리, 잔해, 용해되지 않은 적혈구를 포함한 잠재적 비특이적 사건과 정상 생리학적 집단을 식별하고 배제합니다.

5. LAIP/DfN 및 생리학적 집단의 정의

1. LAIP를 대량 발사로 포착하려면 FSC-W 대 FSC-H를 기반으로 단일 셀 게이트를 그립니다.
2. FSC와 SSC를 기준으로 라이브 셀 게이트를 그리세요.
3. CD45^dim/SSC에 블라스트 게이트를 그려보세요.
4. CD34/CD117을 사용해 원시 마커 게이트를 그립니다.
5. 고정된 이중파라미터 점플롯을 사용하여 LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7, LAIP8 등 관련 LAIP 게이트를 그립니다.
6. 생리학적 개체군
   1. 다음 순서를 사용하여 게이트 혈종을 추출: 생세포, FSC/SSC 점플롯의 MNC, CD19/SSC 점플롯, CD34/CD38 점플롯. CD45/SSC를 이용한 백게이트.
   2. 다음 서열을 사용하는 게이트 호염기구: 생세포, FSC/SSC 도트 플롯의 MNC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA^-), CD19⁺ 혈종 제외. CD45/SSC를 이용한 백게이트.
   3. 다음 서열을 사용하는 게이트 형질세포 수지상돌기세포: 생세포, FSC/SSC 점플롯의 MNC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺), CD19⁺ 혈종세포 제외. CD45/SSC를 이용한 백게이트.
   4. 적혈구, 혈소판 덩어리, 이물질, 해리되지 않은 적혈구를 CD36/CD45 점플롯을 사용하여 식별합니다. CD45/SSC와 FSC/SSC를 이용한 백게이트.
7. LAIP 접근법
   1. CD34⁺ 또는 CD117⁺ 원시 AML에서 MRD를 불리언 연산자를 사용하여 다음과 같이 정의합니다: LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7, LAIP8, 그리고 깨끗하지 않은 CD36^bright+/CD45, 단일 세포, 생체 세포, CD34^+/CD117^+/ 원시 마커 및 (CD45/SSC 블라스트 게이트 또는 MNC CD34⁺)(그림 1).
   2. CD34-CD117-AML에서 불리언 연산자를 사용하여 MRD를 다음과 같이 정의합니다: LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7, LAIP8, 그리고 깨끗하지 않은 CD36^BRIGHT+/CD45, 단일 셀, 라이브 셀, CD34CD117 및 CD45/SSC 블라스트 게이트(그림 2).
8. DfN 접근법
   1. LAIP 접근법과 동일한 템플릿을 사용하고, 참조 골수 샘플에 정의된 빈 공간을 적용합니다(표 3).
   2. 로그 척도에서 정상 세포 군집이 정상 세포와 0.5세기 차이로 분리될 때 비정상 집단을 정의한다.¹².
   3. DfN을 대량 발사로 포착하려면 FSC/SSC를 사용해 생세포를 채취합니다.
   4. FSC 피크/SSC 면적을 기준으로 더블렛을 제거하여 단일 셀을 뽑으세요.
   5. FSC/SSC를 사용해 MNC 게이트를 그립니다.
   6. CD45/CD36/SSC를 사용하여 림프구를 제거하기 위해 클린업 게이트를 적용하세요.
   7. CD45/CD36을 사용해 적혈세포와 이물질을 제거하기 위해 클린업 게이트를 적용하세요.
   8. 이전 논문^{들 12,13}에 따라 빈 박스를 정의하기 위해 두 개의 입력 게이트, CD34⁺/CD45/SSC 및 CD117⁺/CD45/SSC를 사용한다.
   9. 각 DfN 빈 상자는 교차 계통 마커를 위한 림프구와 손실, 감소, 과발현 마커를 위한 정상 골수체 전구체를 포함하여 내부 대조군을 기반으로 그리세요.
   10. 빈 상자를 재생, 염증성 골수, 건강한 기증 골수 등 기준 골수 샘플과 비교하세요.

6. LSC CD34⁺CD38^- 인구 정의

1. 건강한 골수의 정상 조혈줄기세포에서 이분법 발현과 발현 부재를 가진 LSC 마커를 바탕으로 진단 시 LSC 풍부 세포를 CD34⁺CD38^- 공간에서 식별합니다.
2. 다음 게이팅 순서를 사용하여 LSC 입력 게이트를 MNC34⁺ 로 정의합니다: 라이브 셀, 단일 셀, MNC, CD34⁺ (CD45/CD34 도트 플롯).
3. CD38 형광-1(FMO) 수준을 기반으로 엄격한 임계값을 사용하여 CD34^{+CD38 분}획(P6)을 정의합니다.
4. P6 분획의 튜브 1에서 LSC 풍부 세포를 불리언 연산자를 다음과 같이 정의합니다: P6CD7⁺ 또는 P6CD33⁺ 또는 P6CD19⁺ 또는 P6CD56⁺ 그리고 깨끗하지 않은 CD36^bright+ , 단일 세포, 생세포, MNC 및 MNC CD34⁺.
5. P6 분획의 튜브 2에서 LSC 풍부 세포를 불리언 연산자를 다음과 같이 정의합니다: P6CD45RA⁺ 또는 P6MIX⁺ 또는 ^P6CD123+ 및 NOT CLEAN CD36^bright+ , 단일 세포, 생세포, MNC 및 MNC CD34⁺.
6. CD36을 사용해 최종 MRD LSC 게이트에서 비특이적 사건을 정화합니다(그림 3).

7. CD34⁺ 인구에서 CD38^- 임계값의 정의

1. CD38 채널을 충분히 높게 설정하여 CD38^-집 단과 좋은 해상도의 CD38^+/ 집단을 구분할 수 있도록 하세요.
2. P6를 CD34⁺CD38^-, P7을 CD34⁺CD38^저음, P8을 CD34⁺CD38^높음으로 정의합니다.
3. CD38 채널 설정을 CD38 밝은 집단을 기준으로 하고, 각 플랫폼의 측정 범위에 따라 가장 밝은 혈질세포와 헤마토곤을 식별합니다.
4. CD38 FMO 접근법을 사용하여 등클론 CD38 대조군으로 검증된 CD34⁺CD38^- 집단(P6)을 정의합니다.
5. 혈단원 음수 수치를 사용하여 CD34⁺CD38^저 혈구(P7)를 정의합니다.
6. 혈액 양성 수준과 혈장세포 음성 수준을 사용하여 CD34⁺CD38^고 인구(P8)를 정의합니다(그림 4).
7. CD38-FMO 또는 등클로닉 CD38 제어 같은 견고한 방법을 사용하여 조화된 그룹 전체에서 동일한 CD38^-임계값 레벨을 사용한다.
8. LSC 풍부 세포를 정의하기 위해 CD34⁺CD38^- 분획에서 최소 하나의 이상 이상 면역표현형을 사용하세요. CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123과 같은 LSC 마커나 CD7/CD19/CD56/CD33과 같은 계보 마커를 포함하세요.
9. 다음 임계값을 적용하세요: 분석민도 LOQ ^10-4와 LOD ^10-5; 진단 시 LSC 양성은 CD45/SSC 배반의 1%≥; 그리고 MRD 추적 관찰에서 LSC 양성률은 백혈구 ≥ 0.01%입니다.

8. 조화된 임상 흐름 보고서

1. 각 결과에 대해 다음과 같은 정보를 제공하세요: 골수 품질, MRD 식별에 사용된 전략, LAIP 설명, LOD 및 LOQ, 임계값, 결과 해석.
2. 혈액 희출과 골수 대표성
   1. 각 MRD 흐름 임상 보고서마다 혈액 희생을 평가하여 결과의 견고성을 평가합니다.
   2. 적용 시 앞서 설명한 혈액 희출 방법 중 하나를 사용하세요 (표 4⁾7,14,15,16,17,18,19,20,21.
   3. 보완적 접근법으로, 관찰된 CD34/WBC45 비율과 기준 골수 샘플에서 관찰된 기대 비율을 비교하여 골수 대표성을 계산합니다(그림 5).
   4. 다음 공식을 사용하세요:
      P: 순도 % = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s: 정상 말초혈 내 MNC CD34⁺ 세포 비율: 0.0005
      m: 정상 골수 내 MNC CD34⁺ 세포 비율: 0.035
      L: MRD 환자 샘플 내 백혈구45⁺ 백혈구 수
      n: MRD 환자 샘플 내 MNC CD34⁺ 세포 수
   5. 골수 대표성을 샘플의 품질 평가로 보고하세요. 이 값을 MRD 결과를 정규화하는 데 사용하지 마십시오.
   6. 골수 대표성을 다음과 같이 해석합니다: 100%에서 10%로, 골수 내 CD34⁺ 세포 비율에 미치는 영향은 낮음; MRD 결과 해석을 위한 경고는 10%에서 1%로 표시됨; 그리고 < 1%는 해석 불가능한 결과입니다.
3. 진단 시 LSC 정량화
   1. LSC 풍부 세포를 식별하는 데 사용된 프로필을 보고하라. 예를 들어 CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. 진단 시 LSC 결과를 CD45/SSC 배반에서 관찰된 백분율로 보고하세요.
   3. 전체 배반 ≥ 1%를 LSC를 예후 불량의 기준으로 사용하세요.
4. LAIP/DfN의 후속 MRD
   1. 예를 들어, CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117⁺CD7⁺에 사용된 LAIP 프로파일을 보고하세요.
   2. 분석 민감도를 기술적 임계값과 LAIP 프로파일에서 관찰된 견고성 값 사이에서 가장 민감한 값으로 보고하라, 기준 골수 샘플과 비교했을 때.
   3. 획득한 백혈구 사건 중 최소 50개의 세포 클러스터를 정량 한계로 삼으세요. 예를 들어, 백혈구 세포 50만 개에서 LOQ는 0.01%(1 × ^10-4)입니다.
   4. LAIP/DfN 결과를 양성, 음성, 임상적 기준 이하로 감지 가능하거나 검출 불가능으로 보고하세요.
   5. LAIP/DfN 양성률은 총 CD45⁺ 백혈구 비율로 ≥ 0.1%로 보고하세요.
   6. LAIP/DfN 부정성은 < 0.1%로 보고하세요.
   7. 감지는 가능하지만 임계값 이하의 결과는 대표 값과 민감도 임계값을 보고합니다.
   8. 검출 불가능한 결과의 경우, 분석 민감도 임계값보다 열등하다고 보고하고, 필요 시 혈액 희출, 낮은 LAIP 특이도, 또는 기술 임계값 부족 등의 코멘트를 추가하십시오.
5. LSC의 후속 MRD
   1. LSC 풍부 세포를 식별하는 데 사용된 프로필을 보고하라. 예를 들어 CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. 획득한 백혈구 사건 중 최소 20개의 세포 클러스터를 정량 한계로 사용하세요. 예를 들어, 백혈구 세포 1,000,000개에서 LOQ는 0.002%(2 × ^10-5)입니다.
   3. LSC 결과를 양성, 음성, 임상적 기준 미만으로 감지 가능하거나 감지 불가능한 것으로 보고합니다.
   4. LSC 양성률은 총 CD45⁺ 백혈구 비율로 표현하여 ≥ 0.01%로 보고하십시오.
   5. LSC 부정성을 < 0.01%로 보고하세요.
   6. 감지는 가능하지만 임계값 이하의 결과는 대표 값과 민감도 임계값을 보고합니다.
   7. 검출 불가능한 결과의 경우, 분석 민감도 임계값보다 열등하다고 보고하고, 필요 시 혈액 희석, 낮은 LSC 특이도, 또는 기술 임계값 불충분과 같은 코멘트를 추가하세요.
6. MRD 흐름 해석을 이전 모니터링 시점과 통합하세요. 치료 중 표현형 프로필의 조절과 MRD 흐름의 역학, 재양성, 증가, 안정성 또는 감소를 나타내십시오.
7. 참고 유량 실험실의 시간대에 따라 임상 흐름 보고서를 사용하여 결과를 요청하는 임상의와 연구자에게 전달합니다.
8. 골수 질, MRD 식별 전략, LAIP 기술, LOD 및 LOQ, 임계값, MRD 양성, 음성(LOD 포함 LOD), 또는 MRD는 검출 가능하지만 정량화할 수 없는 것으로 해석하여 조화된 임상 흐름 보고서를 요약합니다.

결과

플랫폼 미러링

CANTO와 NAVIOS 간의 초기 두 플랫폼 비교에서는 보정되지 않은 8피크 무지개 비즈를 획득하여 미리 정의된 목표 MFI 값을 달성하기 위해 전압 설정을 조정했습니다. 참조 CANTO 플랫폼의 목표 값은 다음 변환을 통해 두 번째 NAVIOS 플랫폼으로 옮겨졌습니다: new MFI target = reference MFI target/256²². 플랫폼 간 편향을 감지하기 위해 10개의 신선한 EDTA 재생성 골수 샘플을 병행하여 시험했습니다. 양성과 음성 집단 간의 염색 지수는 샘플과 플랫폼 간 비교되었으며, 유사한 분리가 나타났다(보충 파일 도표 S3).

연구 기간 동안 플랫폼들은 8색 및 10색 구성에서 LYRIC 및 DxFLEX 12색 및 13색 구성으로 점차 업그레이드되었습니다(보충 파일 1). 미러링은 8피크 무지개 비즈와 같은 패널로 채취한 염색된 건강한 골수를 사용하여 네 개의 플랫폼에 걸쳐 확장되었습니다. 피크 겹치는 로그 스케일만 조정하여 확인했습니다. 정의된 설정을 적용한 후 세포 염색 패턴이 겹치게 되었으며, 주요 차이점은 로그 척도를 따라 세포 구름의 이동 방식이었습니다(그림 6 및 보조 파일-그림 S4 및 그림 S5).

유량 실험실 전반의 품질 평가 및 재현성

초기 표준 운영 절차 시행과 플랫폼 업그레이드 중 업데이트된 후, 참여 센터 간에 공유된 신선한 기준 골수 샘플을 사용하여 정기적으로 습식 외부 품질 평가(EQA)가 수행되었습니다. 습식 EQA를 사용하여 습식 실험실 절차, 플랫폼 설정, 공통 게이팅 분석 전략을 검증하였습니다. 보고된 집단에는 백혈구 CD45⁺ 분모의 MNC CD34⁺ 세포와 백혈구 CD45⁺ 분모의 P6 CD34⁺CD38⁻ 세포가 포함되었습니다. 결과는 z-스코어 및/또는 그래픽 표현(그림 7)으로 분석되었습니다.

2017년 이후 5회의 습식 EQA 라운드가 각각 22, 15, 17, 26, 25개의 실험실이 참여했습니다. 백혈구 CD45⁺ 내 %CD34⁺CD38⁻ 세포와 백혈구 CD45⁺ 내 %MNC CD34⁺ 세포의 결과는 다음과 같았습니다: EQA1, 평균 값 0.015% 및 1.01% (표준관 0.09% 및 0.24%); EQA2, 0.09% 및 1.02% (표준불량 0.046% 및 0.36%); EQA3, 0.097% 및 1.46% (표준시다도 0.024% 및 0.32%); EQA4, 0.024% 및 2.16% (표준표준안 0.015% 및 0.59%); EQA5, 0.027%와 1.9%(표준표준값 0.008%, 0.45%).

센터 간 MRD 분석 전략의 표준화를 위해 습식 EQA는 진단, MRD 추적 관찰, 기준 골수를 위한 공유 FCS 파일을 사용한 건식 EQA로 보완되었습니다. 지역 분석 데이터의 90% 이상이 2 SD± 연속평균을 기반으로 한 중앙 집중 구간 내에 포함되었습니다: DryEQA2017은 23개 참여 실험실 중 22개에서 95.6%와 91.3%, DryEQA2024는 25개 참여 실험실 중 24개가 100%에 해당했습니다(그림 8). 백혈구 CD45⁺에서 %MRD LAIP와 백혈구 CD45⁺에서 %MRD LSC CD34⁺CD38⁻에 대해 두 차례 건식 EQA를 시행하였다. DryEQA2017은 평균 LAIP 11.9%(표준후 표준후 1.35%), 평균 저위 저항 수치는 0.16%(표준편차 0.05%)를 보였습니다. DryEQA2024는 평균 MRD LAIP 값 0.35%(표준편견 0.26%), 평균 MRD LSC CD34⁺CD38⁻ 값 0.18%(표준편표 0.06%)를 보였습니다.

LAIP/DfN 및 LSC 전략을 이용한 다중 모달 AML MRD 유량 측정 예시

MRD를 정량화하기 위해 세 가지 접근법이 체계적으로 사용되었습니다. 첫 번째 접근법은 불리언 게이팅을 이용해 진단 시 백혈병 아반의 LAIP 지도 제작을 확립했으며, 이 지도 제작은 추적 골수 샘플에 적용되었습니다(그림 9A). 두 번째 접근법은 DfN 분석을 사용하여 정상 골수계 분화에서 정의된 '빈 상자' 영역에서 관찰되지 않는 비정형 발현 패턴을 가진 비정상 세포를 식별하였습니다(그림 9B). 세 번째 접근법은 이분법 LSC 마커와 불리언 게이팅을 사용하여 CD34⁺CD38⁻ 분획의 LSC 풍부 세포를 정량화했습니다(그림 10).

참고 골수 샘플

총 135개의 참조 골수 샘플이 연구되었으며, 이 중 25건은 건강한 기증자 골수 샘플, 34건은 염증성 골수 샘플, 76건은 재생 골수 샘플이었습니다. 건강한 기증자 골수는 중위 연령 31세, 범위는 21세에서 49세 사이인 건강한 기증자로부터 채취되었습니다. 염증성 골수는 빈혈, 호중구감소증, 혈소판 감소증 등 세포감소증으로 의뢰된 환자들로부터 채취되었으며, 골수 흡인에서 혈액학적 악성 종양이 발견되지 않았습니다; 중간 연령은 52세였으며, 범위는 25세에서 82세였습니다. AML 추적 관찰 중 유도 또는 통합 후를 포함한 다양한 화학요법 시점에서 재생 골수를 얻었으며, NPM1 또는 CBF 전사체에 대한 분자 MRD 평가 음성 수치가 나타났습니다; 중앙 연령은 54세였으며, 범위는 18세에서 65세였습니다.

이 샘플들의 품질은 현미경 검사를 통해 검증되었습니다. 희석되지 않은 골수 샘플에서 CD34⁺ 세포의 이론적 기대 비율도 브루이망스 공식을 사용하여 계산되었으며, 모든 샘플에서 >90%의 결과가 나왔습니다. 이 샘플들은 LAIP/DfN 및 LSC 분석의 임계값을 설정하고 조혈 및 순도 공식 계산에 사용되었습니다. 골수 상태에 따른 마커 발현 MFI 변이는 건강한 기증자, 염증성 및 재생 중인 골수 샘플에 대해 연구되었습니다(보충 파일 그림-S6). 가장 관련 매개변수에 대한 기준값이 산정되었으며, 여기에는 백혈구에서 나온 %MNC CD34⁺, MNC CD34^{+에서 %}P6 CD34⁺CD38−, MNC CD34⁺에서 %P8 CD34⁺CD38^높음이 포함된다(보충 파일 도표 S6).

민감도 및 선형성 평가

재생, 염증, 건강한 기증 골수 등 기준 골수 샘플에서 이상 사건 수를 측정하여 LAIP/DfN 및 LSC 특이 게이트의 민감도를 평가하였다. 건강한 골수에서 알려진 수의 배반반을 연속 희석하여 MRD 측정의 정량 한계와 선형성을 검증하였다(그림 11 및 그림 12).

그림 1: 튜브 1에서 원시 마커(CD34⁺/CD117⁺)를 이용한 AML에서 MRD LAIP 분석을 위한 게이팅 전략. 첫 번째 줄: 시간의 순차적 게이팅, FSC 대 SSC 기반 생세포, FSC-W 대 FSC-H 기반 단일 세포, CD45 대 SSC 위의 WBC CD45⁺ 세포, CD45^dim/SSC의 배반구, FSC-A/SSC-A 의 단핵세포(MNC), CD45 대 CD34 플롯의 MNC CD34⁺ 세포, 그리고 CD34 대 CD117 플롯의 원시 마커 게이트. 두 번째와 세 번째 행: 가장 관련 있는 LAIP 게이트(LAIP1–LAIP8)를 정의하기 위해 사용되는 고정 이중파라미터 점플롯. MRD LAIP는 다음과 같은 불리언 전략을 사용하여 정의되었습니다: 시간 및 생 세포, 단일 세포 및 (블라스트 또는 MNC CD34⁺), 원시 마커 (CD34^+/−CD117^+/−), LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7, LAIP8. 그림 속 사례에서 MRD는 백혈구 CD45⁺의 6.8%였으며, 건강한 골수에서는 0.04%± 0.03%였습니다. 오른쪽: 정량화에 사용된 최종 MRD 게이트의 백게이팅, 비특이적 사건, 적혈세포, 잔해의 정리를 가능하게 하는 장면. 약어: AML = 급성 골수성 백혈병; MRD = 측정 가능한 잔존 질환; LAIP = 백혈병 관련 면역표현형; FSC = 순방향 산란; SSC = 측면 산란; WBC = 백혈구; MNC = 단핵전지; hBM = 건강한 골수. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 3번 튜브에서 성숙한 배아(^CD34−CD117⁻)를 이용한 AML의 MRD LAIP 분석을 위한 게이팅 전략. 첫 번째 줄: 시간의 순차적 게이팅, FSC 기반 생세포 대 SSC, FSC-W 기반 단일 세포 대 FSC-H, CD45 대 SSC 위의 백혈구 CD45⁺ 세포, CD45^DIM/SSC 위의 배아, FSC-A/SSC-A 단핵세포(MNC), CD45 대 CD34 플롯의 MNC CD34⁺ 세포, 그리고 CD34 대 CD117 플롯의 성숙한 블라스트 게이트.
두 번째와 세 번째 행: 가장 관련 있는 LAIP 게이트(LAIP1–LAIP8)를 정의하기 위해 사용되는 고정 이중파라미터 점플롯. MRD LAIP는 다음과 같은 불리언 전략을 사용하여 정의되었습니다: 시간 및 생체 세포, 단일 세포, 블라스트 및 ^CD34−CD117⁻ 블라스, LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7, LAIP8. 그림 속 사례에서 MRD는 백혈구 CD45⁺의 15%였으며, 건강한 골수에서는 0.09% ± 0.02%였습니다.
오른쪽: 최종 MRD 게이트의 백게이팅이 정량화에 사용되어 비특이적 이벤트를 정리할 수 있게 했습니다. 약어: AML = 급성 골수성 백혈병; MRD = 측정 가능한 잔존 질환; LAIP = 백혈병 관련 면역표현형; FSC = 순방향 산란; SSC = 측면 산란; WBC = 백혈구; MNC = 단핵전지; hBM = 건강한 골수. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 정상 조혈줄기세포(nHSCs) 및 백혈병 줄기세포(LSC) 풍부 세포의 CD34^+CD38− 분획(튜브 2)에 대한 게이팅 전략. (A) 정상 조혈 줄기세포(nHSC) 및 (B) CD34⁺CD38⁻ 분획(튜브 2) 내 백혈병 조혈모세포(LSC) 풍부 세포. 첫 번째 줄: 시간의 순차적 게이팅, FSC 기반 생세포 대 SSC, FSC-W 기반 단일 세포 대 FSC-H, CD45 대 SSC 위의 백혈구 CD45⁺ 세포, CD45dim/SSC 위의 모세포, FSC-A/SSC-A 단핵세포(MNC), CD45 대 CD34 플롯의 MNC CD34⁺ 세포.
두 번째부터 네 번째 행까지: 고정된 이중파라미터 점플롯으로 P6(CD34^+CD38−), P7(^CD34+CD38 낮음), P8(CD34⁺CD38^높음)을 정의하며, MIX(CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA를 포함한 가장 관련 이분법 LSC 마커들과 함께 사용되었습니다. MRD LSC는 다음과 같은 불리언 전략을 사용하여 정의되었습니다: 시간 및 생체 세포, 단일세포, 배반, MNC 및 MNC CD34+, P6 및 (P6 LSC MIX⁺ 또는 P6 LSC CD123⁺ 또는 P6 LSC CD45RA⁺).
오른쪽: 정량화에 사용된 최종 MRD LSC 게이트의 백게이팅, 비특이적 이벤트의 정리를 가능하게 하는 모습.
(A) 건강한 골수 샘플 내 nHSCs: nHSC(보라색 사건)는 CD34⁺CD38⁻, MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻, CD90⁺였습니다. nHSC CD34⁺CD38⁻ 분획은 백혈구 CD45⁺의 0.02%를 차지했으며, LSC CD34⁺CD38⁻ 세포는 음성이었다. 보고된 검사 임계값은 LOQ 0.0001%와 LOD 0.001%였습니다.
(B) AML 샘플 내 LSC 풍부 세포: LSC 강화 세포(오렌지 사건)는 CD34⁺CD38⁻, MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻, CD90⁺였습니다. LSC CD34⁺CD38⁻ 분획은 백혈구 CD45⁺의 3.7%를 차지했습니다. 약어: nHSCs = 정상 조혈줄기세포; LSC = 백혈병 줄기세포; MNC = 단핵전지; WBC = 백혈구; SSC = 측면 산란; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = 인간 백혈구 항원-DR; LOQ = 양화의 한계; LOD = 탐지 한계. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: CD38 형광-1(FMO) 채널을 사용하여 CD34⁺ 집단에서 CD38⁻ 임계값을 정의한 결과. 첫 번째 줄: 기준 집단의 게이팅, CD45/SSC, MNC CD19⁺ 세포, MNC CD34⁺ 세포 배반 포함.
두 번째 줄: CD38 FMO 채널의 신호 레벨. 첫 번째 줄은 아세포를, 두 번째 줄은 MNC CD19⁺ 세포를, 세 번째 줄은 MNC CD34⁺ 세포를 나타냅니다. 주황색 선은 P6 CD34⁺CD38⁻ 게이트를 정의하는 임계값을 나타냅니다.
세 번째 줄: CD38 PE-Cy7 신호 레벨. 첫 번째 줄은 블라스트 세포를, 두 번째 줄은 P8 CD34^{+CD38 높}음을 정의하는 데 사용되는 CD38 혈단원 수치를 가진 MNC CD19⁺ 세포를, 세 번째 줄은 주황색으로 표시된 MNC CD34⁺ 세포를 나타내며, P7 CD34^{+CD38 세포}는 녹색, P8 CD34⁺CD38 높음 파란색 감방. 약어: FMO = 형광 -1; MNC = 단핵전지; SSC = 측면 산란; PE-Cy7 = 피코에리트린-시아닌 7; P6 = CD34+CD38− 분율; P7 = CD34+CD38 저분율; P8 = CD34+CD38 고분율. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: MNC CD34⁺ 세포를 기반으로 한 골수 샘플 대표성 평가. (A) MNC CD34⁺ 세포의 게이팅 전략 및 공식 계산에 사용되는 매개변수: n, MNC CD34⁺ 세포 수; L, 백혈구 CD45⁺ 세포 수; s, 정상 말초혈 내 MNC CD34⁺ 세포 비율; 그리고 m., 기준 정상 골수에서 관찰된 MNC CD34⁺ 세포의 비율. (B) 말초혈(PB)에 의한 골수(BM) 희석이 BM 샘플에서 CD34⁺ 세포의 기원에 미치는 영향의 도식적 표현. (C) BM 순도 해석에 사용되는 기준. 약어: BM = 골수; PB = 말초혈; MNC = 단핵전지; 백혈구 = 백혈구. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 네 개의 유세포계 플랫폼 간 발현 패턴 비교.
정상 골수(BM) 샘플은 각 플랫폼과 척도 조정에 따른 설정으로 네 개의 세포계 플랫폼에서 동시에 검사되었습니다. 첫 번째 행은 CD45/CD33 점플롯에 MNC 세포를 보여줍니다; 두 번째 행은 원시 마커 CD34/CD117 점플롯에 있는 MNC 세포를 보여줍니다; 세 번째 행은 CD34/CD38 도트 플롯의 블라스트 세포를 보여줍니다; 네 번째 행에는 CD45RA/CD90 점플롯에 P6 CD34⁺CD38⁻ 세포가 표시됩니다. 약어: BM = 골수; MNC = 단핵전지; P6 = CD34⁺CD38⁻ 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 7: 참여 유량 실험실 간 습식 실험실 EQA 재현성. (A) 백혈구 CD45⁺ 세포 내 5개 습식 실험실 EQA 라운드 및 참여 유량 실험실 내 %P6 CD34⁺CD38⁻ 세포 분포를 보여주는 바이올린 플롯. (B) 백혈구 CD45⁺ 세포 내 5개 습식 실험실 및 참여 유동 실험실에 걸친 %MNC CD34⁺ 세포 분포를 보여주는 바이올린 플롯. 약어: EQA = 외부 품질 평가; P6 = CD34+CD38− 분율; WBC = 백혈구; MNC = 단핵전구. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 8: LAIP/DfN 및 LSC MRD 측정에 대한 건식 EQA 평가. (A) 8색 패널 그룹에서 6개의 공유 FCS 파일을 사용한 건식 EQA2017 연습, AML 진단, AML MRD, 관 1 LAIP 및 튜브 2 LSC 분석을 위한 정상 골수 참조 파일을 사용함. 이 훈련은 23개 참여 연구소와 공유되었습니다. (B) 12색 패널 그룹에서 6개의 공유 FCS 파일을 사용하여 LAIP/DfN 및 LSC MRD 측정을 위한 건식 EQA2024 연습(AML 진단, AML MRD, 그리고 튜브 1 LAIP 및 튜브 2 LSC 분석을 위한 정상 골수 참조 파일)을 포함합니다. 이 훈련은 24개 참여 연구소와 함께 진행되었습니다. (C) 습EQA2025 기간 동안 측정된 백혈구 CD45⁺ 세포 내 %MNC CD34⁺ 세포와 %nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ 세포의 플랫폼 간 비교를 25개 참여 실험실과 공유했습니다. MNC CD34⁺ 세포의 기대 값은 1.6%, nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ 세포는 0.02%였습니다. 약어: EQA = 외부 품질 평가; LAIP = 백혈병 관련 면역표현형; DfN = 정상과 다르다; LSC = 백혈병 줄기세포; MRD = 측정 가능한 잔존 질환; FCS = 유세포검사 표준; AML = 급성 골수성 백혈병; MNC = 단핵전지; nHSC = 정상 조혈줄기세포; 백혈구 = 백혈구. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 9: LAIP/DfN 접근법을 사용한 대표적인 MRD 측정. (A) LAIP/DfN 방법을 사용한 MRD 측정 예시. 왼쪽은 진단 샘플의 백혈병 세포에 대한 LAIP 지도 제작 결과이며, 오른쪽은 추적 샘플에 동일한 LAIP 지도 제작을 적용한 모습을 보여주며, MRD 집단은 검은색으로 표시되어 있습니다. (B) DfN 방법을 이용한 MRD 측정 예시. 각 점표 쌍은 건강한 골수(hBM; 정상, 왼쪽 그래프)와 MRD 추적 골수 샘플(DfN, 오른쪽 그래프)을 비교합니다. "빈 상자" 영역은 정상 골수에서 정의되며, 추적 관찰 샘플에서 이 빈 상자 내 백혈병 세포 존재를 평가하고 비정상 집단은 검은색으로 표시한다. 약어: MRD = 측정 가능한 잔여 질환; LAIP = 백혈병 관련 면역표현형; DfN = 정상과 다르다; hBM = 건강한 골수. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 10: 진단 및 추적 관찰 시 CD34⁺CD38⁻ LSC 풍부 세포의 대표적인 측정. (A) AML 진단 샘플에서 LSC 풍부 세포 측정 예시. 왼쪽은 LSC 풍부 프로필을 보여주며, 주황색 집단은 CD34^+CD38− 분획 내에서 MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR, CD36을 발현합니다.
(B) 동일한 환자의 추적 관찰 샘플로, 동일한 면역표현형 프로필을 가진 MRD LSC 풍부 세포(주황색 집단)가 지속됨을 보였습니다. 약어: LSC = 백혈병 줄기세포; AML = 급성 골수성 백혈병; MRD = 측정 가능한 잔존 질환; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = 인간 백혈구 항원-DR. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 11: LSC 검출의 분석적 민감도. (A) LSC 검출을 위한 빈칸 한계(LOB) 평가. 왼쪽은 5개의 건강한 골수 샘플에서 5개의 FCS 파일을 합쳐 CD34⁺CD38⁻ 사건을 정량화한 모습(5,148,000건의 백혈구 사건 획득)을 보여줍니다. 오른쪽은 CD45/SSC 닷플롯에서 백게이트된 LSC 불리언 게이트 이벤트 수(14개 이벤트)를 보여주며, LOB는 <0.0005%(5 × ^10-6)에 해당합니다. (B) LSC 정량화를 위한 선형성 평가. 왼쪽은 건강한 골수 샘플에서 LSC 풍부 세포의 연속적인 희석을 보입니다. 오른쪽은 측정된 MRD 값과 이론값 간의 상관관계를 보여주며, 양정 한계(LOQ)는 2 × ^10-5 (0.002%)에 해당합니다. 약어: LSC = 백혈병 줄기세포; LOB = 빈칸 제한; FCS = 유세포검사 표준; WBC = 백혈구; MRD = 측정 가능한 잔존 질환; LOQ = 양화의 한계. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 12: MRD LAIP 측정의 선형성 및 정량 범위. (A) 건강한 골수에서 서로 다른 LAIP를 가진 모반을 연속 희석하여 MRD LAIP 정량화의 선형성 평가, 측정된 MRD 값과 이론값 간의 상관관계를 보여주며, 다양한 LAIP와 LOQ에 따른 LOQ가 변함 <0.1%). (B) 다양한 LAIP에 따른 정량화 범위. 빨간 선은 임상 임계치의 0.1%를 나타냅니다. LOQ는 모든 검사된 LAIP에서 임상 기준에 도달했습니다. 약어: MRD = 측정 가능한 잔여 질환; LAIP = 백혈병 관련 면역표현형; LOQ = 양화의 한계. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

플루로 크롬	정점	리릭12c	정점	DxFlex13c	정점	NAVIOS10c	정점	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
체육	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

표 1: 8피크 무지개 구슬을 사용한 각 플랫폼의 목표 값. 각 세포계 플랫폼(Canto, Lyric, Navios, DxFlex)별로 구체적인 목표값이 표시됩니다. 보존된 피크는 폭발세포에서 관찰된 MFI에 가깝도록 선택되었습니다. 이는 PMT 기반 사이토미터에서 특히 중요한데, PMT 전압이 상승해도 신호 세기가 선형적으로 증가하지 않는 경우입니다. 반면, APD 기반 사이토미터에서는 신호 강도가 이득에 따라 선형적으로 증가하여 모든 검출기에 동일한 피크를 사용할 수 있지만, PMT 기반 사이토미터에서는 각 채널마다 다른 피크가 필요합니다. 약어: MFI = 중앙 형광 강도; PMT = 광증배관; APD = 눈사태 포토다이오드. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

8C 칸토 /NAVIOS 8c

FITC

체육

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

튜브 1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

튜브 2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2 0.5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 서플 멘테어 그란 8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 보충 엔테어 - 모노스 8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

가정 10-12c

FITC

체육

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

튜브 1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

튜브 2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5μL/Ac)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

T3 서플 멘테어 12c-모노스

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

체육

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 나비오스 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2 나비오스 10c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 서플 멘테어 10센트 모노스

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13c

FITC

체육

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR snv786 (3μL)

T3 서플 멘테어 12c 모노스

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

표 2: AML MRD, LAIP/DFN 및 LSC 분석을 위한 항체 패널 구성. 표는 세포계 플랫폼에 따른 8, 10, 12, 13색 패널 구성을 요약합니다. 튜브 1은 LAIP/DfN 분석에, 튜브 2는 CD34^+CD38− LSC 풍부 세포 분석에, 튜브 3은 단핵구/과립세포 분화 마커에 사용됩니다. 각 플랫폼별로 항체 부피와 형광색소 할당이 표시됩니다. MIX3는 CD97, TIM3, CLL1에 해당합니다. 약어: AML = 급성 골수성 백혈병; MRD = 측정 가능한 잔존 질환; LAIP = 백혈병 관련 면역표현형; DfN = 정상과 다르다; LSC = 백혈병 줄기세포; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

골수성 전구체에서 정상 발현 마커가 완전히 소실됨

CD13++CD33-/CD34+ 또는 CD117+

CD13-CD33++/CD34+ 또는 CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

교차 계통 림프구 표지자의 골수성 전구체 발현

CD7+CD13+/CD34+ 또는 CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ 또는 CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ 또는 CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ 또는 CD117+

CD19+CD117+/ 또는 CD13+ 또는 CD33+

골수계 전구체의 과다발현

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

골수성 전구체의 발현 감소

CD38loCD34+CD33+CD117+

표 3: LAIP 기반 DfN "빈 상자" 정의. 표에는 비정상적인 골수종 전구체 집단을 식별하는 데 사용되는 미리 정의된 정상과 다르다(DfN) '빈 상자' 패턴이 나열되어 있습니다. 범주에는 정상 발현 마커의 완전 상실, 교차 계통 림프구 마커 발현, 마커 과발현, 골수계 전구체의 마커 발현 감소 등이 포함됩니다. 약어: LAIP = 백혈병 관련 면역표현형; DfN = 정상과 다르다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

홀드리넷 외 17
Broolmans 외 15
골수 순도 = (1 − (GRMO/GRSG) x (GBSG/GBMO)) x 100	>80%
Björlund 외 19	GPA > 15%
	CD3 < 20%
로켄 외 18	CD16높음 < 30%
Theunissen 외 20; Dworzak 외 21
유동 또는 Ctr DIL 세포학: PNN < 40%, Ebl> 5%, Ly < 20%	CD16++ CD11b++ < 40%
	GPA > 5%
	CD3 < 20%
대농 순도 %: MNC 34+/WBC45+	모메 순도 100-10%

표 4: AML MRD 흐름 보고를 위한 골수 희석 조절 방법. 표는 AML MRD 유동 임상 보고서에 사용할 수 있는 출판된 골수 희석 및 대표성 관리 방법을 요약한 것입니다. MRD 결과 해석을 지원하기 위해 적어도 한 가지 희석-조절 방법을 적용해야 합니다. CD34/WBC45⁺ 골수 순도 접근법이 보완적 품질 평가로 포함되었습니다. 약어: AML = 급성 골수성 백혈병; MRD = 측정 가능한 잔존 질환; BM = 골수; WBC = 백혈구; CD45⁺ 백혈구 중 CD34/WBC45⁺ = CD34⁺ 세포. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 1: 추가 배경, 플랫폼 조화, 참고 골수 및 예후 지원 자료. 이 보조 파일은 LSC 식별, AML 표현형 이질성, 플랫폼 간 미러링, 플랫폼별 최적화, 참조 골수 표지 발현 프로필, 종단 패널 진화, 진단 시 LSC 정량에 사용되는 예후 임계값과 관련된 지원 도표와 표를 포함하고 있습니다. 이 자료들은 다기관 MRD 유세포검사 워크플로우에 추가적인 맥락을 제공하며, CD34⁺CD38⁻ LSC 강화 세포 평가의 근거, 플랫폼 조화의 기술적 근거, 그리고 참고 골수 배경 분석, 패널 이동, 임상 임계 선택 해석에 사용되는 지원 데이터를 포함합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

프로토콜의 핵심 단계

샘플 품질은 정확한 MRD 및 LSC 정량화에 매우 중요합니다. 신선한 골수 샘플은 실온에서 운송하여 이상적으로는 24–48시간 이내, 필요^{시 채취} 후 72시간 이내에 처리해야 합니다. 혈액 조출은 각 시점에서 평가하여 임상 흐름 보고서에 포함해야 합니다. 임상의는 유도 투여, 고정, 표적 면역치료, 아자시티딘/베네토클락스와 같은 덜 강도 높은 치료, 또는 동종이식 치료 시점을 명확히 해야 합니다. 차별화 환경은 치료와 시점과 밀접하게 관련되어 있으며, MRD 해석에 통합하는 것이 중요합니다. 종단 추적 관찰 중에도 동일한 기기 민감도와 분석 신뢰도를 무지개 제어 구슬로 목표값 정기적 점검, 정기적 EQA, FCS 파일 공동 검토를 통해 유지해야 합니다.

MRD 유량 정량화의 높은 표준화와 센터 간 신뢰성은 유량 그룹에서 정기적인 웹 기반 교육 교육을 통해 유지되고 있습니다. 매달 최소 한 번의 웹 교육 세션이 실시되었고, 이 기간 동안 MRD LAIP/DFN, MRD LSC, 또는 진단용 LSC 정량화 사례가 100건 이상 논의되고 검토되었습니다. 이 지속적인 교육은 유동 데이터 해석에 매우 중요하며, 특히 저수준 MRD, 생리학적 배경 집단, 재생 골수, 치료 중인 표현형 전환 등에는 고도로 자격을 갖춘 생물학자가 필요합니다.

CD34⁺CD38⁻ LSC 풍부 개체군의 정량화도 또 다른 중요한 단계입니다. 정상 조혈줄기세포(LSC)를 포착하는 보편적인 표지는 없습니다. HOVON 그룹은 AML 진단 및 추적 관찰에 LSC 모니터링을 도입했으며, 여기에는 관련 "이분" LSC 마커 세트가 포함된 8색 패널이 포함되어 있습니다^. 이분형 마커는 정상 조혈 줄기세포에서는 발현이 없으나, LSC 풍부 집단에서는 희미하거나 중간, 높음, 이질적, 이중성(bimodal) 패턴을 가진 양성 발현을 나타내는 것으로 정의됩니다. CLL1, TIM3, CD97과 같은 특정 이분법적 LSC 표지자를 단일 채널에 포함시키는 데 관심이 있는데, 이는 하나만 양성이라도 LSC 풍부 세포를 검출할 수 있기 때문입니다. 다른 마커들은 특정 채널에서 별도로 사용해야 하는데, 이는 골수 상태에 따라 정상 조혈줄기세포의 발현과 겹칠 수 있기 때문이며, 재생 또는 스트레스 받은 골수 포함^된다. LSC 농축 세포의 완전한 정의는 불리언 연산자에 기반하며, CD34⁺CD38⁻ 분획에서 표지자의 이상 발현을 포함합니다. 이것이 표현형적 정의이기 때문에, 개체군은 모든 샘플에서 기능적으로 입증된 LSC가 아니라 CD34⁺CD38⁻ LSC 풍부 세포로 해석되어야 합니다. 이 LSC 패널은 과도한 배반이 있는 MDS 환자와 AML MRC 환자에게도 동일한 프로토콜을 적용할 수 있습니다.

메서드의 수정 및 문제 해결

플랫폼과 패널 진화 과정에서, 특히 8색에서 10색 패널에서 12색에서 13색 패널로 전환할 때 실험실 네트워크 내에서 표준화/조화화 접근법을 유지해야 합니다. 기계의 발전으로 임상 연구 전반에 걸쳐 공통의 항체 뼈대와 표현형 이상 탐지에 있어 동일한 민감도를 유지할 필요가 있습니다. 플랫폼 진화 과정에서 골격 내 항체의 형광색소는 모든 기계에서 안정적이고 공통적으로 유지됩니다(CD34/CD38/CD45/CD117). 하지만 일부 채널에서는 기계별 광학 뱅크로 인해 플루오로색 변경이 필요하며, 이는 조화화 접근법이 필요합니다. PMT 검출기 세포계에서 APD 검출기 세포계로 전환할 때는 고파장에서 APD 검출기의 높은 감도를 고려해야 합니다. 따라서 경우에 따라 특정 항체에 대한 형광색소 색상 선택을 동일 염색 지수를 유지하고 채널 간 과도한 확산을 방지하도록 조정하여 최적화 접근법을 채택해야 합니다. 현재 임상 세포계는 12에서 13색 패널을 지원하여 LAIP 검출의 특이성을 높이고, MRD 게이트 내 오염 세포를 제거하는 마커 추가를 통해 해석을 개선합니다. 하지만 이로 인해 분석의 복잡도도^증가합니다.

8색 패널에서 12색 패널로의 업그레이드는 일부 경우에 MRD 평가의 민감도와 특이성을 향상시켰습니다(보충 파일 1). 튜브 1에는 HLA-DR, CD36, CD10, CD56이 CD7에서 분리되어 추가되었습니다. 튜브 2에는 HLA-DR, CD36, CD200, CD19가 추가되었습니다. 3번 튜브에는 CD4, CD64, CD38, CD36, CD14가 추가되었습니다. HLA-DR은 현재 각 튜브에서 CD38과 체계적으로 결합되어 LAIP와 변화된 분화 패턴을 보다 명확하게 정의할 수 있게 합니다. 현재 각 튜브에 체계적으로 포함된 CD36은 적혈구, 적혈구, 혈소판, 잔해를 식별하고 최종 MRD 게이트를 정밀하게 만드는 데 중요한 표지자입니다. LSC 튜브 내 CD19는 혈액 구분 식별에도 도움을 줍니다. 단핵구와 과립구 분화 마커를 하나의 튜브에 결합하면 단핵구 및 과립구 분화 패턴을 더 잘 구분할 수 있으며, LAIP를 식별하는 데 이상을 구분하는 데 도움을 줍니다. 8색 패널에서 10색 패널로 전환할 때, 주요 개선점은 LAIP 검출에서 나왔으며, 특히 1번 튜브에서 CD7과 2번 튜브에서 HLA-DR과 CD19가 분리된 것이었다. 10색 패널에서 12색 패널로 전환할 때, 각 튜브에 CD36을 추가하여 블라스트 및 LSC 게이트를 더 잘 청소한 점이 개선되었으며, 튜브 1의 CD10과 튜브 2의 CD200으로 완성되었습니다. 이는 검출 한계 이상이지만 정량 한계 이하의 저수준 MRD 환자에게 특히 유용했습니다. 종합해 보면, 임상 임계값 ≥0.1%에서 MRD 양성인 대부분 환자는 이미 8색 패널로 확인되었으며; 그러나 튜브 내 더 많은 마커를 사용함으로써 특히 ELN 2025 지침에 언급된 저준위 MRD에 대한 MRD 평가의 특이성과 해석이 향상되었습니다.

방법의 한계

멀티센터 접근법을 선택하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 개념의 실현 가능성을 위해서는 AML 임상시험에서 MRD 흐름을 구현하기 전에 필수적인 단계가 필요합니다: 기기 민감도와 샘플 준비의 조화, 그리고 분석^{조작자를 위한} 교육 및 체계적 교육입니다. 플랫폼이 진화함에 따라 다중 센터, 다중 플랫폼 전략은 결과의 견고성과 재현성을 유지하기 위해 조정되어야 합니다. 여기에는 동일한 패널과 설정을 동일한 플랫폼 유형에 사용하는 표준화가 포함됩니다; 조화는 여러 플랫폼에서 동일한 패널을 조화롭게 설정하는 방식; 그리고 각 플랫폼에 맞게 조정된 패널과 특정 설정을 사용하는 최적화.

혈액 생성은 MRD 유량 정량화에서 가장 도전적이고 중요한 지점 중 하나입니다. 본 프로토콜에서 설명된 CD34/WBC 대표성 공식은 골수 샘플의 보완적 품질 관리 지표로 사용되어야 하며, MRD 결과를 정규화하는 데 사용해서는 안 됩니다. 그 해석은 골수 재생, 치료 효과, 잔여 질환, 덜 강도 높은 치료 요법에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 마찬가지로, CD56, CD123, CD45RA와 같은 마커는 단독 DfN 또는 LSC 마커로 해석해서는 안 됩니다. 이들은 완전한 게이팅 전략, 정화 게이트, 참고 골수 배경, 임상 맥락 안에서 해석되어야 합니다.

기존 또는 대안 방법과 비교한 방법의 중요성

ELN 2025 가이드라인에 따르면, MRD는 평가 방법이나 시기와 관계없이 AML 환자에서 주요 예후 지표입니다. 다양한 MRD 유동 기법과 마커의 사용은 매우 상호 보완적입니다. LAIP/DfN 및 LSC 분석을 포함한 다중 모달 MRD는 표준화된 네트워크 내에서 결과를 조화롭게 보고하는 데 유용합니다. MRD 평가는 치료 반응과 재발을 더 잘 정의할 수 있게 해줍니다. 다기관 및 다중모달 MRD 흐름과 분자 MRD는 새로운 표적 치료, 1차 및 2차 치료, 동종 이식, 저강도 치료를 포함하는 점점 더 복잡해지는 치료 환경 속에서 향후 임상시험에서 전략적 역할을 할 것입니다.

특정 연구 분야에서의 중요성과 잠재적 응용

HOVON 및 ALFA 그룹은 AML 진단 시 CD34⁺CD38⁻ LSC 풍부 집단의 정량화가 임상적 영향을 미친다고 보고했습니다(보충 문서 1). 정량화 방법을 바탕으로 LSC의 임상적으로 유의미한 임계값을 정의하는 것이 매우 중요해 보입니다. 여기서 설명한 방법을 사용해 이전에 보고된 대로, LSC 임계값 ≥1%는 불리한 결과와 연관되어 있었습니다(보충 파일 1)²⁶. AML 관리에서는 MRD, LSC 모니터링, 클론 조혈의 차별 통합이 치료 해석을 정교하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주요 도전 과제는 추가 치료가 필요할 수 있는 MRD와 안정적인 전백혈병 클론(²⁷번이 아닐 수 있음)을 구분하는 데 있습니다. 2025년 EHA/ELN 지침에서 AML 추적 관찰을 위해 모반 비율을 계산하는 통합 보고 시스템이 최근 권장되었습니다²⁸. 이 연구는 MRD 결과와 형태학적 비교를 통합하여 모반의 조화로운 평가를 수행하며, AML 환자의 반응 범주를 정의하기 위한 임상시험에서의 일관된 보고를 촉진할 것입니다.

HOVON 연구와 ALFA/FILO BIG1 연구 모두 LAIP/DfN과 LSC 접근법을 결합한 점수를 통해 환자를 네 그룹(LAIP⁻/LSC⁻, LAIP+/LSC⁻, LAIP⁻/LSC⁺, LAIP⁺/LSC⁺)으로 분류할 수 있었으며, 3년 전체 생존율은 ^3,26,29. 전반적으로 이 결과들은 MRD LAIP/DfN과 LSC 상태의 복합 임상적 예후적 영향을 보여줍니다. 동종 조혈줄기세포 이식의 맥락에서, 총 배반 수가 5% 미만일 때도 CD34⁺CD38⁻ LSC 풍부 세포의 존재가 이식 후 실패를 예측하는 요인으로 보고되었습니다³⁰. 이 임상 데이터는 결합된 MRD 흐름 전략의 관련성을 뒷받침하지만, 현재 프로토콜은 센터 간 기술 워크플로우와 보고 표준화에 중점을 두고 있습니다.

관점으로, 스펙트럼 유동 기술은 다차원 유세포 분석 접근법에서 동시에 검사되는 마커 패널을 확장하여 모니터링되는 LAIP의 특이성을 높이고 조혈 재생에 따른 생물학적 배경 잡음을 줄일 수 있습니다. 여기서 제안한 플랫폼, 패널, 센터 간 스펙트럼 흐름 재현성 평가는 임상 구현에 있어 도전적일 것입니다. FlowSOM, t-SNE, UMAP 등 새로운 비감독 분석 알고리즘은 CD34⁺CD38⁻ LSC 농축 분획부터 폭발 부류까지 정상적인 조혈과 백혈병 구획 간의 구별을 촉진할 수 있습니다. LSC 분획을 더 깊이 포착하면 환자 유래 이종이식 모델에서 착립 모니터링을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다^31,32. ELN 작업 그룹이 이러한 새로운 접근법을 검증하고 조화시키기 위해 설립되었습니다 ^33,34.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항체 (CANTO 8C-LYRIC12C)	형광색	회사	카탈로그 번호
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
항체 (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	형광색	회사	카탈로그 번호
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500