생쥐 뇌 내피 NAD+ 대사의 실시간 2광자 영상

요약

이 프로토콜은 내피 표적 바이오센서 발현, 두개골 창 준비, 2광자 영상을 사용하여 생체 쥐에서 뇌 내피 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 대사를 실시간으로 모니터링할 수 있게 합니다.

초록

우리는 두개창 2광자 현미경과 내피 표적 형광 NAD⁺ 센서를 사용하여 생체 쥐의 뇌 미세혈관 내피세포에서 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD⁺) 생체 센서 채널 반응을 실시간으로 시각화하는 재현 가능한 워크플로우를 제시합니다. 프로토콜에는 (1) AAV-X1.1을 이용해 뇌혈관 내피에서 NAD⁺ 센서를 선택적으로 발현하는 AAV-X1.1(혈관 내피 카데린), (2) 안정적인 3mm × 3mm 두개골 피질 창의 외과적 준비, (3) 920 nm 여기된 녹색 센서 채널 신호와 1040 nm 여기된 혈관 내 테트라메틸로다민(TMR)-덱스트란을 동시에 포착하는 이중 파장 2광자 영상 이미징이 포함됩니다 참조 채널. TMR–덱스트란 채널은 혈관 내강 기준을 제공하며 혈관 선택, 운동 평가 및 혈관 완전성 평가를 지원합니다. 적용 예로, 우리는 마시는 물, 구강 개베지 또는 정맥 주사 후 니코틴아마이드 단핵소판화 관련 감각 채널 형광 변화를 설명합니다. 이 프로토콜은 중요한 단계, 권장되는 바이러스 용량 및 역가율 고려사항, 문제 해결 및 정량적 분석 전략을 강조하여, 연구실이 뇌혈관 NAD⁺ 생체 센서 채널 역학을 생체 내에서 모니터링하여 건강과 질병 분야의 신경대사 연구를 수행할 수 있도록 합니다. 

서론

니코티나마이드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD⁺)는 산화환원 균형, 미토콘드리아 활성, DNA 복구, 스트레스 반응성 신호 전달의 중심 보인자입니다. 대뇌 혈관에서 내피 NAD⁺ 항상성은 수동적 대사 결과가 아니라 장벽 완전성, 혈관 긴장도, 신경혈관 결합의 능동적 조절자로 점점 더 인식되고 있습니다^. 내피 NAD⁺ 대사 장애는 노화 관련 혈액-뇌장벽(BBB) 누출과 신경혈관 항상성 저하와 연관되어 있어, 살아있는 뇌 조직에서 내피 대사 역학을 직접 해결할 수 있는 방법의 필요성을 강조합니다².

현재 NAD⁺를 정량화하는 데 사용되는 대부분의 방법은 종말 생화학적 측정, 고정 조직 염색, 또는 체외 센서 판독에 의존합니다. 유익하긴 하지만, 이러한 접근법은 미세혈관 구조를 온전하게 보존하지 못하고, 시간에 따른 동물 내 빠른 변화를 쉽게 구분하지 못하며, 이질적인 뇌 조직에 적용할 때 세포 유형 특이성을 제한합니다. 반면, 만성 두개창 2광자 영상은 생체 쥐에서 피질 미세혈관을 고해상도로 반복적으로 시각화할 수 있게 하여, 정의된 생리학적 또는 약리학적 개입 하에서 대사 반응성 내피 신호를 모니터링하는 데 적합합니다 ^3,4,5.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 생체 내 뇌 내피 NAD⁺ 역학을 실시간으로 모니터링할 수 있는 종단 간 워크플로우를 제공하는 것입니다. 이 방법은 내피 표적, 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP) 기반 NAD⁺ 센서를 전신 전달하여 선도염 관련 바이러스(AAV)-X1.1 내에 포장하고, Cdh5 프로모터, 안정적인 3mm × 3mm 두개골 창을 통해 광학 접근을 위한 ^6,7,8, 그리고 혈관 내 테트라메틸로다민(TMR)–덱스트란 참조 채널¹과 함께 이중 파장 2광자 영상을 결합합니다. 센서 메커니즘은 다음과 같이 명확히 밝혀졌습니다: Cambronne 등. LigA-cpVenus 세포질 NAD⁺ 바이오센서는 역반응 cpVenus 기반 센서입니다. NAD⁺ 결합은 표준 488 nm 여기 측정 값에서 cpVenus/eGFP 유사 형광을 감소시키는 반면, 405 nm 여기 채널은 비율 정규화의 기준 역할을 합니다. 따라서 원시 녹색 형광은 NAD⁺ 농도의 직접적인 양성 지표로 해석되어서는 안 됩니다. 이 2광자 구현에서는 녹색 센서 채널 신호를 획득하기 위해 920 nm 여기를 사용하고, TMR–덱스트란 혈관 기준 채널에는 1040 nm 여기가 사용되며; 따라서 현재의 920/1040 nm 획득은 보정된 488/405 nm 비율 측정과 동등하지 않습니다. Cambronne 등은 세포 내 NAD⁺ 역학 모니터링에 광범위하게 검증되었으며 현재의 이중 파장 영상 구성과 호환되기 때문에 선택되었습니다. FiNad와 같은 최신 지표들은 NAD⁺ 역학 모니터링을 위한 대체 접근법을 제공하지만, 이를 구현하려면 현재 TMR–dextran 혈관 참조 표지에 사용되는 적색 형광 채널의 수정이 필요합니다. 캄브론 센서는 유한한 동적 범위 내에서 NAD⁺ 가용성의 상대적 변화를 보고하며, 셀룰러 및 아세포 응용 분야에서 검증되었습니다; 그러나 신호 해석은 발현 수준, pH, 광표백, 광 경로 변동성에 의해 영향을 받을 수 있으며, 절대 NAD⁺ 정량화는 보정 또는 직교 생화학적 검증이 필요합니다. AAV-X1.1이 선택된 이유는 내피-트로픽 AAV 변이체가 중추신경계 혈관을 효율적으로 전달하는 것으로 보고되었기 때문입니다 ^6,7. AAV9, AAV-BR1, AAV-ENT, AAV-X1.1 등 여러 AAV 혈청형을 CAG 또는 Cdh5 유도 증강 녹색 형광 단백질 발현 보고자로 비교한 결과, AAV-X1.1이 검사된 혈청형 중 혈관 관련 발현 패턴이 가장 유리한 것으로 나타났습니다. 이후 Cdh5 프로모터는 혈관 내피 세포로의 형질전환유전자 발현을 추가로 제한하는 데 사용되었으며, 이는 생체^내에서 내피 선택적 형질전환유전자 발현을 입증한 이전 보고와 일치하였다.

체외 NAD⁺ 분석과 비교할 때, 이 방법은 혈관망을 보존하고, 동일 동물 내에서 종단적 측정을 가능하게 하며, 내피 대사 신호와 혈관 내강 참조를 동시에 평가할 수 있게 합니다. 이 워크플로우는 노화, 염증 스트레스, BBB 기능 장애, 그리고 니코틴아마이드 단핵소매(NMN) 투여(9,10,11,12,13)와 같은 대사 개입에 대한 빠른 반응 연구에 특히 유용합니다. 이 방법은 실험 질문이 살아있는 쥐의 피질 미세혈관을 반복적으로 시각화하고 내피 센서 채널 신호의 상대적 변화를 요구할 때 가장 적합합니다. 추가적인 비율 보정이나 생화학적 검증 없이는 절대 NAD⁺ 정량에는 덜 적합하다. 실질적 한계로는 피질 광학 접근성, 영상 깊이 제한, 성공적인 내피 AAV 변환 의존, 잠재적 두개창 관련 염증, 그리고 이중 파장 2광자 현미경 필요성 등이 있습니다. 만성 두개창 이식은 국소 염증, 혈관 반응성, 교모증, 불투명성 또는 조직 재형성을 유발할 수 있으며, 이들은 모두 내피 생리학과 센서 채널 측정에 영향을 미칠 수 있습니다 ^1,3,4. 이러한 교란 요소를 최소화하기 위해 프로토콜은 무균 수술, 간헐적 드릴링과 잦은 냉각, 신중한 지혈, 경막과의 접착 접촉 회피, 수술 후 진통, 일일 모니터링, 그리고 지속적인 불투명성, 염증성 잔해, 감염, 불안정한 혈관 형태, 또는 기초 신호 안정성 저하를 가진 동물의 제외를 요구합니다.

프로토콜

모든 절차는 보건재활과학대학교 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, " 혈액-뇌장벽 완전성의 대사 탐침 기반 관찰의 기전론적 연구"(승인 번호 KFDX: NO. 2023-1023)라는 프로젝트에 따라 진행되었습니다. 모든 수술은 무균 상태에서 수행하며, 승인된 동물 프로토콜에 따라 수술 전 진통과 지지 치료를 제공합니다. 대표적인 워크플로우에서는 부프레노르핀 하이드로클로라이드(0.05–0.1 mg/kg, 피하 투여)를 수술 전이나 직후에 투여하고, 필요에 따라 8–12시간마다 24–48시간 동안 투여합니다. 쥐를 따뜻한 케이지에 넣어 정상적인 자세, 자발적인 움직임, 안정적인 호흡이 회복될 때까지 관찰하세요.

1. 실험적 개요

1. 대표 실험에는 10주에서 12주 된 성체 C57BL/6J 마우스, 23–25g 생쥐를 사용한다.
2. 쥐는 특정 병원체가 없는 환경에서 12시간의 밝고 어두운 주기, 주변 온도가 22°C–24°C, 상대습도 40%–60%, 그리고 자유롭게 먹이와 물을 섭취할 수 있도록 유지하세요.
3. 시술 전 최소 7일 동안 동물을 적응시키세요.
4. 실험 설계에 따라 성별을 사용하세요. 각 실험별로 성별, 동물 수, 그룹 배정을 보고하세요. 여기 표시된 대표적인 영상 데이터셋은 N = 3마리의 마우스를 사용했습니다.
5. 먼저 전신 AAV를 투여하고 3주에서 4주간의 발현 기간을 두고 영상 촬영을 하세요.
6. 영상 촬영 3–5일 전에 두개골 창문 수술을 시행하세요.
7. 영상 촬영 당일에 마우스에 마취를 하고, TMR–덱스트란을 정맥 주사로 투여하며, 충분한 추적자 순환 후 영상 촬영을 수행합니다.
8. 선택한 중재 일정에 따라 NMN을 투여합니다. 영상 촬영 5일 전에는 식수 보충을 제공하고, 영상 촬영 전 정해진 간격에 경구 관술을 시행하며, 기저선 획득 후 영상 촬영 중 정맥 주사 NMN을 투여합니다.
   참고: AAV 투여 후 3주에서 4주 발현 기간 동안 프로토콜을 일시 중단하고, 동물은 정기적인 건강 모니터링과 표준 사육 환경에서 유지하세요. 3일에서 5일간의 회복 기간 동안 두개골 창문 수술 후 프로토콜을 일시정지하세요. 영상 촬영 전에 체중이 안정적이고, 몸 관리와 활동이 정상이며, 감염이나 과도한 염증이 없고, 두개골 창이 맑은지 확인하세요.

2. 종방향 피질 영상을 위한 두개창 수술

1. 수술 전 준비
   1. 마취 유도 전에 모든 수술 기구를 멸균하고 멸균 구역을 구축하세요.
   2. 항온열 가열 시스템을 36.5°C–37.5°C로 유지하도록 설정하며, 가능하면 직장 탐침 피드백 컨트롤러를 사용하세요.
   3. 호흡기 모니터링 장비를 준비하고 수술 전 안정적인 기능을 확인하세요.
   4. 시술 시작 전에 멸균 식염수, 흡수성 면봉, 지혈 재료, 멸균 No. 1.5 유리 커버슬립, 금속 헤드플레이트, 치과용 시멘트를 준비하세요.
   5. 멸균 No. 1.5 유리 커버 슬립을 사용해 3mm × 3mm 두개골 창문을 완전히 덮고 두개골 가장자리에 딱 맞게 놓으세요.
   6. 0.5–1.0 mm 버가 장착된 고속 마이크로드릴을 준비하세요.
   7. 드릴을 최대 속도의 약 절반으로 작동시키고, 두개골 얇아짐 중 즉시 멸균 식염수 관개를 할 수 있는지 확인하세요.
   8. 드릴링 중에는 실온에서 멸균 식염수를 면봉이나 스포이드로 발라서 두개골을 냉각하고 뼈 먼지를 제거하세요.
2. 마취, 두피 준비, 두개골 노출
   1. 마취는 갓 준비된 Avertin 작업 용액(1.25%, 12.5 mg/mL)으로 복막 내 주사로 200–250 mg/kg에 투여합니다.
      1. 기관 표준 운영 절차에 따라 2,2,2-트리브로모에탄올과 2-메틸-2-부탄올로 아베르틴 작업 용액을 준비하고, 용액을 빛으로부터 보호하며, 침전이나 변색이 있는 준비물은 폐기하십시오.
   2. 페달-철수 반사와 호흡 안정을 통해 수술면이 안정된 상태를 확인하세요.
   3. 마취 유도 직후 양쪽 눈에 안과 연고를 바르세요.
   4. 흡입 마취를 사용할 경우, 3%–4% 이소플루란으로 마취를 유도합니다.
   5. 산소 내 1%–2% 이소플루란을 0.5–1.0 L/min의 마취로 유지하고 호흡과 반사 반응에 따라 조절합니다.
      주의: 마취제는 기관 안전 절차에 따라 취급하고 흡입 마취 시 적절한 청소 시스템을 사용해야 합니다.
   6. 마우스를 입체형 프레임이나 맞춤형 헤드 홀더에 고정하여 등쪽 두개골에 안정적으로 접근할 수 있게 하세요.
   7. 가능한 경우 피드백 조절 온열 패드와 직장 탐침을 사용하여 체온을 36.5°C에서 37.5°C까지 유지하세요.
   8. 두피를 면도하고 수술 부위의 흩어진 털을 제거하세요.
   9. 두피를 포비돈-요오드 또는 아이오도포르 용액과 70% 에탄올을 번갈아 사용해 3회 소독합니다.
   10. 소독제가 눈이나 두개골 구멍에 들어오는 것을 피하세요.
   11. 두피 중앙에 절개를 하고 피부를 부드럽게 당기세요.
   12. 두개골을 충분히 노출시켜 두개골 창 생성과 헤드플레이트 고정이 모두 가능하도록 하세요.
   13. 골막과 잔여 결합 조직은 가는 겸자나 메스날로 제거하세요.
   14. 멸균된 면봉으로 약 10–20초 동안 두개골을 부드럽게 건조시켜 표면이 젖은 것이 아니라 무광으로 보일 때까지 합니다.
   15. 노출된 조직의 과도한 탈수를 피하세요.
3. 3mm × 3mm 두개골 절개술 표시
   1. 수술용 현미경으로 브레그마와 람다를 식별합니다.
   2. 이 해부학적 랜드마크를 활용해 정중앙선과 목표 피질 영역을 파악하세요.
   3. 등쪽 체감 피질의 한쪽 반구에 3mm × 3mm 정사각형을 표시하세요.
   4. 앞쪽 가장자리는 브레그마에서 약 0.5 mm 뒤쪽에, 내측 가장자리는 정중선에서 약 1.0 mm 외측에 위치시킵니다.
   5. 주요 두개골 봉합사와 큰 표면 혈관은 가능한 한 피하세요.
4. 드릴 및 뼈판 제거
   1. 표시된 주변을 따라 두개골을 연속적인 압력 대신 간헐적 드릴 접촉으로 얇게 만드는 것.
   2. 시추 중에는 열 손상을 방지하기 위해 멸균 식염수를 반복적으로 사용하세요.
   3. 한 번에 약 20–50 μL 무균 식염수를 투여하거나 두개골 표면을 촉촉하고 시원하게 유지할 수 있을 만큼 충분한 양을 투여하세요.
   4. 10–20초마다 또는 뼈 먼지가 쌓이거나 열 축적이 의심될 때마다 반복 관개하세요.
   5. 뼈가 균일하게 반투명해지고 약간 유연해질 때까지 계속 얇게 만듭니다.
   6. 경막 혈관의 가시적 박동, 보존된 경막 맥박, 피질 압박 또는 열 변색의 부재를 관찰하여 적절한 얇아짐을 확인합니다.
   7. 과도한 열 축적, 출혈, 또는 경막 맥박 감소가 발생하면 즉시 드릴을 중단하세요.
   8. 계속하기 전에 해당 지역을 관개하고 재평가하세요.
   9. 가는 겸자나 바늘 끝으로 뼈 덮개를 한쪽 모서리에서 살짝 들어 올립니다.
   10. 저항이 남아 있으면 주변을 다시 얇게 만드세요.
   11. 뼈 판막 제거 시 경막을 온전하게 보존하세요.
   12. 멸균 식염수로 뼈 가루를 씻어내세요.
   13. 부드러운 식염수 세척과 흡수성 면봉을 사용해 경미한 출혈을 조절하세요.
   14. 세척 후 1–2분 이내에 사라진다면 출혈이 허용 가능하다고 간주하세요.
   15. 출혈이 약 5분 이상 지속되면 동물을 배제하거나 시술을 중단하세요.
   16. 경막이 찢어지거나, 피질 압박이 발생하거나, 혈액이 영상 부위를 가릴 경우 동물을 배제하거나 시술을 중단하세요.
       참고: 완전한 지혈 후 커버슬립 삽입 전에는 시술을 일시적으로 중단할 수 있습니다. 노출된 경막을 멸균 생리식염수로 촉촉한 상태로 유지하고, 활성 출혈이 없음을 확인한 후에야 재개하세요.
5. 창문 밀봉 및 헤드플레이트 고정
   1. 노출된 경막이 깨끗하고 촉촉하며 출혈이 없는지 확인하세요.
   2. 두개골 절개술 부위에 멸균 커버를 덮어주세요.
   3. 두개골 절개술을 감싸는 두개골 가장자리에 덮개를 두막을 압박하지 않고 위치시키세요.
   4. 표면이 평평하고, 공기 방울이 갇혀 있지 않으며, 경막 맥박이 보존되어 있고, 광학 경로가 명확한지 확인하여 올바른 위치를 확인하세요.
   5. 제조업체의 지침에 따라 치과용 시멘트 또는 Super-Bond C&B 타입 접착제를 준비하세요.
      1. 대표적인 슈퍼-본드 C&B 준비물의 경우, 약 −20°C에서 약 −20°C로 유지된 사전 냉각된 세라믹 접시에서 분말 1스쿱과 촉매 1방, 단량체 4방을 혼합합니다.
   6. 커버슬립 주변의 두개골 바깥쪽 가장자리에만 접착제를 바르세요.
   7. 경막에 접착 접촉을 피하고, 유리 아래에 모세관 심지가 생기지 않도록 하세요.
   8. 접착제를 실온에서 약 5–10분 정도 경화시킵니다.
      주의: 치아 시멘트 및 접착 성분에는 휘발성 또는 자극성 화학물질이 포함될 수 있습니다. 기관 안전 절차에 따라 처리하고 적절한 환기를 사용해야 합니다.
   9. 두개골 창 주변에 맞춤형 티타늄 헤드플레이트를 배치하세요.
   10. 영상 헤드홀더와 연관된 약 10mm 중앙 개구부가 있는 헤드플레이트를 사용하세요.
   11. 머리판 개구부 안에 두개골 창문을 중앙에 맞추세요.
   12. 광학 창 밖의 두개골 접촉 부위에만 치과시멘트를 발라.
   13. 동물을 옮기기 전에 시멘트가 완전히 굳을 때까지 약 5–10분 정도 기다려 주세요.
6. 수술 후 회복 및 창문 품질 관리
   1. 승인된 동물 프로토콜에 따라 수술 후 진통을 투여하십시오.
   2. 대표적인 워크플로우에서는 부프레노르핀 하이드로클로라이드를 8–12시간마다 24–48시간 동안 피하 투여합니다.
   3. 따뜻한 우리에 넣은 쥐를 회수하세요.
   4. 호흡, 자세, 움직임, 단정, 체중을 매일 모니터링하세요.
   5. 투명한 유리 표면, 눈에 띄는 피질 혈관, 온전한 경막, 최소한의 잔류 혈액, 커버 슬립 아래에 접착제가 없음, 감염이 없고 헤드플레이트 고정이 안정적인 두개골 창문을 수용하세요.
   6. 현저한 불투명성, 지속적인 출혈, 염증성 찌꺼기, 감염, 창문 이동, 심한 체중 감소(>15%), 또는 미용 및 활동 부실을 가진 동물은 제외합니다.
   7. 회복 후 3–5일 후에 영상 촬영을 진행하세요.
   8. 영상 촬영 전에 정상적인 활동, 정상적인 미용 행동, 안정적인 체중, 통증이나 감염 없음, 투명한 두개골 창과 명확히 보이는 혈관을 확인하세요.
      참고: 수술 후 회복 기간 동안 프로토콜이 잠시 중단될 수 있습니다. 쥐는 표준 사육 조건에서 유지하고, 체중과 창문 투명도를 매일 모니터링하며, 모든 회복 기준이 충족된 후에야 영상 촬영을 재개하세요.

3. AAV 매개 내피 NAD⁺ 센서 발현

1. 바이러스 구성 및 제제
   1. 내피 Cdh5 프로모터에 의해 구동되는 eGFP/cpVenus 기반의 유전적으로 암호화된 NAD⁺ 바이오센서를 사용하세요.
   2. Cambronne 등 연구를 사용하세요. LigA-cpVenus 세포질 NAD⁺ 바이오센서 서열(예: Addgene 플라스미드 #186787 또는 이에 상응하는 서열 검증 삽입물).
   3. CV232 벡터 백본을 사용하여 NAD⁺ 바이오센서 코딩 서열의 상류에서 Cdh5 프로모터를 클론합니다.
   4. 발현 카세트를 AAV-X1.1 캡시드에 맞춤형 바이러스 제제로 포장합니다.
      1. 각 AAV 제제에 대해 바이러스 생산 제공자, 정제 방법, 바이러스-게놈 정량 방법, 생산 로트 번호, 분석 증명서를 기록하세요.
   5. 각 바이러스 제제에 대해 플라스미드 맵, 서열 검증 결과, 바이러스 생산 정보, 정제 정보, 바이러스-유전체 역가, 분석 증명서를 기록합니다.
      1. 연구에 사용된 각 바이러스 제제에 대해 구성체 지도, 서열 검증 보고서, 바이러스 생산 배치 번호, 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR) 역가 보고서, 정제 문서, 분석 증명서를 기록하십시오.
   6. 모든 구성 요소에 대한 자세한 내용은 재료표 를 참고하세요.
   7. 일반적으로 2 × 10¹³ vg/mL 이상의 로트 특이적 qPCR 역가를 가진 고역가 AAV 제제를 사용하세요.
   8. 일회용 알리코트는 −80°C에 보관하세요.
   9. 반복되는 냉동-해동 사이클을 피하세요.
   10. 사용 전에 생산 로트, qPCR 역가, 보관 기간, 허용 가능한 로트 간 변동을 기록하세요.
2. 체계적인 AAV 관리
   1. 얼음 위에 바이럴 알리코트를 해동하세요.
   2. 바이러스를 멸균 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 희석하여 마우스당 최종 주입량 100–200 μL로 만듭니다.
   3. 동물 한 마우스당 최종 용량을 2× 10¹² vg로 유지하세요.
      1. 로트 특이적 바이러스-유전체 역가를 통해 주입량을 계산하세요. qPCR 역가가 1.39 ×^{10 13} vg/mL인 대표적 제제의 경우, 약 144 μL을 주입하여 마우스당 2 × 10¹² vg의 용량을 전달합니다.
   4. 멸균된 29G 인슐린 주사기를 이용해 후안와 정맥동동 주사로 바이러스를 전달합니다.
   5. 바이러스 현탁액을 약 10–20초에 걸쳐 천천히 주입하세요.
   6. 누출, 과도한 출혈, 안구 손상 없음을 확인하여 성공적인 분만을 확인하세요.
   7. 대체 관리 경로는 별도로 검증하고 보고하세요.
   8. 쥐를 관찰하여 정상적인 자세와 자발적인 움직임이 회복될 때까지 관찰하세요.
   9. 호흡이 안정되어 있고 출혈이나 고통이 없음을 확인하세요.
   10. 완전히 회복한 후에만 동물을 집 우리로 돌려보내세요.
   11. 영상 촬영 전에 센서 발현을 위해 21–28일을 두세요.
   12. 각 비교 세트 내에서 일관된 발현 간격을 유지하세요.
   13. 21일에서 28일 범위를 벗어난 발현 간격은 별도로 검증하세요.
       참고: AAV 발현 기간 동안 프로토콜은 일시 중단될 수 있습니다. 정기적인 사육과 건강 모니터링을 유지하고, 계획된 발현 기간이 지나 동물이 건강해진 후에만 두개골 창문 수술을 진행하세요.
3. 내피 제한의 검증
   1. 정식 데이터 수집 전에 동물 선별을 진행하세요.
   2. 녹색 센서 채널 신호가 감지되고 혈관 네트워크를 따라갈 때 동물을 받아들입니다.
   3. 신호가 TMR–덱스트란–양성 내강 인접한 혈관 벽을 따라 풍부하게 형성되어 있음을 확인한다.
   4. 우성 확산성 실질형 형광이 없음을 확인하세요.
   5. 모든 실험 그룹에 동일한 수용 기준을 적용하세요.
   6. 사후 검증이 필요할 때 PBS를 주입한 후 4% 파라포름알데히드를 투여하는 쥐를 관류합니다.
   7. 뇌를 채취하여 30–40 μm 관상이나 시상부 절편을 준비합니다.
   8. 토마토 렉틴, CD31 또는 혈관 내피 카데린(VE-cadherin)과 같은 내피 표지자를 가진 염색 절편.
      1. 각 검증 실험에 대해 항체 출처, 카탈로그 번호, 로트 번호, 숙주 종, 희석, 배양 조건, 검출 방법을 기록하세요.
   9. 필요 시 니코틴아마이드 포스포리보실트랜스퍼레이제(NAMPT) 및 폴리(ADP-리보스) 중합효소 1(PARP1) 발현을 평가합니다.
   10. 조직 준비에 최적화된 1차 항체 희석을 사용하세요.
   11. 그룹 간 동일한 획득 설정을 사용하여 형광 또는 공초점 이미지를 획득합니다.
   12. 공동위치 현상을 혈관 표지 양성 영역과 겹치거나 바로 인접한 센서 양성 신호의 비율로 정량화합니다.
   13. 대부분의 감지 가능한 신호가 혈관 구조 외부에 있을 때는 동물을 제외하세요.
   14. 용기 벽 농축이 없으면 동물을 제외하세요.
   15. 목표 외 실질형 형광으로 인해 신뢰할 수 있는 관심 영역 선택이 어려울 경우 동물을 제외합니다.
   16. 기초 획득 시 센서 채널 형광이 포화 상태이거나 불안정할 경우 동물을 제외합니다.

4. 2광자 영상 및 정량적 분석

1. 영상 촬영일 준비 및 혈관 내 참조 표지 부착
   1. 갓 준비된 Avertin 작업 용액(1.25%, 12.5 mg/mL)으로 복막 내 주사(200–250 mg/kg)를 투여하거나 기관 동물 프로토콜에서 승인한 마취 요법을 사용하세요.
   2. 페달 철수와 호흡 안정을 통해 안정적인 수술면을 확인하세요.
   3. 유도분만 직후 즉시 안과 연고를 바르세요.
   4. 흡입 마취를 사용할 경우, 3%–4% 이소플루란으로 마취를 유도합니다.
   5. 산소 내 1%–2% 이소플루란을 0.5–1.0 L/min의 마취로 유지하고 호흡과 반사 반응에 따라 조절합니다.
   6. 멸균 PBS에 70 kDa TMR–덱스트란을 10–25 mg/mL로 제조합니다.
   7. TMR–덱스트란 용액을 빛으로부터 보호하고, 기관 관행에 따라 필요하다면 용액을 필터링합니다.
   8. TMR–덱스트란을 20 mg/kg의 정맥 주사로 투여합니다.
   9. 주입량은 재고 농도에 맞게 조절하세요. 25g 마우스의 경우 총 염료 약 0.5mg을 투여합니다.
   10. 트레이서는 신선하게 준비하거나 제조사 권장에 따라 빛을 차단한 상태로 보관하세요.
   11. 영상 획득 전에 TMR–덱스트란을 5–10분 동안 순환시키세요.
2. 현미경 구성
   1. eGFP 기반 센서 채널의 920 nm 여기를 위해 구성된 이중 파장 2광자 현미경을 사용하세요.
   2. TMR–덱스트란 혈관 기준 채널에는 1040 nm 여기 경로를 사용하세요.
   3. 대표적인 이미징은 NIS-Elements AR/AR 분석 소프트웨어(버전 5.42.06)로 제어된 니콘 A1 MP/A1R MP+ 다광자 현미경에서 수행되었습니다.
   4. 각 영상 시스템의 레이저 광원, 펄스 파라미터, 빔 조합 구성, 검출기 유형, 소프트웨어 버전을 기록하세요.
   5. 센서 채널 신호를 TMR–덱스트란 신호와 분리하도록 검출 채널을 구성하세요.
   6. 비전사식 광증배관(PMT) 또는 갈륨 비소인화합(GaAsP) 검출기를 사용하세요.
   7. 약 500에서 550 nm 사이의 녹색 센서 채널 방출을 수집합니다.
   8. 약 570에서 650 nm 사이의 TMR–덱스트란 방출을 수집합니다.
      1. 대표적인 데이터셋에서는 525/50 nm 방출 필터를 사용해 녹색 센서 채널 방출을, 575/25 nm 또는 610/75 nm 방출 필터를 사용해 TMR–덱스트란 방출을 수집합니다.
   9. 채널 간 스펙트럼 번짐을 최소화하세요.
   10. 각 비교 세트 내에서 검출기 이득과 오프셋 설정을 일정하게 유지하세요.
   11. 가능한 경우 단일 채널 제어로 채널 분리를 확인하세요.
   12. 니콘 CFI75 아포크로맷 25XC W 1300 수중 침지 대물렌즈 또는 동등한 대물렌즈(25×, 수치 조리개 1.10, 작동 거리 2.0 mm)를 사용하세요.
   13. 분기점과 내강 가장자리와 같은 고정된 혈관 랜드마크를 사용하여 채널 공동 등록을 확인합니다.
   14. 광학 경로 조정 후 공동 등록 검증을 반복합니다.
   15. 이미징 전에 시료면에서 레이저 전력을 측정하세요.
   16. 각 비교 세트 내에서 920 nm 레이저 출력 일정을 유지하세요.
   17. 각 비교 세트 내에서 1040 nm 레이저 출력 일정을 유지하세요.
   18. 대표적인 작업 범위로 920 nm에서 약 10–20 mW, 1040 nm에서 8–18 mW를 사용하세요.
   19. 레이저 출력은 영상 깊이와 두개골 창 품질에 따라 조절하세요.
   20. 120초 기준선 기간 동안 20% 이상의 신호 손실이 있는 필드는 제외합니다.
   21. 눈에 띄는 광독성 변화를 보여주는 필드는 제외합니다.
3. 획득 설정
   1. 선명한 광학 창, 선명하게 초점을 맞춘 미세혈관, 그리고 최소한의 움직임을 가진 시야를 선택하세요.
   2. 투명한 커버슬립, 눈에 띄는 피질 혈관, 온전한 경막, 최소한의 잔류 혈액, 커버슬립 아래에 접착제가 없고, 감염이 없으며, 헤드플레이트가 안정적으로 고정된 창문도 허용합니다.
   3. 현저한 불투명성, 지속적인 출혈, 염증성 이물질, 감염, 창문 이동, 심한 체중 감소(>15%), 또는 미용/활동 부실을 가진 동물은 제외합니다.
   4. 512 × 512 픽셀 해상도의 타임랩스 이미지를 획득하세요.
   5. 더 높은 공간적 디테일이 필요할 때는 1024 × 1024 픽셀의 대표적인 정지 이미지를 획득할 수 있습니다.
   6. 각 비교 세트 내에서 픽셀 크기, 줌, 스캔 속도, 시야각을 일정하게 유지하세요.
   7. 1–3 μm의 스텝 크기를 사용하여 z-스택을 획득합니다.
   8. 회피아 표면 아래 약 200–250 μm 깊이의 피질 미세혈관을 영상화합니다.
   9. 창문 품질이 허락할 경우 영상 깊이를 약 400 μm까지 확장할 수 있습니다.
   10. 쌍 비교를 위해 영상 깊이를 일정하게 유지하세요.
   11. 급성 개입 전에 1초 간격으로 120초 기준선을 확보하세요.
   12. 미리 정해진 중재 후 기간 동안 획득을 계속하세요.
   13. 주사 후 약 10–30분 동안 정맥 주사 NMN 반응을 기록합니다.
   14. 사전 정의된 실험 평가점에서 식수 및 구강 간부 데이터셋을 확보합니다.
   15. 모든 비교군에서 동일한 획득 환경을 유지하세요.
4. NMN 개입 (응용 예시)
   1. 멸균된 식수에 NMN을 녹입니다.
   2. NMN 농도를 조정하여 약 100 mg/kg/day를 전달합니다.
   3. 음료 병을 빛으로부터 보호하세요.
   4. NMN이 함유된 식수는 24–48시간마다 교체하세요.
   5. 병 무게 측정을 사용해 물 사용량을 모니터링하세요.
   6. 물 섭취량과 체중을 이용해 추정되는 NMN 섭취량을 계산하세요.
   7. 영상 촬영 전 5일간 보충제를 계속 복용하세요.
   8. 경구 개베이징용으로 NMN을 1 mg/mL로 준비하세요.
   9. 20G, 38mm 둥근 끝 개비지 바늘을 사용해 쥐당 200 μL을 투여합니다.
   10. 게베지 후 30–60분 후에 영상 검사를 수행하세요.
   11. 정맥 주사 투여를 위해 NMN을 1 mg/mL로 준비합니다.
   12. 쥐 한 명당 100 μL을 후안와 정맥 또는 꼬리정맥을 통해 주입합니다.
   13. 주사를 10–20초 동안 천천히 투여하세요.
   14. 주사 후 즉시 또는 5분 이내에 영상 촬영을 시작하세요.
   15. 보충 5일 후 식수 데이터셋을 확보하세요.
   16. 구강 개개지 데이터셋을 고정된 사후 시점에 획득합니다.
   17. 정맥 주사 직전에 기준선을 확보하세요.
   18. 정맥 주사 후 약 10–30분 동안 급성 반응을 기록하세요.
5. 영상 처리 및 신호 추출
   1. 모션 아티팩트가 있을 때 모션 보정을 수행하세요.
   2. Fiji/ImageJ(버전 1.8.0 이상)와 StackReg, TurboReg 또는 동등한 강체 등록 알고리즘을 사용하세요.
   3. TMR–덱스트란 채널의 혈관 랜드마크를 이용해 등록을 안내합니다.
   4. 보정 후 잔류 변위가 약 1–2픽셀 미만일 때만 데이터셋을 수용합니다.
   5. 획득 기간 내내 관심 혈관 영역(ROI) 경계가 안정적으로 유지되는지 확인하세요.
   6. TMR–덱스트란 채널을 사용해 혈관 내강을 분할하세요.
   7. 내피 ROI를 내강 바로 옆에 정의하세요.
   8. 안정적인 내면 표지, 최소한의 움직임, 가시성 센서 채널 신호를 가진 일부 미세혈관.
   9. 약 5–80 μm 크기의 혈관 직경을 분석합니다.
   10. 내피 ROI는 약 2–5 μm 너비의 혈관벽 연관 영역으로 정의합니다.
   11. 가능할 경우 시야당 3척에서 5척의 선박을 분석하세요.
   12. 마우스당 1–3개의 시야각을 분석할 수 있을 때는 활용하세요.
   13. 추적자와 센서 신호가 없는 조직 영역에서 배경 투자 수익률(ROI)을 정의합니다.
   14. 배경 ROI는 분석된 용기와 이미지 아티팩트에서 최소 20μm 떨어진 곳에 배치하세요.
   15. 정규화 전 각 채널에서 평균 배경 세기를 빼세요.
   16. 모든 샘플에 동일한 배경-빼기 전략을 적용하세요.
   17. F_sensor(t)의 시계열 평균 강도 값을 추출합니다.
   18. F_ref(t)의 시계열 평균 강도 값을 추출합니다.
   19. NIS-Elements AR/AR 분석 또는 Fiji/ImageJ를 사용하여 측정을 수행합니다.
   20. 원본 이미지 파일을 ND2 파일로 내보내세요.
   21. 가능하면 16비트 TIFF 스택으로 내보내는 분석 복사본을 사용합니다.
   22. ROI 시계열 데이터를 CSV 파일로 내보내세요.
   23. 정규화 전에 배경 뺀 형광 값을 계산합니다.
   24. ΔF/F₀ 을 ΔF/F₀ = (F(t) − F₀)/F₀을 사용하여 계산합니다.
   25. F₀ 을 120초 기준선 주기 동안의 평균 신호로 정의하자.
   26. 혈관 기준 정규화를 F_sensor(t)/F_ref(t)로 계산합니다.
   27. 획득 시간이 허락하는 경우 피크 변화, 피크 도달 시간, 곡선 아래 면적, 회수 속도론을 보고합니다.
   28. 920 nm 센서 채널 신호를 보정된 NAD⁺ 농도로 해석하지 마십시오.
   29. 정량적 NAD⁺ 측정이 필요할 경우 추가적인 비율 보정 또는 생화학적 검증을 수행합니다.
6. 통계 및 보고
   1. 쥐를 생물학적 실험 단위로 정의하세요.
   2. 그룹 수준 분석 전에 각 마우스의 혈관 수준 평균 측정값 또는 중첩 통계 모델을 적용할 수 있습니다.
   3. 마우스 내 정규분포 비교를 위해 쌍 양측 t-검정을 사용하세요.
   4. 정규성 가정이 충족되지 않을 경우 Wilcoxon 매칭 쌍 부호 순위 검정을 사용하세요.
   5. 두 개 이상의 관련 질환을 포함하는 분석에는 반복 측정 ANOVA 또는 혼합 효과 모델을 사용하세요.
   6. 적절한 다중 비교 보정을 적용하세요.
   7. GraphPad Prism 또는 동등한 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하세요.
   8. 통계적 유의성을 p < 0.05로 정의합니다.
   9. 각 도표 평판에 정확한 통계 검정을 보고하세요.
   10. 가능할 경우 ROI 선택 및 정량화 전에 이미지 파일을 코딩하세요.
   11. ROI 측정과 품질 관리 결정이 완료될 때까지 분석가를 눈먼 상태로 유지하세요.
   12. 대표적인 데이터셋에서 N = 3마리의 마우스를 생물학적 실험 단위로 사용하세요.
       참고: 활성 타임랩스 영상 촬영 중에는 이미지 획득을 일시정지하지 마세요. 원시 데이터 내보내기 후에는 이미지 처리와 정량적 분석이 일시 중지될 수 있습니다. ND2 파일, TIFF 분석 파일, ROI 파일, 메타데이터, CSV 측정 테이블을 백업된 아카이브에 저장합니다. 레이저 출력, 검출기 설정, 영상 깊이, 동물 식별, 치료 할당, 배제 결정 등을 각 영상 세션마다 기록합니다.

결과

성공적인 준비는 종방향 영상 촬영에 적합한 투명하고 기계적으로 안정적인 두개골 창을 생성합니다. 그림 1A 는 마취 및 두개골 노출부터 두개술, 커버슬립 삽입, 헤드플레이트 고정, 수술 후 회복에 이르기까지의 절차적 과정을 요약합니다. 그림 1B 는 주요 수술 단계의 대표적인 연속 사진을 보여줍니다. 영상 촬영에 적합한 창은 명확한 광로, 눈에 띄는 피질 혈관, 온전한 경막, 최소한의 잔류 혈액, 커버슬립 아래에 접착제가 없고, 커버슬립이 두개골 가장자리와 평면을 맞추는 것을 보입니다. 반면, 효과가 없는 제제는 뚜렷한 불투명성, 갇힌 기포, 지속적인 출혈, 염증성 이물질, 감염, 뼈 재성장, 창문 이동, 또는 광학 접근성 저하를 보여 정량적 영상 검사 전에 배제해야 합니다. 지속적인 창 불안정성, 피질 혈관 시각화 장애 또는 이미지 품질을 저하시키는 기타 특징을...

토론

이 프로토콜은 생체 내에서 뇌 내피 NAD⁺ 대사를 모니터링하는 종단 간 워크플로우를 제공합니다. 성공의 주요 결정 요인은 다음과 같습니다: (i) 창문의 투명도와 안정성, 즉 열 손상 최소화 및 시추 중 출혈 제어; (ii) 적절한 AAV 캡시드, 프로모터, 용량 및 발현 간격 선택을 통해 내피 특이성과 적절한 센서 발현이 달성됨; 그리고 (iii) 특히 종단 비교를 수행할 때 일관된 영상 및 분석 환경. 혈관 내 TMR–덱스트란 채널은 혈관 선택, 드리프트 교정 및 정규화 전략을 지원하는 견고한 혈관-내강 기준을 제공합니다. AAV 캡시드 트로피, 프로모터 활성, 용량, 주사 경로, 조직 상태가 전도 효율과 세포 표적에 영향을 미치므로, 각 실험 시리즈에서 내피 특이성을 검증해야 합니다. 이용 가능한 경우, AAV-X1.1-Cdh5-EGFP 대조 벡터를 보고자로 사용하여 내피 표적, 혈관 제한, 오프타겟 발현을 평가할 수 있으며,...

재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	주의: 독성/유해 화학 물질. 두개골 창 수술용 Avertin 마취 용액 준비에 사용. 일반적인 작업 용액: 1.25% (12.5 mg/mL), 복강 내 투여 200–250 mg/kg.
2-Methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	주의: 독성/유해 화학 물질. 농축 Avertin 스톡 용액 준비용 용매. 빛으로부터 보호하고 침전 또는 변색이 나타나는 준비물은 버립니다.
흡수성 면봉	Winner Medical	멸균 의료용 면봉	출혈 정지, 두개골 건조, 관수, 수술 현장 유지에 사용.
AAV-X1.1-Cdh5-cytoplasmic NAD+ biosensor-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; Addgene 플라스미드 소스	GeneChem construct GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	AAV-X1.1에 포장된 내피 타겟팅 NAD+ 바이오센서. 발현 캐세드: Cdh5 프로모터–cytoplasmic NAD+ 바이오센서–SV40 poly(A). 대표적인 주입 용량: 2 × 10¹² vg/마우스. -80 °C에서 알리쿼트를 저장하고 반복적인 동결-해동 주기를 피합니다. 로트별 qPCR 타이터, 배치 번호, 플라스미드 맵, 서열 검증 및 분석 인증서를 기록합니다.
진통제 (부프레노르핀 염산염)	MCE	HY-B0071	수술 전후 진통. 대표적인 용량: 0.05–0.1 mg/kg 피하 투여, 8–12시간마다 24–48시간 동안.
마취 공급 시스템	RWD Life Science	R500 with R580 vaporizer	이미징 중 이소플루란 공급에 사용. 일반적인 산소 흐름: 0.5–1.0 L/min.
마취제 (이소플루란)	RWD Life Science	R510-22 시리즈	이미징 마취에 사용. 일반적인 설정: 3–4% 유도 및 1–2% 유지.
커버슬라이드	주문 제작	카탈로그 번호 없음	3 × 3 mm 두개골 창을 완전히 덮고 두개골 림에 평평하게 놓이는 멸균 No. 1.5 유리 커버슬라이드.
치과용 시멘트/접착제	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	두개골 창 밀봉 및 티타늄 헤드플레이트 고정에 사용. 대표적인 준비: 1스쿱 파우더, 1방울 촉매 및 4방울 모노머. 실온에서 약 5–10분 동안 경화합니다.
치과용 드릴	RWD Life Science	78001 microdrill	두개골 얇게 만들기 및 개두술에 사용되는 고속 드릴. 최대 속도의 약 절반을 사용하고 삼투압 식염수로 잦은 냉각.
소독액	Winner Medical	포비돈-아이오딘/아이오도포어 및 70% 에탄올	수술 전 두피 준비에 사용. 교대로 소독제를 세 번 적용합니다.
미세 포셉	JZ 브랜드	JD1050/JD1070	골막 제거, 조직 조작 및 골판 들어올리기에 사용.
경구 주사 바늘	RWD Life Science	20G, 38 mm, 볼 팁	구강 내 NMN 투여에 사용.
헤드플레이트	주문 제작	카탈로그 번호 없음	이미징 홀더와 호환되는 약 10 mm 중앙 개구부가 있는 티타늄 헤드플레이트.
발열 패드/체온 조절기	RWD Life Science	69020 with 69023 패드	수술 및 이미징 중 체온을 약 36.5–37.5 °C로 유지하는 데 사용.
이미지 획득 소프트웨어