MCID 전략과 DNA 마커를 이용한 61종의 오일차(Camellia oleifera abel) 품종에 대한 효율적인 식별 기법

요약

이 연구는 무작위 증폭 다형성 DNA(RAPD) 띠 패턴에서 도출된 수동 품종 식별 다이어그램(MCID)을 사용하여 61종의 Camellia oleifera Abel 품종을 유전자원 활용과 오일차 품종 식별을 위해 효율적이고 재현 가능하게 식별하였습니다.

초록

유전자자원 평가와 Ot 품종 보호 메커니즘 평가를 위해 Camellia oleifera Abel [오일티(Ot)] 유전자자원 물질과 품종을 식별하는 것이 매우 중요합니다. 이 연구는 최적화된 RAPD 기법을 사용하여 RAPD 프라이머 길이를 늘리고 PCR 어닐링 온도를 스크리닝하여 다양한 지역에서 61종의 Ot 품종을 확인하였습니다. 또한, 품종 식별을 위한 효율적인 RAPD 마커를 설계하기 위한 MCID가 개발되었습니다. 80개의 RAPD 임의 11-nt 프라이머 중에서 명확한 다형성 밴드(PB)를 생성하는 10개의 프라이머가 PCR 분석에 사용되었습니다. 더불어, MCID 전략을 사용해 10개의 프라이머에서 DNA 지문에서 관찰된 PBs를 바탕으로 61개 품종을 수동으로 구별하여 Ot 품종 식별도(Ot-CID)를 생성했습니다. 이 Ot-CID는 각 품종을 개별적으로 표시하며, 품종 식별을 위해 PB를 사용했고, 적절한 프라이머는 Ot-CID에 정확하게 배치되었습니다. MCID 전략은 DNA 마커를 이용한 식물 식별에 있어 간단하고 실용적인 접근법을 제공합니다. 더 나아가, 이 접근법은 품종 식별에 실용적이고 효율적인 방법을 제공합니다. 61개 Ot 품종의 Ot-CID는 RAPD 마커를 사용하여 Ot 변종을 효과적으로 구별하여, 묘목 산업에서 품종 권리 보호와 초기 묘목 식별을 위한 품종 구분을 용이하게 했습니다.

서론

카멜리아 올레이페라 아벨 [오일차(Ot)] 나무^{는 세계에서 가장} 중요한 목본성 식용 오일 나무 종 중 하나입니다. 중국은 오토르의 기원과 다양성의 중심지로 여겨지며, 풍부한 유전 자원을 보유하고 있습니다². 오트(Ot), 영양 번식, 다양한 글로벌 육종 프로그램의 고대 전통은 수많은 품종의 출현을 이끌어^{냈습니다.} Ot 문화의 전 세계적 광범위한 재배로 인해 동음이의어(같은 이름을 가진 별개의 품종)와 동의어(이름이 하나 이상의 품종)가 생겨^{났습니다.} 따라서 다양한 Ot 유전자원을 관리하고 다양한 품종을 정확히 구별하는 기술을 개발하는 것이 매우 ^{중요합니다.}

DNA 기반 분자 표지체가 품종 특성 분석, 유전학 연구, Ot 식별에 적용되어 유전적 다양성을 밝히고 식물 개체를 구분할 수 있음에도 불구하고, 상당수의 Ot 품종을 성공적으로 확인하거나 품종 분화에 신뢰할 수 있는 근거를 제공한 연구는 없었습니다 ^6,7,8,9. 신뢰할 수 있는 방법의 부재가 식물 작물 식별에서 DNA 마커 적용의 주요 한계입니다. 이는 DNA 지문에 사용되는 분석 기법이 식별이 필요한 품종을 구별하는 프라이머와 다형성 마커를 명확히 구분하는 중요한 정보를 제공하지 못하기 때문일 수 있습니다. DNA 밴딩 패턴에 대한 분석 기법(클러스터 분석이라 불림)은 품종이나 종을 효과적으로 구별하는 데 적합하지 않습니다.

200개 이상의 Ot 품종에 대해 SNP^마커 2,3,10,11을 사용하여 DNA 분자 식별 카드(ID)가 개발되었지만, 여전히 몇 가지 도전 과제가 존재합니다: (1) Ot 게놈은 복잡하며, 재배된 동백나무의 대다수는 육배체이고, DNA 분자 ID를 구성하는 데 사용되는 참조 게놈은 삼배체로 구성되어 있어 일부 부정확성이 발생할 수 있습니다 3 . (2) 전체 유전체 시퀀싱은 비용이 많이 들며, 특히 시설이 제한된 실험실에서는 대규모 변이 분석에 널리 적용되기 어렵습니다. 더불어, PCR 증폭 생성물은 시퀀싱이나 형광 검출이 필요하여 프로세스¹²를 더욱 복잡하게 만듭니다. (3) 새로운 변종에 대한 구별 마커가 없을 때, 새로운 마커 프라이머를 개발해야 하며, 이는 기존 유형에 대한 신분증 코드 재코딩을 요구합니다. 이로 인해 코드 위치가 너무 많아져 다양성 차별화의 효과가 떨어집니다. 따라서 Ot 묘목 부문, 농업 사업, 식물 특허 보호, 유^{전자 자원의} 보전 및 평가를 위해 Ot 품종을 쉽고 신뢰할 수 있으며 참조 가능하고 실용적인 검증을 제공하는 기법을 사용하는 것이 필수적입니다.

전통적인 품종 식별 전략은 형태학적, 생리학적, 농학적 특성에 의존했으나, 이러한 특성들은 환경 영향에 취약하며 완전히 발달한 식물에 대한 포괄적인 평가가 필요하므로 한계가 있다^13,14. 더불어, 분자 마커는 환경 변수의 영향을 받지 않아 품종의 정확한 특성 분석에 효율적인 도구가 된다는 뚜렷한 장점이 ^{있습니다.} 최근에는 지문 인식, 유전 다양성, 품종, 순도^{16, 17, 18, 19, 20, 21, 22}를 평가하기 위한 다양한 DNA 기반 지수가 설정되었습니다. RAPD 마커는 단순함, 효율성, 그리고 이전 서열 데이터가 필요 없기 때문에 품종 분석에 유리하다^23,24. RAPD 접근법은 식물 지문 인식에 적용하기 위해 11-뉴클레오타이드(nt) 프라이머와 지정된 PCR 어닐링 온도를 선택하여 개선할 수 있어, 식물 품종 식별 및 유전적 다양성 평가에 있어 RAPD가 선호되는 방법으로 자리매김합니다^25,26. 이 마커들은 살구²⁷, 관상복숭아²⁸, 석류²⁹, 육지종²⁰, 호두나무³⁰ 등 다양한 식물 종의 작물 분화 및 유전적 상관 연구에 광범위하게 활용되었습니다(Çilesiz et al., 2025). 널리 사용되고 있음에도 불구하고, 많은 DNA 마커 기반 접근법은 일상적인 식물 품종 식별에 충분히 실용적이거나 간소화되지 못합니다.

따라서 본 연구는 다양한 Ot 품종의 재현 가능한 동정을 위한 새로운 분석 기법을 활용하였습니다. RAPD 밴딩 패턴에서 도출된 MCID는 유전 자원 활용과 품종 식별을 위해 61개의 Ot 품종을 구분했습니다.

여기서 설명된 RAPD-MCID 전략(그림 1)은 표준 PCR 및 겔 전기영동 인프라를 갖춘 실험실에서 소규모에서 중규모 유전자원 특성 분석에 가장 적합하지만 시퀀싱 시설에 대한 접근이 제한적입니다. 또한 더 상세한 유전 분석 전에 빠르고 비용 효율적인 예비 선별에 적합합니다. 이 방법의 주요 운영 한계는 우성 마커에 의존한다는 점과 실험실 간 재현성을 보장하기 위한 PCR 조건의 신중한 표준화가 필요하다는 점입니다. 대규모 유전자원 은행이나 법적 품종 등록의 경우, SSR이나 SNP와 같은 공동 우성 마커의 보완적 사용을 권장합니다.

프로토콜

1. 식물 재료

1. 안후이성 수청현 국립동백유전자 저장소에서 각 오일차 품종의 건강하고 활발히 자라는 새순에서 어린 잎을 채취하세요.
2. 이 품종들의 이름과 기원은 표 1 을 참조하십시오.

2. 유전체 DNA 추출

1. 제조사의 지침에 따라 식물 DNA 추출 키트를 사용해 전체 유전체 DNA를 추출하세요.
2. DNA는 1× TE 버퍼로 용출되었습니다. 용출 후에는 추출한 DNA 용액이 투명하고 무색으로 보이는지 확인하세요. 마이크로볼륨 분광광도계를 사용해 DNA 농도를 측정합니다.
3. 1× TE 완충액을 사용해 DNA 농도를 30 ng·^μL-1 로 조절하고, 조정된 DNA 용액을 -20 °C에 보관합니다.

3. RAPD 프라이머 선택

1. RAPD 분석을 위한 80개의 무작위 프라이머를 개발하고 몇 가지 유전자형을 사용해 분석합니다. 모든 검사된 유전자형에서 명확하고 명확한 밴딩 패턴을 보이는 11-nt RAPD 프라이머를 선택하세요.
2. 증폭된 조각의 신뢰성을 높이기 위해 선택된 프라이머를 유전자형 분석에 사용하세요. 표 2에 나열된 대로 재현 가능한 밴드를 가진 잘 해명된 프라이머 10개를 선택하여 추가 분석에 참여합니다.

4. 무작위 증폭 다형성 DNA(RAPD) PCR

1. 증폭 반응을 준비하려면 앞서 설명한 방법을 약간 수정하여²³. 표 S1에 나열된 조성에 따라 반응액을 준비합니다.
2. 다음 조건에서 열 사이클러를 사용하여 PCR을 수행: 94 °C에서 5분간 사전 변성; 94 °C에서 30초 동안 변성, 표 2에 적힌 최적화 온도에서 1분간 어닐링, 72 °C에서 2분간 팽창 42회 사이클; 그리고 72°C에서 10분간 마지막 연장이 있습니다.

5. PCR 산물의 검출 및 분석

1. 증폭된 DNA 조각을 100V 겔 전기영동으로 1.3% 아가로스(w/v)에서 1.3% 아가로스(w/v)로 1× TAE 버퍼(0.001 M EDTA와 0.04 M 트리스-아세테이트를 포함)에서 pH 8.0에서 분리합니다. 0.5 μg·^μL-1에서 에티듐 브로마이드로 젤을 염색합니다.
   주의: 에시듐 브로마이드는 강력한 돌연변이 유발 물질입니다. 에티듐 브로마이드 용액이나 염색된 젤을 다룰 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
2. 젤을 100V 일정 전압으로 45–60분 동안 또는 브로모페놀 블루 염료 전면이 젤 길이의 약 3분의 2까지 이동할 때까지 작동시킵니다. 염색 및 염색 제거 후, 젤을 자외선 투광 하에서 관찰합니다.
   참고: 자외선 투사(UV) 조명 하에서 뚜렷한 DNA 밴드가 명확히 보이는지 확인하세요. DNA 사다리에 100 bp에서 2,000 bp 사이의 뚜렷하고 잘 분리된 띠가 있는지 확인하세요.
3. 자외선 아래에서 품종의 다형성 띠(PB)를 기록합니다.
4. 재현성을 보장하기 위해 각 PCR 증폭을 3회 단위로 수행하세요. 세 개의 독립 복제 모두에서 일관되게 존재하거나 없는 밴드만 점수를 채점하여 하위 분석을 수행합니다. 복제 간 밴드 점수 일치율이 95%를 넘는지 확인하세요.

6. 데이터 분석

1. 품종 식별을 위해 모든 품종에서 명확히 보이는 띠에는 "+ o"를, 해당 분자 크기 위치에 있는 부재 띠에는 "−"를 할당하여 채점합니다. 세 개의 독립 복제에서 일관되게 관찰되는 밴드만 포함하세요.
2. 단일 프라이머로 생성된 지문에서 뚜렷한 띠가 있는 품종을 독립적으로 분류합니다. 동일한 띠 무늬를 가진 품종을 같은 하위 그룹으로 분류합니다. 이 기준에 따라 모든 오일티 품종을 점진적이고 완전하게 구별하세요.

7. 품종 식별에 있어 도표의 적용 및 효율성

1. 61개 오일차 품종을 보여주는 도표의 적용 가능성과 기능을 검증하기 위해 그룹 내 및 그룹 간 품종 중 무작위로 두 군을 선택한다. 소프트웨어 없이 Ot-CID 다이어그램의 여러 분기를 참조하여 수동으로 선택을 수행합니다.
   참고: 61개 Ot 품종을 보여주는 도표의 적용 가능성과 기능을 검증하기 위해 2개의 Ot 품종 그룹을 무작위로 선정했습니다.
2. 선택된 두 그룹을 "A"와 "B"로 지정하세요. 각 그룹의 관련 입문서는 Ot-CID에서 선별하세요.

8. 유해 폐기물 처리 지침

1. 지정된 구역에서 모든 에티듐 브로마이드 용액을 준비하고 처리하세요. 에티듐 브로마이드 오염된 고형 폐기물 및 액체 폐기물을 기관 유해 폐기물 지침에 따라 별도로 수집하여 폐기하십시오.
2. 에티듐 브로마이드 오염 물질은 지정된 유해 폐기물 용기에 폐기하십시오. 확실하지 않은 경우 승인된 폐기 절차를 위해 기관 환경 보건 및 안전 사무소에 문의하십시오.

결과

여기 제시된 대표 결과는 초기 프라이머 스크리닝부터 계층적 품종 선별, 최종 검증에 이르기까지 RAPD-MCID 전략의 전체 워크플로우를 보여줍니다. 단계적 분별 과정은 그림 2, 그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6에 문서화되어 있으며, 이 모든 과정은 제한된 10개의 RAPD 프라이머가 61종의 오일티 품종을 고유한 정체성으로 분리할 수 있음을 보여줍니다. 그림 2와 3

토론

DNA 마커는 식물 품종과 종을 식별하는 데 사용되는 강력한^{도구입니다.} 이 마커들은 유전 분석, 품종 식별 등과 관련된 수천 건의 연구에서 개발되고 사용되었습니다; 그러나 유전체^{형 분석에} 쉽지도 않고 널리 사용되지도 ^{않습니다.} 이는 DNA 마커를 이용해 품종 식별, 계통수, 지문 분석에 효율적이고 쉬운 방법이 부족하기 때문입니다. 분자 ID나 DNA 바코드 개발을 위해 DNA 마커를 사용하면 다양한 품종^데이터를 인코딩할 수 있지만^, 복잡한 부호화, 제한된 검색 효율성, 어려운 운영, 높은 비용 등으로 인해 광범위하고 쉬운 품종 식별에는 적합하...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
원심분리기	Eppendorf, 독일	5427R	기름 나무 잎에서 게놈 DNA 추출에 사용
Hi-DNAsecure Plant Kit	Tiangen, 중국	DP350	기름 나무 잎에서 게놈 DNA 추출에 사용
PCR 유전자 증폭 기기	Monad, 중국	MP60901	PCR 증폭에 사용
SolarRed Agarose LE	Solarbio, 중국	A8202	PCR 단편 전기영동에 사용
TAE	Tsingke, 중국	TSG001	PCR 단편 전기영동에 사용
TaKaRa Ex Taq	Takara, 일본	RR001A	PCR 증폭에 사용
Thermo Scientific NanoDrop 2000C 분광 광도계	ABI, 미국		RNA 농도 결정에 사용