간접 자기 구슬 전략을 이용한 포도플라닌 양성 중간엽 줄기세포 아군의 분리 및 검증

요약

이 프로토콜은 피코에리트린(PE) 표지된 유세포검사 항체와 항PE 미생물구슬을 이용한 자기 구슬 기반 분류 방법을 설명하며, 고가의 세포 분류기나 표적 특이적 맞춤 구슬 없이 고가의 세포 분류기나 표적 맞춤형 비드 없이 고가의 세포 분류기나 표적 특이적 비드 없이 높은 사후 표적 표적 양성률을 가진 특정 중간엽 줄기세포 아군을 분리합니다.

초록

중간엽 줄기세포의 기능적 이질성 연구는 특정 하위 집단(예: 포도플라닌(PDPN) 양성 세포)의 효율적인 분리에 의존합니다. 그러나 대부분의 막 단백질 표적에 대해, 분류용 직접 이용 가능한 상업용 자기 구슬은 제한적입니다. 이를 해결하기 위해 우리 연구실은 "피코에리트린(PE) 표지된 유세포 항체/항PE 자기 구슬"의 간접 결합 원리에 기반한 표준화된 자기 구슬 분류 프로토콜을 확립하고 시험하였습니다. PDPN 양성 세포를 모델 표적 집단으로 사용하여 이 프로토콜은 값비싼 유세포 세포 분류기에 의존하지 않고 표적 세포 분획을 농축합니다.

연구자들은 접근 가능한 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 호환 가능한 PE 표지 유세포분석 항체를 사용하고, 이를 상업적으로 구할 수 있는 항PE 마이크로비즈와 결합하여 표적 특이적 최적화 후 선택된 표적에 대한 분류 워크플로우를 구축할 수 있습니다. 이 방법은 각 새로운 목표물에 맞는 맞춤형 자기 비즈를 맞춤 제작하거나 주문하는 데 드는 긴 리드 타임과 높은 비용을 피하여, 희귀하거나 연구가 부족한 표면 마커에 특히 적합합니다. 여기서 테스트된 PDPN 모델 시스템에서는 이 프로토콜이 분류되지 않은 MSC에 비해 높은 PDPN 양성률과 CCK-8 기반 증식/대사 활성을 유지하여 표적 하위 집단의 농축을 가능하게 했습니다.

서론

정형외과 분야에서는 연골 손상과 반월판의 무혈구대(흰색 영역)에 생긴 병변과 같은 손상이 종종 돌이킬 수 없는 관절 파괴와 기능 상실을 초래하며, 궁극적으로 골관절염으로 이어집니다. 이는 주로 이 조직들의 재생 능력이 낮기 때문인데, 이는 직접적인 혈액과 림프 공급의 부족으로 인한 것과, 증식 및 이동 능력이 제한된 고분화된 세포의 존재 때문이다 1,2,3,4. 이 문제를 해결하기 위해 엑소좀 ^5,6, 자가적 또는 동종 연골 이식 ^7,8, 조직 공학 접근법 ^9,10,11,12 등 다양한 임상 전략이 탐구되었습니다. 최근 몇 년간 중간엽 줄기세포(MSC)는 다계통 분화 가능성과 면역조절 특성 덕분에 재생 수리의 유망한 세포원으로 부상하여 연골 재생에 새로운 희망을 제시하고 있습니다 13,14,15,16.

치료적 잠재력이 있음에도 불구하고, MSC는 상당한 이질성을 보입니다. 골수나 탯줄과 같은 단일 조직원에서도 MSC의 뚜렷한 하위 집단은 증식 능력, 다계통 분화 가능성(특히 연골성 분화), 생체 내 재생 기능 등에서 상당한 변동성을 보일 수 있습니다 17,18,19. 따라서 연골성 능력이 향상된 기능적으로 정의된 MSC 아집단의 정확한 식별과 분리는 이들의 생물학적 특성에 대한 이해를 진전시키고 연골 수리의 효능을 향상시키는 데 필수적입니다. 이는 우리 연구에서 중요한 단계입니다.

연구가 진행됨에 따라 기능적으로 구별되는 MSC 아군집단의 표지자로 점점 더 많은 새로운 막 단백질이 확인되고 있습니다. 하지만 이러한 발견을 효과적인 세포 분류 전략으로 전환하는 것은 기술적으로 여전히 도전적입니다. 기존의 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 강력하지만 전문 장비와 기술 전문성이 필요해 많은 실험실에서 접근성이 제한됩니다. 반면, 면역자기 세포 분류법은 더 널리 사용되긴 하지만, 주로 몇몇 잘 확립된 막 표적을 위해 설계된 상업용 시약의 제한된 가용성에 의해 제약을 받습니다. 따라서 잠재적 생물학적 의미를 가진 많은 새로 발견된 마커에 대해 상업적으로 구할 수 있는 자기 구슬이 없어 이 귀중한 MSC 아집단을 특이적으로 풍부하게 하는 것이 어렵습니다.

이 한계를 극복하기 위해 본 연구는 긍정적 세포 선택을 위한 유연하고 비용 효율적이며 효율적인 프로토콜을 확립하고 표준화하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법은 상업적으로 이용 가능한 피코에리트린(PE) 결합 항체와 항PE면역자기 구슬의 간접 접합에 기반합니다. 이전 보고서들은 포도플라닌 양성(PDPN⁺) MSC가 ^PDPN 대응 MSC에 비해 더 우수한 줄기 유지 및 분화 능력을 보인다는 것을 보여주었다²⁰. 더욱이, PDPN⁺ MSC가 연골 재생과 골관절염(OA) 진행에 관여한다는 사실이 문헌에 문서화되어 있습니다^21,22. 최근 확인된 기능성 MSC 하위 집단의 후보 마커인 포도플라닌(PDPN)을 모델 타깃으로 사용하여 골수 유래 MSC에서 PDPN 양성 세포를 분리했습니다. 단세포 현탁액 준비, 항체 및 자기 비드 표지, 자기 분리를 포함한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 또한, 선별된 세포의 수율, 분리 후 PDPN 양성성, CCK-8 기반 증식/대사 활성도 평가합니다. 이 프로토콜을 표준화함으로써, 우리는 연구자들에게 접근 가능한 세포 표면 마커에 대해 호환 가능한 항체를 이용해 표적 세포 아집단을 분리할 수 있는 다재다능하고 접근성 높은 방법을 제공하고, 이를 통해 기초 줄기세포 연구와 재생 의학에서의 미래 중개 응용을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

인간 골수에서 유래한 MSC는 상업적으로 얻어졌습니다(재료 표 참조). 공급자는 CD73, CD90, CD105의 양성 발현으로 MSC 동일성을 확인했으며; CD34, CD45, HLA-DR의 음성 발현; 그리고 삼계통 분화 잠재력. 세포는 배양 중 증식되어 3번부터 5번까지의 통로에 사용되었습니다. 모든 인간 유래 세포 연구는 멸균 조건의 Class II 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되었습니다. 세포가 상업적으로 획득되었고 이 프로토콜에서는 인간 대상자를 직접 모집하거나 샘플링하지 않았기 때문에 직접적인 IRB 승인이 필요하지 않았습니다.

1. 단일 셀 현탁 준비

참고: 단일 셀 현탁 장치의 품질은 분류 효율에 직접적인 영향을 미칩니다. 세포가 잘 분산되어 있고, 생존력이 높으며, 덩어리가 없는지 확인하세요. 눈에 보이는 덩어리는 반복적으로 부드럽게 피펫팅하여 보이지 않을 때까지 분산시켜야 합니다.

1. 80–90% 합류에 도달한 MSC(3–5 통로)를 선택하세요. 배양 매체는 버리세요.
2. 예열된 PBS 2× 10mL로 세포를 세척하세요. 용기를 부드럽게 흔들고 PBS를 버리세요.
3. 0.25% 트립신-EDTA 2mL를 추가하고 37°C에서 3–5분간 배양합니다. 세포가 모여 떨어져 나올 때까지 현미경으로 관찰하세요.
4. 트립신을 중화시키기 위해 16.5% FBS가 포함된 배양지 4mL를 첨가합니다(재료 표 참조). 세포를 부드럽게 피펫으로 제거하여 완전히 분리되도록 하세요. 세포 현탁액을 15mL 원심분리관으로 옮깁니다.
   참고: 모든 세포가 채취되었는지 현미경 아래에서 확인하세요.
5. 300 g × 원심분리기를 3분간 하고 상원액을 버립니다.
6. 세포 펠릿을 1 mL의 버퍼에 재현탁하세요( 재료표 참조). 세포 세기로 넘어가세요.

2. 세포 계수 및 농도 조절

참고: 총 세포 수가 1 × 10⁷ 미만이라면, 표지 효율을 위해 표준 부피× 10^{7 세포 부} 피에 따라 항체와 자기 시약을 추가하세요.

1. 세포 현탁액을 다시 300 × g에서 3분간 원심분리한 후 상원액을 버리세요.
2. 세포를 버퍼에 재현탁하여 1 ×^{10 8} 세포/mL의 밀도를 달성합니다.
   참고: 예를 들어, 10×⁷ 개의 셀을 처리할 때는 펠릿을 100 μL 버퍼에 재현탁하세요.
3. 세포 현탁액을 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다.

3. 항체 표지

1. ×10^7셀당 10 μL 감마 RII 차단제(재료표 참조)를 첨가합니다. 부드럽게 섞고 실온에서 10분간 배양하세요.
2. 제조사 권장 농도에 따라 1×^{10 7}개 세포당 5μL PE 결합 항인간 PDPN 항체(재료표 참조)를 첨가합니다. 부드럽게 섞어 실온에서 15–20분간 배양시키고, 빛을 차단하세요.
   참고: 항체 부피는 제품 간 농도가 다를 수 있으므로 사용되는 특정 유세포 항체의 데이터시트에 따라 조절해야 합니다.

4. 자기 비드 라벨링

참고: 사용 전 모든 시약을 얼음에 보관하고, 첨가 후 즉시 얼음에 넣어 활성과 일관성을 유지하세요.

1. 10^{× 7} 셀당 10 μL 선택 칵테일을 추가합니다(재료 표 참조). 부드럽게 섞고 실온에서 15분간 배큐하세요.
2. 1×^{10 7} 셀당 5μL의 자기 비즈를 추가합니다( 재료표 참조). 부드럽게 섞고 실온에서 10분간 배양하세요.
   참고: 사용 전 30초 동안 자기 구슬을 강력히 보틀링하여 고르게 분산되도록 하세요.

5. 자기 분리

1. 라벨이 붙은 셀 샘플이 담긴 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브를 자기 분리 스탠드에 놓으세요( 재료표 참조).
2. 튜브에 완충제를 추가하여 총 부피를 2.5–3 mL로 만듭니다. 실온에서 5분간 배양하세요.
3. 분리 작업: 자석과 튜브를 하나의 단위로 붙잡고, 뒤집어 상원액을 새로운 수집관에 부어줍니다. 이 수집된 분획에는 PDPN 음성 세포가 포함되어 있습니다; 이 튜브는 얼음 위에 보관해.
   참고: 이 단계에서 튜브를 자기 스탠드에서 분리하지 마세요. 분리가 방해되어 절차가 실패할 수 있습니다.
4. 5.1–5.3단계를 3번 반복합니다. 매번 자석 내 원래 튜브에 완충제를 넣고 5분간 기다린 후 5.4단계에서 사용한 음분획 수집관에 상청액을 부어줍니다.
5. 최종 세척 후에는 자기적으로 결합된 셀이 담긴 튜브를 스탠드에서 분리합니다. 이 튜브에는 PDPN 양성 세포 분획이 들어 있습니다.
6. 양성 세포를 재현탁하기 위해 3mL의 완충제를 추가하세요. 이 현탁액을 새로 라벨이 붙은 튜브(양분획관)로 옮기세요.

6. 표적 세포의 수집, 배양 및 검증

1. 양극과 음성의 세포 양을 모두 세어보세요. 각 분획마다 셀 수율을 기록하세요.
2. 양분율 셀 현탁액을 300 × g 에서 3분간 원심분리합니다. 상원액은 버리세요.
3. 세포 펠릿을 16.5% FBS를 포함한 MEM 알파 배양 배지에 재현탁합니다. 필요에 따라 세포 밀도를 조절하고 세포를 배양 배지 또는 플라스크에 씨앗 채우세요.
4. 세포를 37°C에서 5% CO₂ 배양기에서 배양하세요.

7. 순도 및 기능 검증을 위한 샘플 준비

1. 세포를 세어 100mm 배양 접시에 3× 10^{6개의 세포} 밀도를 12mL 배양지에 씨앗 채웁니다. 씨앗 후 24시간 후에 세포 부착 상태를 관찰하세요. 배양지를 새 배지로 교체하여 잔여 자기 구슬과 비부착 세포를 제거합니다.
2. 트립신 추출로 세포를 채취하세요. 부드럽게 위아래로 10–15번 피펫을 움직여 자기 구슬과 잔류 항체를 제거하고 제거합니다.
3. 유세포검사를 통해 PDPN-PE 양성 세포의 비율을 평가하세요(자세한 프로토콜은 보충 문서 1 참조).
4. 로그 성장 단계에서 세포를 수집하세요. 96웰 플레이트에 씨를 뿌려. 서로 다른 시점(0시, 24시, 48시, 72시)에 CCK-8 시약을 첨가하고 제조사 지침에 따라 흡광도를 측정합니다. 데이터를 바탕으로 확산 곡선을 그려보세요.

결과

실험의 전체 원리와 작업 흐름은 그림 1에 나와 있습니다. 이후 모든 실험 데이터는 5번 퍼시지 세포를 기반으로 합니다. 자기 분리 후, 얻은 PDPN⁺ 세포는 24–48시간 배양되었다. 배양지를 교체하여 비부착 세포와 잠재적 잔류 자기 구슬을 제거한 후(그림 2A), 분류 효율과 세포 수율을 평가했습니다. 초기 개체군 1× 10⁷ MSC로 시작하여, Fc 수용체 차단, 항체 표지 및 자기 분리 후 PDPN⁺ 분획은 3.5 ± 0.21 × 10⁶, PDPN^- 분획은 6.4 ± 0.15 × 10⁶이었다(그림 2B).

...

토론

본 연구에서는 골수 유래 MSC에서 PDPN+ 세포를 분리하기 위한 자기 구슬 기반 프로토콜을 확립하였습니다. 이 접근법은 PDPN 양성 아집단의 효율적인 농축을 가능하게 하면서도 시험 조건 하에서 CCK-8 기반 증식/대사 활성을 유지할 수 있습니다.

기존의 직접 면역자기 분류 방법과 비교할 때, 이 전략의 가장 큰 장점은 그 유연성에 있습니다. 전통적인 방법은 관심²³의 새로운 마커마다 특정 자기 구슬을 개발하거나 맞춤화해야 하며, 이는 시간과 비용이 많이 듭니다. 반면, 이 방법은 상업적으로 이용 가능한 PE 접합 항체(대부분 실험실에서 흔히 사용되는 시약)를 활용하여 연구자들이 표적 특이적 최적화 후 선택된 표면 표적에 대한 분류 워크플로우를 구축할 수 있게 합니다. 이러한 유연성은 프로토콜이 PDPN뿐만 아니라 MSC의 다른 표면 마커(예: CD146, CD90, CD...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
7-AAD 세포 생존성 분석 키트	KeyGEN	KGD1202-50
인간 CD32 차단제(Fc 감마 RII 차단제)	STEMCELL Technologies	18520
버퍼	STEMCELL Technologies	20104	버퍼
CCK-8	Meilunbio	MA0218-5
덱스트란 자기 입자	STEMCELL Technologies	50100	자기 입자
태아 우 혈청	Gibco	16050-122
자석	STEMCELL Technologies	18000	자기 분리 스탠드
MEM Alpha 미디엄	Gibco	C12571500BT	MEM Alpha 미디엄(82.5%) + FBS(16.5%) + 페니실린-스트렙토마이신(1.0%)
MSCs	KeyGEN	KGG5575-1	인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포
PE-결합 인간 PDPN 항체	ABclonal	A26770	PDPN-PE
PE 선택 칵테일	STEMCELL Technologies	18151	선택 칵테일
페니실린-스트렙토마이신	Gibco	15140122
트립신-EDTA	Gibco	25200-072