키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

요약

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

초록

자연 살해자(NK) 세포는 다양한 세포 내 병원체와 암에 대한 보호 면역에 중요한 역할을 하는 선천적 림프구입니다. 이들의 주요 기능은 감염되었거나, 악성 변형되었거나, 항체에 의해 코팅된 표적 세포를 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 통해 죽이는 것입니다. NK 세포는 또한 특정 항원을 표적으로 인식할 수 있도록 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전공학적으로 조작될 수 있습니다. NK 세포 세포독성의 정량적 측정은 기초 기능 평가와 단클론 항체의 전임상 평가 및 CAR-공학 전략에 필수적입니다. 그러나 시험 관 내 기능 검사는 세포 준비, 표적 세포, 효과자 대 표적 비율, 공동 인큐베이션 시간, 측정 방법의 차이로 인해 실험실별로 매우 다양하여 재현성과 교차 연구 비교가 제한됩니다. 이 글은 유동 세포 분석과 실시간 생세포 영상을 이용한 NK 세포 세포독성의 정량 평가를 위한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 1차 인간 NK 세포와 CAR-발현 NK-92 세포를 96웰 플레이트 형식에서 암세포 및 항체 코팅 표적 세포를 죽이는 능력을 평가하여 자연 세포독성, CAR 매개 사멸, ADCC를 측정하였습니다. 표적 세포 생존율은 생세포 영상을 통해 연속적으로 측정하거나 유세포분석으로 정해진 시점에 측정되었으며, 이를 통해 NK 세포와 표적 세포의 표현형 특성도 확인할 수 있었습니다. 이 프로토콜들은 일상적인 조직 배양, 영상 및 유동세포검사 방법을 활용하여 선천면역 및 NK 세포 기반 면역치료 연구를 위한 NK-세포 효과기 기능의 재현 가능한 정량화를 가능하게 하는 견고한 틀을 제공합니다.

서론

자연 살해자(NK) 세포는 선천적 림프구로, 바이러스에 감염된 세포와 악성 세포에 대한 면역 감시에서 중심적인 역할을 하며, 빠르고 강력한^{세포독성을} 보입니다. B 세포와 T 세포와 달리, NK 세포는 항원 특이적 수용체를 발현하지 않으며, 주요 조직적합성 상실, 복합체 클래스 I 발현 또는 세포 스트레스 손실을 감지하기 위해 활성화 및 억제 수용체에 의존합니다. 이로 인해 퍼포린과 그랜자임을 포함한 세포독성 과립을 방출하거나, 경우에 따라 사망 수용체 ^1,2,3,4를 활성화하여 직접 세포독성을 매개할 수 있습니다. 자연 세포독성 외에도, NK 세포는 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 부분을 인식하고 IgG 코팅 표적 세포에 대해 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 매개하는 수용체인 FcγRIII(CD16)를 발현합니다 ^5,6.

내재성 세포독성 기전과 우수한 안전성 프로파일 덕분에 NK 세포는 세포 면역치료의 유망한 후보로 떠올랐습니다. 동종 사용 가능성이 있어 NK 세포는 이식편대 숙주 질환 위험을 최소화한 '기성품' 치료제로 기능할 수 있어 임상 적용 범위 확대와 비용 절감을 가능하게 합니다⁷. 최근 발전은 유전공학 전략을 통해 NK 세포의 치료 잠재력을 더욱 확장했으며, 여기에는 NK 세포를 특정 종양 항원을 인식하도록 유도하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 도입이 포함됩니다. CAR-NK 세포는 생체 내 이종이식 모델과 임상시험에서 항종양 효능을 입증했으며, CAR-T 세포에 비해 독성이 낮았습니다 ^8,9,10. 따라서 엔지니어링된 NK 세포 플랫폼과 항체 기반 치료 전략 개발에 대한 관심이 커지고 있습니다. 이러한 맥락에서 NK 세포 살상 능력의 정확하고 정량적인 측정은 NK 세포 생물학을 이해하고, CAR 또는 기타 설계된 NK 세포 치료제의 효능 평가, ADCC에 의존하는 단클론 항체 평가에 필수적입니다.

다양한 시험관 내 분석법이 NK-세포 세포독성을 평가하기 위해 실험실 전반에 걸쳐 널리 사용되고 있습니다. 일반적인 방법으로는 방사성 크롬-51 방출 분석, 락테이트 탈수소효소 방출 분석, 칼세인-아세톡시메틸 방출 분석법^{등이 있습니다 11,12}. 이러한 전통적인 방법들은 세포독성 측정에 널리 사용되어 왔지만, 간접적인 세포사사 측정에 의존하고, 동역학적 데이터가 아닌 종점 측정을 제공하며, 민감도와 동적 범위가 제한적입니다. 또한 이펙터 세포의 표현형이나 활성화 상태에 대한 정보도 제공하지 않습니다. 최근에는 표적세포 생존 직접적 정량화, 시간에 따른 죽음 모니터링, 효과자와 표적 세포의 동시 표현형 분석을 가능하게 하여 생세포 영상 플랫폼과 유세포 분석이 점점 더 많이 채택되고 있습니다^13,14. 그러나 이러한 새로운 접근법들 사이에서도 표적세포 준비, 효과자-표적(E:T) 비율, 공동 인큐베이션 시간 등 실험실과 발표된 연구들 간에 상당한 변동성이 존재하며, 이는 특히 NK 세포 기반 면역치료제의 전임상 평가에서 재현성과 교차 연구 비교에 제한이 있습니다.

본 글은 실시간 생세포 영상(IncuCyte SX5)과 유세포분석 기반 종말 분석이라는 두 가지 독립적이고 상호 보완적인 플랫폼을 사용하여 NK 세포 독성의 정량적 평가를 위한 표준화된 워크플로우를 제시합니다. 생세포 영상은 효과자 세포와의 공동 배양 중 표적 세포 생존을 지속적으로 모니터링할 수 있게 하여, 다양한 E:T 비율과 실험 조건에서 최소한의 분석법 조작으로 세포독성을 동역학적으로 평가할 수 있게 합니다¹⁵. 반면, 유세포분석은 표적세포 사사의 고민도 종말 측정을 제공하며, 다중 표지 염색 패널을 이용해 NK 세포와 표적 세포의 동시에 표현형 특성화를 수행합니다.

또한, 이 프로토콜은 E:T 비율, 배양 조건, 플레이트 형식, 분석 워크플로우 등 표준화된 실험 매개변수를 포함하여 재현성을 높이고 실험실 및 연구 간 세포독성 측정 비교를 용이하게 합니다. 이 워크플로우는 자연 세포독성, CAR 매개 살균, ADCC 등 여러 NK 효과기 기능을 정량적으로 평가할 수 있으며, 인간 1차 NK 세포 및 NK 세포주와 호환됩니다. 이 프로토콜은 NK 세포 생물학 연구와 NK 세포 기반 면역치료 개발의 전임상 평가를 위한 실용적 틀을 제공합니다.

프로토콜

연구를 위한 인간 기증자 샘플 사용은 기관 심사 위원회의 승인을 받았으며, 기관 지침에 따라 진행되었습니다(승인 #2022P000699).

1. 실시간 생세포 영상 살상 분석

1. 코트 플레이트
   1. 평평한 바닥 96웰 플레이트의 6× 10 그리드에 50 μL/웰 폴리-D-라이신(인산염 완충 생리식염수[PBS] 내 0.1 mg/mL)을 첨가합니다. 각 웰의 바닥이 완전히 덮이도록 플레이트를 부드럽게 흔들어 보세요.
   2. 플레이트를 뚜껑을 덮은 채 실온(RT; 18°C–26°C)에서 2시간 동안 부양합니다.
   3. 3× 웰을 200 μL/웰 PBS로 세척한 후 상원액을 버립니다.
      참고: 코팅된 플레이트는 파라필름으로 밀봉하여 4°C에서 최대 1주일간 보관할 수 있으며, 각 웰에 200 μL의 PBS를 첨가할 수 있습니다. 플레이트가 멸균 상태를 유지하고, PBS를 버린 후 RT와 균형을 맞출 때까지 기다려야 합니다.
2. 표적 세포 준비
   1. 2× SYTOX 오렌지 용액(200 nM)을 15mL 원뿔형 바닥 원심분리관 내에서 NK-92 배양 배지에 희석하여 200 nM 200 nM SYTOX 오렌지 10mL를 준비합니다(총 10 mL에 8 μL 스톡을 추가).
      참고: NK-92 세포의 배양 배지는 Advanced RPMI-1640 배지, 10% 태아 소 혈청(FBS), 2 mM L-알라닐-L-글루타민, 100 μg/mL 프리모신, 500 U/mL 인간 IL-2로 구성됩니다.
      주의: SYTOX 오렌지는 형광 염료이며 피부나 눈 노출 시 위험을 초래할 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 기관 안전 지침을 준수하여 다루십시오.
   2. 염료 배제 기반 세포 계수 방법(예: 트리판 블루) 또는 동등한 검증 방법(예: 자동 세포 카운터)을 사용하여 표적 세포를 개수합니다.
      참고: 이 검사에서 표적 세포는 Ramos 세포였으며, 이는 B세포 성숙 항원 발현(BCMA⁺) B세포 림프종 세포주로, 근적외선(NIR) 형광 단백질 emiRFP670을 발현하도록 설계했습니다.
   3. 필요한 양을 15mL 원뿔형 바닥 원심분리관에 옮깁니다.
   4. 원심분리기(5분, 300 × g, RT, 가속 = 최대; 감속 [브레이크] = 최대).
   5. 상원액은 버리세요.
   6. 표적 세포를 최종 농도인 2.5 ×^{10 5} cells/mL(2.5 × 10^{4 cells/} 100 μL)로 재현탁하여 2× SYTOX 오렌지 배지를 사용합니다.
      참고: 재현탁된 표적 세포는 이펙터 셀 희석액을 준비하는 동안 튜브 내 5% CO₂를 37°C에서 최대 30분간 유지할 수 있습니다.
      참고: 한 개의 완전한 플레이트의 경우, 60개의 웰이 × 2.5 × 10개의⁴ 셀/웰 = 1.5 × 총⁶ 개의 타겟 셀입니다. 손실을 고려하기 위해 2.0 × 10개의⁶ 셀을 준비하세요. 분석 크기와 원하는 씨앗 밀도에 따라 셀 수를 조정하세요.
3. 이펙터 셀 준비
   1. 염료 배제 기반 세포 계수 방법(예: 트리판 블루) 또는 동등한 검증 방법을 사용하여 NK-92 세포의 농도와 생존 가능성을 평가합니다. 생존율이 ≥80%일 때만 진행해야 하며, 생존율이 낮으면 분석의 성능에 영향을 줄 수 있습니다.
      참고: 형광 단백질 ZsGreen을 안정적으로 발현하도록 설계된 NK-92 세포를 단독(대조군) 또는 BCMA 표적 CAR 구조체와 함께 사용하여 효과 세포로 사용되었습니다.
   2. 필요한 세포 수를 개별하여 개별 15mL 원뿔형 바닥 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
      참고: 모든 E:T 비율에서 복제 1회에 필요한 세포 수를 합산하고, 복제 횟수를 곱한 후 세포 손실을 반영하여 50% 초과분을 더해 총 이펙터 셀 수를 계산하세요. 준비를 돕기 위해 필요에 따라 정략 숫자를 사용하세요. 예를 들어, E:T 비율이 2:1에서 0.25:1 범위일 때, 복제당 1.5 × 10개의⁵ NK 셀을 사용합니다. 삼중판의 경우, 보충 그림 1A에 설명된 판 배치에 따라 조건당 4.5 ×^{10 5} 셀을 준비합니다.
   3. 원심분리기 셀(5분, 300 × g, RT, 가속도 = 최대; 감속 [브레이크] = 최대).
   4. 상원액은 버리세요.
   5. 세포를 최종 농도인 5.0 × 10⁵ 세포/mL(5.0 × 10^{4 세포/} 100 μL)로 재현탁합니다.
4. 이펙터 셀 희석 준비
   1. 원형 바닥 96웰 플레이트에서 표적 전용 대조군을 포함한 이펙터 셀 희석을 준비합니다(대표적인 플레이트 레이아웃은 보 충 그림 1A 참조). 각 조건은 3부로 준비됩니다.
   2. 240 μL/웰의 이펙터 셀(5.0 ×^{10 5} 셀/mL)을 E:T 비율 2:1에 해당하는 웰에 추가합니다.
   3. 남은 모든 웰에 120 μL/웰의 배지를 추가하세요.
   4. E:T = 2:1 우물부터 E:T = 0.25:1 우물까지 2배 연속 희석을 수행합니다. 피펫팅으로 ≥5회 충분히 섞고, 이송 사이에 팁을 바꿔 주세요.
      참고: 영상 검사 작업이 영상 시스템에 일정이 잡히지 않은 경우, 공동 배양 설정 전에 미리 일정을 잡으세요. 준비된 이펙터 셀 희석액은 37°C에서 5% CO₂를 사용해 둥근 바닥 96웰 플레이트에서 최대 30분간 유지할 수 있으며, 생세포 영상 시스템을 구축할 수 있습니다.
5. 공화를 조성하기
   1. 폴리-D-라이신 코팅된 평평한 바닥 96웰 플레이트를 얻으세요.
   2. 모든 웰에 100 μL/웰의 표적 셀 현탁액을 추가합니다. 적절한 피펫(예: 200 μL)을 사용해 피펫을 ≥5회 위아래로 피펫팅하여 표적 세포를 완전히 재현탁하고, 이송 중 기포 형성을 방지하세요.
   3. 해당 웰에 100 μL/웰의 이펙터-셀 현탁액을 추가합니다. 적절한 피펫(예: 200 μL)을 사용해 ≥5회 피펫팅하여 분배 직후 효과기 셀을 철저히 재현탁하고, 전달 중 기포 형성을 방지하세요.
   4. 주변 미사용 유정에 200 μL/우물 PBS를 추가하세요.
   5. 판 원심분리(2분, 100 × g, RT, 가속도 = 낮음 [예: 2]; 감속 [브레이크] = 낮음 [예: 2]).
      참고: 이 부드러운 스핀은 IncuCyte SX5에서 정확한 영상 촬영을 위해 웰 바닥에 세포를 빠르고 고르게 안정시키는 데 매우 중요합니다. 우리는 가속 및 감속 설정을 2(9 중 2)로 설정한 스윙잉 버킷 로터 호환 벤치탑 Eppendorf Centrifuge 5810R을 사용합니다.
   6. 플레이트를 생세포 영상 시스템에 넣고 24시간 동안 1시간마다 이미지를 획득하세요(필요 시 최대 72시간까지 연장 가능). 표준 인큐베이션 조건(37°C/5% CO₂) 하에서 영상 촬영이 이루어지도록 하세요.
      참고: t = 0 h 시점의 영상이 기준선 표적 세포 수를 정확히 반영하도록 하기 위해, 공동 배양 설치 및 원심분리 후 10–15분 이내에 영상 획득을 시작하세요. 세 개의 이미징 채널(즉, 녹색, 주황색, NIR)을 가진 풀플레이트의 경우, 20× 배율에서 3장의 이미지당 약 10분이 시속 10분입니다.
   7. 첫 스캔 후 이미지 품질을 확인하고 필요하면 설정을 조정하세요.
6. 계측 설정
   1. SYTOX 오렌지가 녹색 채널로 형광 누출을 보정하도록 스펙트럼 분리를 설정하세요. 소프트웨어에서 녹지 않고 주황색 채널을 비교하여 혼합 제거 값을 조정하고, Orange⁺ 죽은 세포가 Green⁺로 잘못 감지되지 않았는지 확인하세요. 대표 실험(그림 1)에서는 주황색 채널이 녹색 채널에 대한 기여도를 8.5%로 설정했습니다. 이 값들은 데이터셋별로 적용되므로 각 실험에 최적화되어야 합니다.
   2. 각 시야 내 모든 세포의 정확한 분할과 마스킹을 보장하기 위해 비부착 셀별 분석을 구성하세요(대표적인 설정은 보충 그림 1B 참조). 현탁 효과기 및 표적 세포주 모델을 사용하는 생세포 영상 시스템에 권장되는 다음 매개변수:
      1. 예상 물체 직경을 15 μm(대략적인 셀 직경)로 설정합니다.
      2. 임계 감도와 텍스처 감도를 5로 설정하세요.
      3. 세포 클러스터 분리를 용이하게 하기 위해 가장자리 감도를 10으로 설정하세요.
      4. 허용되는 물체 영역 필터 범위를 50–2000 μm^² 로 설정하여 잔해와 큰 물체를 배제합니다.
      5. 비세포 물체를 제외하기 위해 이심도 최대치를 0.95로 설정하세요.
   3. 분류 임계값을 설정하세요(대표성 게이팅에 관한 보충 그림 1C 참조). 표적만 대조군 웰을 사용하여 기본 NIR⁺/Orange⁻ 의 살아있는 표적 세포 집단을 정의합니다. 그 후 이후 시점(예: t = 4h)에 공동 배양 웰을 사용하여 NIR⁺/⁻ 와 Orange⁺/⁻ 집단 간 중복이 최소화된 명확한 분리를 확인한다. 예시 분류 임계값과 분석 매개변수는 보충 그림 1C에 표시되어 있습니다.
      1. 오렌지 강도 임계치를 대략 15로 설정하세요.
      2. NIR 강도 임계값을 약 0.1로 설정하세요.
         참고: 매개변수 및 임계값은 기기, 소프트웨어, 세포주 모델, 형광 신호 강도에 따라 달라질 수 있습니다.
         참고: 표적 세포가 안정적으로 NIR 형광을 발현하는 경우(예: emiRFP670) 이 프로토콜은 1차 인간 NK 세포 세포독성 또는 ADCC 분석법에 적용될 수 있습니다. 또한 폴리-D-라이신 코팅을 생략하고 평바닥 또는 둥근 96웰 플레이트를 사용하여 유세포분석 기반 살상 분석에 적응할 수 있습니다.

그림 1. 실시간 생세포 영상을 이용한 키메라 항원 수용체(CAR) NK-92 세포 매개 세포독성의 동역학과 효능을 정량화합니다. (A) NK 세포 매개 세포독성 모니터링을 위한 IncuCyte 생세포 영상 분석법의 개요. emiRFP670(근적외선 [NIR] 채널)을 발현하는 BCMA⁺ Ramos 표적 세포는 ZsGreen(녹색 채널)을 발현하는 NK-92 효과세포와 공동 배양되며, 세포 사멸은 SYTOX Orange(주황색 채널)를 이용해 검출됩니다. (B) 12시간 동안 효과자-표적(E:T) 비율 1:1에서 공동 배양 우정의 대표적 형광 이미지. 살아있는 표적 세포(emiRFP670⁺)는 파란색, NK-92 효과기 세포(ZsGreen⁺)는 녹색, 죽은 세포(SYTOX Orange⁺)는 빨간색으로 표시됩니다. 이미지는 20× 배율의 비부착형 Cell-by-Cell 분석 모듈을 사용하여 촬영되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. (C) 대조군 및 CAR-발현 NK-92 세포의 다양한 E:T 비율에서 표적세포 성장 및 생존율을 시간에 따른 정량화. (D) 여러 시점(4, 8, 16, 24시간)에서 E:T 비율에 따른 표적 세포 생존 정량화. 각 시점에서 표적 셀 수는 표적 전용 우정(E:T = 0:1)으로 정규화되었습니다. (E) 세포독성 평가에 사용되는 정량적 지표의 도식: KR₅₀, 12시간 내에 50% 살상을 달성하기 위해 필요한 킬러-타깃 비율; KT₅₀, E:T 비율 1:1에서 50% 사살에 필요한 시간; 그리고 IKI₅₀은 50% 생존 등선선 이하의 히트맵 면적으로 정의된 통합 킬러 지수입니다. (F) 각 효과기 조건에 따른 E:T 비율과 시간에 따른 표적 세포 성장 및 생존 히트맵. 각 조건별로 KR₅₀, KT₅₀, IKI₅₀의 정량적 값이 표시되어 있습니다. 원시 생 표적 세포 수는 IncuCyte 2021C 소프트웨어의 세포별 분류 분석을 통해 게이트 NIR⁺/SYTOX Orange^– 집단에서 얻었습니다. 모든 조건은 3중으로 수행되었습니다(n = 3). 데이터는 평균± 표준편차로 제시됩니다. 비선형 회귀분석을 사용하여 패널 D와 F에서 세포독성 경향을 모델링하였으며, 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

2. 유세포분석을 통한 항체 의존성 세포독성 정량화

1. 1차 인간 NK 세포를 준비합니다
   참고: 1차 인간 NK 세포는^{앞서 설명}한 대로 NK-세포 풍부화 방법 및 밀도 구배 원심분리를 통해 건강한 성인 기증자로부터 얻은 백혈구 풍부 말초혈에서 분리되었습니다. 정제된 NK 세포는 5×⁶ 세포/mL 냉동 용액(90% FBS 및 10% 디메틸 설폭사이드[DMSO])에서 0.5mL 알리코트로 냉동보존되어 3^회 사용 전까지 −150°C 이하에서 보관되었습니다.
   1. 5× 10^{개의 6개} 1차 인간 NK 세포가 들어 있는 바이알을 37°C 물욕에서 약 1분간 부드럽게 저어 작은 얼음 결정만 남게 합니다.
      주의: 기관 지침에 따라 적절한 생물안전 절차와 개인 보호 장비를 사용하여 모든 인간 유래 샘플을 처리하십시오.
      주의: DMSO는 피부가 화학물질을 흡수하도록 돕습니다. 적절한 보호 장비를 착용하고 직접 접촉을 피하세요.
   2. 해동된 세포를 15mL 원뿔형 바닥 원심분리관에 10mL 예열(37°C) NK-세포 배양액을 넣고 부드럽게 휘저어 혼합합니다.
      참고: NK-세포 배양 배지는 Advanced RPMI-1640에 10% FBS, 10% 인간 AB 혈청, 2 mM L-알라닐-L-글루타민, 100 μg/mL 프리모신, 50 U/mL 인간 IL-2가 보조된 것으로 구성됩니다.
   3. 원심분리기 셀(5분, 300 × g, RT, 가속도 = 최대; 감속 [브레이크] = 최대).
   4. 상원액은 버리세요.
   5. 펠릿을 5mL의 미리 예열된(37°C) NK-세포 배양 배양액에 재현탁합니다.
   6. 원심분리기 셀(5분, 300 × g, RT, 가속도 = 최대; 감속 [브레이크] = 최대).
   7. 상원액은 버리세요.
   8. 펠릿을 1mL의 미리 예열된 NK-세포 배양 배지에 재현탁합니다.
   9. 24웰 조직 배양판의 한 웰로 현탁액을 옮깁니다.
   10. 증발을 최소화하기 위해 주변 우물에 멸균 PBS 1mL를 첨가하세요.
   11. 24웰 플레이트를 37°C에서 5% CO₂와 함께 45° 각도(플레이트 거치대나 지지대 사용)로 16–24시간 인큐베이팅하여 NK-셀 회수를 돕습니다.
       참고: 1차 인간 NK 세포는 최대 생존과 회복을 위해 밀접한 세포 간 접촉이 필요하며, 이는 24웰 플레이트를 기울이고 웰 가장자리에 축적을 허용함으로써 달성할 수 있습니다. 실험 전반에 걸쳐 일관된 배양 시간을 유지하세요.
       참고: 회복 기간 후에는 바로 표적 세포 준비와 공동 배양 준비로 진행하세요.
2. 카복시 플루오레세인 숙시니미딜 에스터(CFSE)로 표적 세포를 염색합니다.
   1. 5× 10개의⁵ 개 표적 세포를 얻어 15mL 원뿔형 바닥 원심분리관으로 옮깁니다.
      참고: 환자 유래 림프종 세포주를 표적 세포로 사용했습니다¹⁶.
   2. 세포를 10mL PBS로 한 번 세척하세요.
   3. 원심분리기 셀(5분, 300 × g, RT, 가속도 = 최대; 감속 [브레이크] = 최대).
   4. 5 mM 스톡 용액을 사용해 15mL 원뿔형 바닥 원심분리기 튜브에서 5 mM CFSE 스톡 10 mL로 희석하여 0.5 μM CFSE 작동 용액을 PBS 내에서 준비합니다.
      주의: CFSE는 반응성 아민 결합 형광 염료로, 피부나 눈 노출에 위험을 초래할 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 사용하지 않은 시약은 지역 생물안전 지침에 따라 폐기하세요.
   5. 상원액은 버리세요.
   6. 펠릿을 약 1 ×^{10 6} 세포/mL에 CFSE 용액에 재현탁합니다.
   7. 37°C에서 15분간 배양시키고, 튜브를 알루미늄 호일로 감싸거나 불투명한 용기 안에 넣어 빛을 차단하세요.
   8. 5–10부피의 배양지를 첨가하여 반응을 소결합니다.
   9. 37°C에서 5분간 배양하세요.
   10. 원심분리기 셀(5분, 300 × g, RT, 가속도 = 최대; 감속 [브레이크] = 최대).
   11. 상원액은 버리세요.
   12. 세포를 2.5 × 10⁵ 세포/mL로 재현탁하여 100 μL에 2.5 ×^{10 4} 세포가 포함되도록 합니다.
       참고: CFSE 신호 강도와 표적 세포 생존력을 일관되게 유지하려면 바로 도금 작업을 진행하세요.
3. 플레이트 타겟 셀
   1. 둥근 바닥 96웰 플레이트를 확보하세요.
   2. 멀티채널 피펫을 사용해 지정된 웰에 표적 세포 100 μL(2.5 ×^{10 5} 세포/mL)을 추가합니다( 보충 그림 2 참조). 각 조건은 3중으로 도금되어 있습니다.
      참고: 도금 전에 세포 현탁액이 균질한지 확인하세요.
4. 항체를 준비하고 추가하세요
   1. 각 검사 항체와 매칭된 아이소타입 대조군에 대해 NK 세포 배양 배양지에 4× 항체 용액 200 μL(100 μg/mL)을 준비합니다.
      참고: 이 단계는 모듈식이며, 선택한 표적 세포주에 대해 ADCC를 매개하는 모든 항체에 적용할 수 있습니다. 항체 재고의 농도와 제형은 다양할 수 있습니다; 희석량을 적절히 조절하세요. 아지드와 같은 방부제는 표적 세포 생존과 NK 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 다양한 항체 농도를 검사할 수 있으나, 최종 농도는 25 μg/mL로 측정됩니다.
   2. 항체 용액을 깊은 웰 플레이트로 옮깁니다.
   3. 표적 세포에 항체 용액 50 μL/웰을 추가하고 피펫팅 ≥5회 피펫팅하여 충분히 혼합합니다.
   4. 항체 없는 대조 웰에 NK-세포 배양 배양지 50 μL을 추가하고 피펫팅으로 ≥5회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
   5. 37°C에서 5% CO₂를 사용하여 25–30분간 배양합니다.
5. NK 세포를 준비하고 추가하세요
   1. 염료 배제 기반 세포 계수 방법(예: 트리판 블루) 또는 동등한 검증된 방법으로 10개의⁵ NK 세포 2개×를 세어 얻습니다. 이 수치는 3개의 NK 세포 함유 조건을 3회로 플레이트할 때 충분하며, 피펫팅 손실을 고려하기 위해 초과 처리를 포함합니다( 보충 그림 2 참조). 생존 가능성이 ≥75%일 경우 진행하세요. 생존 가능성이 낮으면 분석의 성능에 영향을 줄 수 있습니다.
   2. 800 μL 1차 인간 NK 세포 배양 배양지(최종 농도 = 1.25 ×⁴ 세포/50 μL)에 2.5 ×⁵ 5 세포/mL로 세포를 재현탁합니다.
   3. 해당 웰에 50 μL/웰의 NK 셀을 추가하고, 피펫팅으로 ≥5회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
      참고: 도금 전에 세포 현탁액이 균질한지 확인하세요.
   4. 웰 50 μL의 배양지를 추가하여 웰을 조절하고, 피펫팅으로 ≥5회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
6. 최종 공동 문화 구축
   1. 둥근 바닥 96웰 플레이트를 꼼꼼히 점검하여 모든 웰에 200 μL가 포함되어 있고 반월판 수준이 균일하며 기포가 없음을 확인하세요.
   2. 판을 원심분리(2분, 100 × g, 가속도 = 낮은 [예: 2]; 감속 [브레이크] = 낮은 [예: 2]).
      참고: 이 부드러운 스핀은 세포를 빠르게 정착시키고 세포 간 접촉을 늘리는 데 중요합니다. 우리는 가속 및 감속 설정을 2(9 중 2)로 설정한 스윙잉 버킷 로터 호환 벤치탑 Eppendorf Centrifuge 5810R을 사용합니다.
   3. 37°C에서 5% CO₂로 16–18시간(하룻밤) 배양합니다.
      참고: 이 인베이베이션 기간은 분리가 아닌 세포독성 판독을 위해 최적화되었으며, 탈과립은 CD107a 발현을 더 이른 시점(2–6시간)에 측정하는 것이 가장 좋습니다. 따라서 최대 탈과립 반응은 과소평가될 수 있습니다.
      참고: 18시간 이상 인큐베이킹을 연장하지 마십시오. 장기간 공동 배양은 대조 웰에서 과도한 표적 세포 사멸과 실험 조건 간 동적 범위 감소를 초래할 수 있습니다.
7. 유세포검사 수행
   1. 원심분리기(5분, 300 × g, 가속도 = 최대; 감속 [브레이크] = 최대).
   2. 상원액은 버리세요.
   3. 모든 웰을 200 μL/웰의 FACS 버퍼(2% FBS, 2 mM EDTA in PBS)로 세척하세요.
   4. FACS 버퍼 내 표면 항체 마스터 믹스를 1:50 희석 CD56-BV421, 1:50 희석 CD16-BV785, 1:25 희석 CD107a-PE-Cy7을 첨가하여 준비합니다.
      참고: 실험판 설계(웰 수 × 50 μL/웰 + 20% 초과분)를 기준으로 총 마스터 믹스 부피를 계산하세요. 항체 클론은 염색 강도와 에피토프 접근성 면에서 다양할 수 있습니다. 대표 데이터에 사용된 클론은 재료표에 나열되어 있으며, 대체 클론은 적정이 필요할 수 있습니다. 추가 항체는 NK 세포 하위 집합 표현형(예: KIRs, NKG2A/C/D, CD57)과 활성화 마커(예: CD69, HLA-DR)에 포함될 수 있습니다.
   5. 세포를 50 μL/웰 용량의 항체 마스터 믹스에 재현탁한 후 피펫팅으로 ≥5회 완전히 혼합합니다.
   6. 4°C에서 15분간 배양하고, 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸거나 불투명한 용기 안에 넣어 빛을 차단하세요.
   7. FACS 버퍼 150 μL/웰을 추가하세요.
   8. 원심분리기(5분, 300 × g, 가속도 = 최대; 감속 [브레이크] = 최대).
   9. 상원액은 버리세요.
   10. 세포를 FACS 버퍼 내 5 μM 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 100 μL/웰에 재현탁한 후 즉시 유세포 분석 획득을 진행합니다. 사전 인큐베이션은 필요하지 않습니다.
   11. 유동 세포분석을 통해 데이터를 수집하고 CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI 및 기타 형광체의 형광 채널을 기록합니다.
       참고: 획득 설정(예: 검출기 전압, 보상, 게이팅)은 최적화가 필요할 수 있습니다. 보상 및 게이팅 설치에는 무염색 및 단일 염색 대조군을 사용하며, 적절한 경우 보정 비드나 대표 셀을 사용하세요. 연속적이거나 희미한 발현을 가진 마커(예: CD107a)에는 형광-1 대조군을 고려해야 합니다. 실험 전반에 걸쳐 일관된 설정과 게이팅 전략, 라이브 게이팅/데드 게이팅, 타깃 및 이펙터 집단 식별을 유지하세요.
       참고: Step 1 과 Step 2 모두 부착 표적 세포에 맞게 조정할 수 있습니다. 동배양 하루 전, 평평한 바닥 96웰 플레이트에 씨앗 표적 세포(해당 배양 배지와 함께)를 분석일 당일 약 70% 합류도를 달성하는 밀도로 배치합니다. 준수가 확인된 후 표적 세포 배지를 폐기하고 100μL 신선한 NK 세포 배지를 교체한 후 효과 세포를 추가하여 공동 배양을 시작합니다. 세포 크기와 형태의 차이로 인큐세포 세포별 분석 매개변수는 각 부착 세포주별로 최적화되어야 합니다.
       참고: 유세포분석법 기반 부착 세포 검사 시 공동배양 후 플레이트(300 × g, 5분)를 원심분리하여 상원액을 버려야 합니다. TrypLE 100 μL/웰을 추가하고 37°C에서 5%_CO2 와 약 5–15분(세포주에 따라 다름) 배양하여 세포를 분리합니다. FACS 버퍼를 100 μL/웰에 추가하고, 피펫으로 원을 그리며 위아래로 혼합한 후 모든 세포를 둥근 바닥 96웰 플레이트로 옮깁니다. 염색을 진행하기 전에 현미경으로 웰을 검사하여 완전한 박리 여부를 확인하세요(2단계, 7번째 단계). 단일 세포 현탁을 달성하기 위해 필요에 따라 TrypLE 배양 시간을 최적화합니다.

결과

NK-세포 세포독성을 실시간으로 정량화하기 위해, 항-BCMA CAR을 발현하도록 설계된 NK-92 효과 세포를 BCMA⁺ Ramos 표적 세포와 검은색 투명 평평한 바닥 96웰 플레이트에서 공동 배양하고 생세포 영상으로 모니터링하였습니다(그림 1A 및 보충 그림 1A). 효과기 세포는 0:1(목표 기준), 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 2:1의 E:T 비율로 추가되었으며, 각 조건은 3중으로 수행되었습니다. 세 가지 다른 CAR NK-92 구조체가 평가되었습니다: 공동 자극 도메인이 없는 CAR1, 4-1BB(CD137) 공동 자극 도메인을 가진 CAR2, DAP10 공동 자극 도메인을 가진 CAR3와 ZsGreen 단독 벡터를 발현하는 대조군 NK-92 세포입니다. 모든 이펙터 세포는^{앞서 설명} 한 ZsGreen-P2A-CAR 형질전환 카세트를 사용한 렌티바이러스 전도법을 통해 생성되었습니다. 라모스 표적 세포도 emiRFP670 인코딩 렌티바이러스 벡터로 유사하게 형질전환되었습니다. 표적 세포 성장과 생존율은 생세포 영상 장비를 사용하여 24시간 동안 매시간 추적되었으며, ZsGreen⁺ NK-92 세포는 녹색 형광, SYTOX Orange⁺ 사망 세포는 주황색 형광, emiRFP670⁺ 표적 세포는 NIR 형광을 측정하였습니다(그림 1A 및 보조 그림 1B 및 1C).

현미경 이미지를 정해진 시간 간격으로 촬영하여 공동 배양 중 이펙터 세포, 살아있는 표적 세포, 사망 세포를 시각화하였습니다(그림 1B). 표적 세포 성장 및 생존율의 정량화는 CAR2와 CAR3 NK-92 세포가 특히 초기 시점에서 1:1의 E:T 비율에서 CAR1 NK-92 세포보다 더 빠른 살상 동역학을 보임을 입증했습니다. 표적 세포 사살은 E:T 비율이 높아질수록 증가했으며, 대조군에서는 자연스러운 세포독성을 보인 NK-92 세포도 포함되었다(그림 1C). 이 측정들은 생세포 영상이 세포독성 활성의 동적 변화를 포착할 수 있음을 강조합니다. 표적세포 생존율도 특정 시점에서 E:T 비율의 함수로 분석하여 CAR NK-92의 효능을 비교하였습니다. CAR2 및 CAR3 NK-92 세포는 이후 시점(예: 24시간 시 E:T = 0.25:1)과 중간 E:T 비율(예: 4시간 시 E:T = 1:1)에서 더 높은 효능을 보였습니다(그림 1D). 분석 간 CAR2와 CAR3 NK-92 효과세포 간에 유의한 죽음 차이는 관찰되지 않았습니다.

E:T 비율, 공동 인베이비 시간, 표적세포 생존을 통합한 히트맵은 모든 이펙터 집단에서 자연 및 CAR 매개 세포독성을 포괄적으로 시각화하고 정량적 평가를 가능하게 합니다. 효능과 운동학을 정량화하기 위해 세 가지 매개변수가 정의되었습니다: KR₅₀, 즉 12시간 시에 50%의 살상을 달성하는 킬러-대 표적 비율; KT₅₀, 50% 사멸에 필요한 공동 배양 시간(E:T 비율 1:1); 그리고 50% 생존율 등선(그림 1E)으로 정의된 50% 생존율 이하 열맵 면적을 나타내는 통합 킬러 지수인 IKI₅₀입니다. 이 지표들은 CAR NK-92 세포 효능(KR₅₀), 살상 동역학(KT₅₀), 통합 세포독성 성능(IKI₅₀)을 비교할 수 있게 합니다(그림 1F). 이 분석은 단일 실험 내에서 여러 매개변수에 걸쳐 설계된 NK-셀 플랫폼을 정량적으로 비교할 수 있음을 보여줍니다.

유세포측과 세포 카운팅을 사용하여 치료용 항체의 유무와 관계없이 형광 표지된 표적 세포를 원차 인간 NK 세포와 공동 배양하고, 16–18시간 인큐베이션 후 잔여 생존 표적 세포 집단을 정량화하여 ADCC를 측정했습니다(그림 2A). Cytek Aurora, BD Symphony, BD Fortessa 같은 고처리량 샘플러가 장착된 플로우 사이토미터를 사용할 수 있습니다. 대표적인 구성(보충 그림 2)에서는 CD38⁺ 환자 유래 림프종 표적 세포를 둥근 바닥 96웰 플레이트에 플레이트링하고, 적절한 웰에 다라투무맙(또는 아이소타입 항체)을 첨가하였습니다. NK 세포는 E:T 비율 0.5:1로 공동 배양하였으며, 이 비율은 자연 사멸을 최소화하고 ADCC 검출을 가능하게 하기 위해 최적화되었습니다. 인큐베이션 후에는 유세포검사를 수행하여 전방향 및 측면 산란을 통해 세포 집단을 분해하고, DAPI를 이용해 생존 불가능한 사건을 배제하며, CFSE⁺ 표적 세포를 CD56⁺CD16⁺ NK 세포에서 분리하여 병렬 분석을 수행하였습니다(그림 2B). 이 설계는 동시적으로 세포독성 측정과 표현형 특성 분석을 가능하게 합니다.

그림 2. 유세포분석법 기반 항체 의존성 세포독성(ADCC) 분석법은 표적 세포 생존과 NK 세포 활성화의 동시 정량을 가능하게 합니다. (A) ADCC 분석의 도식적 개요. CFSE 표지된 CD38⁺ 림프종 표적 세포는 웰당 2.5 × 10^{4 세포로} 배양하여 다섯 가지 조건에서 배양하였습니다: 표적 세포 단독; 다라투무맙(25 μg/mL)으로 표적 세포를 이용한 세포; NK 세포를 가진 표적 세포(E:T = 0.5:1); 표적 세포는 NK 세포와 다라투무맙을 이용합니다; 그리고 NK 세포와 아이소타입 대조항체(25 μg/mL)를 표적으로 하는 세포가 있습니다. (B) 대표적인 유세포 게이트 전략. 사건은 처음에 전방향 산란과 측면 산란으로 제한되었고, 이후 DAPI를 이용해 생존 불가능한 세포를 배제하였습니다. 표적 세포는 CFSE⁺ 사건으로, NK 세포는 CD56⁺ 및 CD16⁺ 사건으로 확인되었습니다. NK 세포 탈과립은 CD107a 발현으로 평가하였다. (C) 표적세포 생존율의 정량화, 표적만 대조군 조건에 대한 백분율(100% 설정). (D) NK-세포 탈과립의 정량화, NK-세포 집단 내 CD107a⁺ 세포의 비율로 표시됨. 막대는 평균 ± 표준편차를, 겹쳐진 점은 개별 복제 우물(n = 3)을 나타냅니다. 통계 분석은 Tukey의 사후 다중 비교 검정을 이용한 분산의 일방향 분석을 사용하여 수행되었습니다. 통계적 유의성은 다음과 같이 표시됩니다: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

주요 평가 변수는 활성 CFSE⁺ 게이트 내에서 계산된 표적세포 생존으로, 표적 전용 상태로 정규화되어 100% 생존율로 설정됩니다. 이 정규화는 자발적 표적 세포 손실을 조절하고 조건 간 직접 비교를 가능하게 합니다. 대표적인 데이터(그림 2C)에서는 다라투무맙 단독 첨가가 표적 세포 생존율을 감소시키지 않아, 이펙터 세포가 없는 상태에서 항체가 표적 세포 생존력에 직접적인 영향을 미치지 않음을 확인시켜 주었습니다. NK 세포와의 공동 배양 단독 시술은 표적 세포 생존율을 약 70%로 감소시켜 기저 자연 세포독성을 시사합니다. 다라투무맙 추가로 생존율은 약 37%로 감소했으며, 이는 항체 매개 살상 증진과 일치하는 반면, 아이소타입 대조 조건은 약 62%로 NK 단독 상태와 유사했다. 성공적인 실험들은 항체 처리 조건과 대조군 조건 간에 명확한 분리가 있으며, 복제체 간 높은 재현성을 보여주었습니다.

NK 세포의 2차 표현형은 표적 세포 사멸과 효과기 활성화 간의 연관성을 상호 보완적으로 확인시켜 줍니다. NK-세포 탈과립은 CD107a⁺ NK 세포의 비율로 측정되며, 항체 없이 NK 세포-표적 세포 공동 배양에서 가장 낮았고, 다라투무맙 처리 상태에서 가장 높았으며(약 31%), 아이소타입 대조군에서는 중간 형태의 탈과립(약 19%)이 나타나 항체 매개 활성화를 지지합니다(그림 2D)). 이 결과는 이 분석법이 표적 세포 살해와 효과기 활성화를 구분할 수 있음을 보여줍니다. 탈과립과 생존 경향은 대체로 일치하지만, 완전히 겹치지 않아 관련되었지만 별개의 생물학적 과정을 나타낸다.

최적이 아닌 실험에서는 조건 간 분리 감소, 웰 간 셀 수 변동, 대조 웰에서 높은 표적 세포 사멸, 약한 CFSE 염색, 또는 높은 배경 과립 탈과립이 나타납니다. 이러한 결과는 표적 세포 생존율 저하, NK 세포 회복 불일치, 혼합 부족, 염색 및 획득의 변동성 등에서 비롯될 수 있습니다. 이 분석법은 표적 구획과 효과자 구획을 독립적으로 식별하기 때문에, 표적 세포의 추가 표현형(예: 항원 밀도 또는 리간드 발현)과 더 넓은 NK 세포 특성화까지 확장할 수 있습니다. "NK 단독" 조건을 포함하면 기저선 분리와 NK-세포 생존성을 추가로 정량화할 수 있습니다. 이 다중 매개변수 설계는 기능적 세포독성을 기전적 면역 표현형과 함께 해석할 수 있게 하는 핵심 장점입니다.

보충 그림 1. 생세포 영상 세포독성 분석의 대표적인 플레이트 레이아웃 및 분석 워크플로우. (A) CAR NK 셀 살상 분석의 대표적인 96웰 플레이트 레이아웃. 네 가지 효과기 셀 조건이 사분면으로 배열되어 있으며, 각각 0:1(표적 전용 대조), 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 2:1의 E:T 비율로 시험되며, 각 조건은 3회로 수행됩니다(총 60개의 분석정 웰). (B) IncuCyte 2021C 소프트웨어에서 비부착 세포별 분석의 대표적 구성으로, 개별 이펙터 및 표적 세포를 식별하고 잔해와 집합체를 제외하는 데 사용되는 스펙트럼 분리, 분할, 마스크 매개변수를 보여줍니다. (C) NIR 대 SYTOX 오렌지 형광을 이용한 대표성 세포별 분류 게이팅 전략을 통해 살아있는 표적 세포 집단을 정의하는 방법. 예를 들어 시점(t = 4h)에서의 표적 전용 웰과 공동 배양 웰이 살아있는 세포와 죽은 세포 집단 간 분리를 확인하는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 2. 유세포분석 기반 ADCC 분석의 대표성 플레이트 레이아웃. 대표적인 96웰 플레이트 레이아웃으로, B–D 행과 2–6열에 걸쳐 3부로 플레이트된 다섯 가지 실험 조건을 보여줍니다(총 분석장 = 15): (1) 표적 단독 대조군, (2) 다라투무맙 표적 세포, (3) NK 세포를 이용한 표적 세포, (4) NK 세포와 다라투무맙을 포함한 표적 세포, (5) NK 세포와 아이소타입 대조 항체를 가진 표적 세포. 표적 셀은 웰당 2.5 × 10^4셀로 도판되었고, NK 셀은 웰당 1.25 × 10^4셀로 추가되어 E:T 비율을 0.5:1로 달성했습니다. 항체는 최종 농도인 25 μg/mL로 사용되었습니다. 주변 우물에는 증발을 최소화하기 위해 PBS가 채워졌습니다. 표적만 조건은 표적 세포 생존율을 정규화하는 데 사용되었고, 아이소타입 대조군은 항원 특이성과 무관하게 항체 제형 효과를 고려했다. 표적 세포주의 감수성에 따라 E:T 비율의 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 프로토콜들은 표준화된 96웰 플레이트 형식에서 NK-세포 세포 독성을 정량화하기 위한 두 가지 상호 보완적 접근법을 제공합니다. Step 1 은 실시간 생세포 영상을 사용하여 표적 세포 손실을 지속적으로 모니터링하며, 여러 E:T 비율에서 자연 및 CAR 매개 살해의 동역학을 평가하는 데 적합합니다. 2단계는 유세포분석을 이용해 정해진 동잠복 기간 후 ADCC를 정량화하는 동시에 표적과 효과기 구획을 분리하여 표현형 분석을 수행합니다¹⁷. 이러한 방법들은 서로 다른 생물학적 과정을 모델링할 수 있는 상호 보완적인 분석 플랫폼으로 제시되며, 또한 쉽게 상호 교환 가능합니다. 1차 인간 NK 세포는 생세포 영상 기반 ADCC 분석에 사용될 수 있으며, 유세포 분석에서 CAR 매개 살균용으로도 설계될 수 있습니다. 또한, 야생형 NK-92 세포는 CD16 발현이^없지만, CD16의 도입(예: 렌티바이러스 전도)을 통해 NK-92 세포가 강력한 ADCC를 매개할 수 있게 합니다. 따라서 두 검사법 모두 개별적인 과학적 및 번역적 필요에 맞게 조정할 수 있습니다.

두 검사 모두에서 재현성을 위해 특히 중요한 단계가 몇 가지 있습니다. 효과자 세포 수와 표현형의 작은 변화가 표적 세포 생존율을 극적으로 변화시킬 수 있습니다. 정확한 셀 카운팅과 도금 시 철저한 재현탁은 셀 카운트 편차와 불완전한 혼합을 최소화하는 데 필수적입니다. 마찬가지로, 실험 간 세포 준비도 생존 가능성, 회복 시간, 이전 사이토카인 노출 등 일관성을 유지하여 균일한 효과기 기능을 보장해야 합니다. 판 형상학은 분석 성능의 또 다른 중요한 결정 요인입니다. 라이브 세포 영상 작업 흐름에서는 평평한 바닥 코팅 플레이트가 안정적인 이미지 획득과 일관된 현장 분석을 지원하는 반면, 유동 세포 분석 워크플로우에서는 둥근 바닥 플레이트가 세포 간 접촉을 촉진하고 종말에서 비부착 공동 배양의 회복을 촉진합니다. 또한, 형광 표지의 품질은 영상 검사로 표적세포 구별이 부실하거나 유세포검사로 CFSE 분리가 약하면 정량 및 해석이 불가능하므로 검사 전에 반드시 확인해야 합니다.

이 두 워크플로우는 서로 다른 기술적 고려사항을 제공합니다. 라이브 세포 영상 분석에서 데이터 품질 저하의 일반적인 원인으로는 불균일한 세포 판금, 밀집된 세포 군집 또는 응집, 그리고 최적의 이미지 분석 임계값 부족 등이 있으며, 이 모든 것은 쉽게 보정할 수 있습니다. 이러한 문제들은 세포 수를 왜곡하여 시간에 따른 일관성 없는 추적을 초래할 수 있습니다. 유동세포분석 기반 분석에서는 부적절한 결과가 배경 표적 세포 사멸률이 높거나, 표적과 효과기 집단의 분리가 약하거나, 항체 염색이 불안정하거나, 복제 웰 간 피펫팅 불규칙함 등으로 인해 발생하는 경우가 더 많습니다. 이 검사들은 비교 분석을 위해 설계되었기 때문에, 해석에 적합한 내부 대조군의 포함이 필수적입니다. 여기에는 정규화를 위한 표적 단독 대조군과 항체 또는 CAR 특이적 상태에 대한 일치 음성 대조군이 포함됩니다.

이 방법들에는 여러 가지 공통적이고 분석별 한계가 있습니다. 생세포 영상 분석은 시간적 해상도를 제공하지만, 정확한 형광 표지 및 영상 분석 매개변수에 의존하며, 이는 세포 군집, 스펙트럼 겹침, 또는^{공동 배양} 중 형태 변화에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 특히 1차 효과 세포가 포함된 분석의 경우, 살해 역학을 변경하지 않고 적절한 형광 표지를 달성하는 것은 어렵거나 실현 불가능합니다. 유세포분석 기반 분석법은 정의된 종점에서 더 높은 표현형 해상도를 제공하지만, 여러 개의 일치하는 시점을 수집하지 않는 한 초기 사살과 후기 사멸을 독립적으로 구분하지 못하며, 이는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요될 수 있습니다¹⁷. 또한, 종말 측정은 표적세포 사사뿐만 아니라 표적세포 증식, 효과기 소모, 또는 샘플 취급 중 회복의 차이도 반영할 수 있습니다. 따라서 CD107a와 같은 기전적 측정값은 표적 세포 제거의 직접적인 대체물보다는 이펙터-세포 활성화의 보완적 지표로 해석하는 것이 가장 적절하다¹⁹. 더 넓게 보면, 두 플랫폼 모두 생체 내에서 NK-세포 기능을 형성하는 공간 구조, 기질 상호작용, 사이토카인 구배, 또는 운송 제약을 완전히 재현하지 못합니다.

NK 세포 살해 분석법을 해석할 때는 여러 생물학적 요인도 고려해야 합니다. 기증자 간 변이는 기증자 연령, 성별, 감염병 병력, 수용체 다형성에 따라 세포독성 잠재력과 하위 구성 면에서 차이가 있는 1차 인간 NK 세포 실험에서 내재적 요소입니다²⁰. NK-92 세포의 사용은 변이를 크게 줄이지만, 이 세포들은 여전히 출처 및 통과 관련 변화를 나타낼 수 있습니다¹⁸. 저희 프로토콜은 표준화된 매개변수와 동일 판 비교를 통해 기술적 또는 실험적 차이를 완화하여 이러한 생물학적 요인을 보다 정확하게 평가합니다. 가능하다면 고정된 생존 임계값이 있는 정의된 NK-92 통과 범위를 사용할 것을 권장합니다. 원발 NK 세포의 경우, 각 상태별로 여러 기증자의 NK 세포를 사용하고, 기증자 간 변동성(예: 쌍 또는 혼합 효과 모델)을 통계 분석으로 고려해야 합니다. 이는 조건 간 상대적 차이가 일반적으로 기증자 간에 보존되기 때문입니다. 더 나아가, 추가 NK-세포 표지자(예: KIRs, NKG2A/C/D, CD57)를 유세포검사에 사용하는 항체 패널에 통합하여 기증자 간 하위 집합 빈도를 비교하고 하위 집합 특이적 NK-세포 활성화(예: CD107a 및 CD69 발현)를 평가하여 결과 해석을 더욱 용이하게 할 수 있습니다. 마지막으로, 모든 NK 세포 살해 분석에 대해 몇 가지 추가 시나리오를 고려해야 합니다. NK 세포에서 표적 항원의 발현은 내인성 발현 또는 위생세포증을 통해 표적 세포로부터 항원을 획득함으로써 NK 세포 형제사살을 일으켜 결과를 혼란스럽게 만들 수 있습니다. 예를 들어, 다라투무맙은 NK 세포에서 발현된 CD38을 표적으로 하여 형제살인²¹을 유도하여 ADCC의 크기를 목표 표적에 제한할 수 있습니다. 다행히도 생세포 영상 및 유세포 분석 검사를 통해 NK 세포의 정량화를 통해 형제사살균을 평가할 수 있습니다.

이러한 한계에도 불구하고, 생세포 영상과 유동 세포 측정법의 결합은 기초 및 전임상 응용 분야에서 재현 가능한 NK 세포 기능 검사를 위한 실용적인 틀을 제공합니다. 영상 작업 흐름은 시간적 행동이 중요할 때 유리하며, 예를 들어 빠른 반응과 지연된 세포독성 반응을 구분하거나 CAR 설계 간 살상 동역학을 비교하는 데 활용됩니다²². 유세포분석 기반 워크플로우는 동일한 샘플 내에서 효과자 및 표적 세포 표현형과 함께 기능적 판독을 해석해야 할 때 유리합니다. 이러한 접근법들은 널리 접근 가능한 실험 플랫폼을 활용하여 자연 살해, CAR 매개 세포독성, ADCC의 정량적 평가를 가능하게 합니다. 표준화되고 확장 가능한 프레임워크를 구축함으로써, 이 시스템은 NK 세포 기반 기법 전반에 걸쳐 엄격한 벤치마킹과 기전적 검증을 가능하게 하여 차세대 면역치료제의 개발과 임상 번역을 가속화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고급 RPMI-1640 배지	Thermo Fisher Scientific	12633020	NK-92 및 1차 인간 NK 세포 배양 배지 기본 배지 (완전한 제조법은 프로토콜 참조)
Anti-human CD107a 항체, PE-Cy7 접합체 (clone H4A3)	BioLegend	328618	유동 세포계의 탈과립 마커
Anti-human CD16 항체, BV785 접합체 (clone 3G8)	BioLegend	302046	유동 세포계
Anti-human CD56 항체, BV421 접합체 (clone HCD56)	BioLegend	318328	유동 세포계
15mL 튜브 및 96웰 플레이트와 호환되는 스윙 버킷 로터가 달린 탁상형 원심분리기 (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	세포 펠레팅 및 플레이트 원심분리 (100–300 × g)에 사용
카복시플루오레세인 숙신임 에스터 (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	표적 세포 표지에 사용되는 세포 증식 염료
Cytek Aurora 스펙트럼 유동 세포계 (또는 동등한 제품)	Cytek Biosciences	N7-00003	유동 세포계 획득 및 분석에 사용
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	BioLegend	422801	생/사 구별을 위한 핵 염색
96웰 딥웰 플레이트	USA Scientific	1896-2110	항체 제조에 사용
디메틸 설포사이드 (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	동결 보존제
태아 소 혈청 (FBS)	Avantor	76419-584	기본 배지 보충; FACS 버퍼 (2% FBS)에 사용
10L 목적용 온수 배스 (37 °C)	PolyScience	WBE10	세포 해동용
GlutaMAX (L-alanyl-L-glutamine 보충제)	Thermo Fisher Scientific	35050061	안정한 글루타민 공급원
인간 AB 혈청	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	1차 인간 NK 세포 배양 배지 보충
IncuCyte SX5 생 세포 이미징 시스템	Sartorius	4816	실시간 생 세포 이미징 및 세포별 분석
LUNA-FL 이중 형광 세포 계수기 (또는 동등한 제품)	Logos Biosystems	L20001	자동화된 세포 계수
Parafilm M (4 in × 250 ft 롤)	Genesee	16-101	플레이트 밀봉 및 보관
인체 생리 용액 (PBS), 무균 (pH 7.2–7.4)	Corning	21-020-CV	세척 및 FACS 버퍼 제조에 사용
Poly-D-lysine (0.1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	플레이트 코팅 시약
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	항생제
재조합 인간 인터루킨-2 (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	사이토카인
RosetteSep 인간 NK 세포 농축 키트	STEMCELL Technologies	15065	인간 NK 세포 농축 칵테일
SYTOX Orange 죽은 세포 염색	Thermo Fisher Scientific	S34861	생 세포 이미징을 위한 생존성 염료
트리판 블루 0.4%	Gibco	15250-061	세포 계수를 위한 생존성 염료
TrypLE Express 효소 (1X), 페놀 레드 없음	Thermo Fisher Scientific	12604039	부착 세포 분리에 사용
초순수 EDTA (0.5 M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	FACS 버퍼 제조에 사용
15mL 원추형 바닥 원심분리 튜브	Corning	352097	무균
24웰 조직 배양 플레이트 (조직 배양 처리)	Corning	3524	NK 세포 회수에 사용
96웰 투명 원형 바닥 플레이트 (조직 배양 처리)	Corning	3799	공동 배양 및 유동 세포계 분석에 사용
96웰 평면 투명 바닥 검정 폴리스티렌 플레이트 (조직 배양 처리)	Corning	3603	생 세포 이미징 시스템과 호환