방법 논문

모기 Aedes aegypti의 행동에 대한 광유전학적 분석

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DOI:

10.3791/71394

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2026년 8월 21일

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1Department of Genetics, Yale University, 2Kavli Institute for Neuroscience, Yale University, 3Howard Hughes Medical Institute, 4Wu Tsai Institute, Yale University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 광유전학을 이용하여 모기 Aedes aegypti의 행동을 이해하는 방법을 설명합니다. 숙주 동물에 대한 유인 및 흡혈 과정 중의 신경 기능을 평가하기 위한 사육, 준비, 분석 및 어세이 방법들이 제시됩니다. 이러한 기초 기술들은 인간 질병의 중요한 매개체인 이 모기에 대한 신경 회로 및 행동 연구를 가능하게 할 것입니다.

초록

모기 Aedes aegypti는 바이러스성 병원체의 중요한 매개체이며, 다른 매개체 종의 모델로 활용됩니다. 병원체는 모기가 숙주 동물을 물 때 전파되지만, 탐색 및 흡혈 행동을 제어하는 신경 회로는 여전히 알려져 있지 않습니다. 본 논문에서는 신경 회로와 행동 사이의 인과 관계를 결정하는 핵심 기술인 광유전학을 이용하여 모기의 신경 활동을 조작하는 방법을 상세히 설명합니다. 이러한 방법에는 광유전학 실험을 위한 모기 사육법과 각성, 유인, 구침 탐색 및 숙주 혈액 섭취의 단계별 과정을 측정하도록 설계된 세 가지 분석법이 포함됩니다. 이러한 행동들은 서로 다른 공간적 규모에서 발생하며, 서로 다른 감각 자극에 반응하여 나타납니다. 각 행동 분석 장치에는 광유전학적 활성화를 위해 적색(~625 nm) LED가 장착되어 있습니다. 후각 자극에 반응하는 각성을 감지하기 위해 비행과 보행을 정량화합니다. 유인 또는 착륙을 분석하기 위해, 모기를 대형 아레나 내의 가열된 혈액 식사에 노출시킵니다. 구침 탐색과 혈액 섭취는 고해상도 비디오로 분석하여 부속 기관과 복부 크기 측정이 가능하도록 합니다. 본 프로토콜에서는 행동의 고해상도 시간적 정량화와 섭식의 종말점 측정을 가능하게 하는 머신 비전 모델을 설명합니다. 이러한 방법들은 유전적으로 접근 가능한 모기의 모든 신경세포군이 흡혈 행동에서 하는 역할을 테스트하는 데 사용될 수 있으며, 추가적인 행동 연구로 확장 가능합니다.

서론

모기는 그 사나움이나 힘이 아니라 질병 매개체로서의 효율성 때문에 세계에서 가장 위험한 동물 중 하나입니다. Anopheles 모기에 의해 전파되는 말라리아 원충은 매년 수십만 명의 사망자를 발생시키며, Aedes aegypti 및 Aedes albopictus는 황열, 뎅기열, 치쿤구니야, 지카 열 및 기타 많은 치명적인 질병의 확산을 유발합니다1. 모기는 남극 대륙을 제외한 모든 대륙에 분포하며 공중 보건에 큰 위협이 됩니다2. 흡혈 행동은 병원균을 직접 전파하지만, 알을 낳기 위해 척추동물의 혈액 섭취가 필수적이므로 이는 모기의  생애 주기에서도 핵심적인 단계입니다. 따라서 모기 매개 질병의 확산을 억제하려면 모기의 숙주 탐색 메커니즘을 이해하는 것이 필요합니다.

암컷 모기가 호스트를 찾기 위해 원거리 및 단거리 신호를 이용한다는 사실은 잘 알려져 있습니다3,4. 이산화탄소(CO2)는 인간의 호흡 시 배출되는 휘발성이 매우 강한 가스이며, 흔히 모기가 가장 먼저 감지하는 신호입니다. 이는 Aedes aegypti의 후각 감각 뉴런에서 CO2 수용체를 형성하는 Gr1, Gr2, Gr3 단백질에 의해 감지됩니다5. CO2 에 노출되면 이륙 및 비행 행동, 즉 활성화(activation)가 유도되며6,7, 이는 추가 자극이 없는 상태에서도 최대 10–15분 동안 지속될 수 있습니다8. CO2 는 피부 냄새와 시너지 효과를 일으켜 활성화와 유인 효과를 증폭시킵니다5,9. CO2 와 피부 냄새를 감지한 후, 모기는 열, 시각적 대비, 습도와 같이 더 가까운 거리의 추가 호스트 신호를 감지할 준비가 되며, 이러한 신호들은 모기가 혈액 섭취가 가능한 호스트에 착륙하도록 유도합니다5,10,11,12,13. 이러한 다각적인 감각 신호의 통합을 통해 모기는 효과적으로 호스트를 추적하고 찾아낼 수 있습니다.

암컷 모기가 잠재적 숙주에 내려앉으면, 모기는 피부 부위를 찾을 때까지 주둥이를 표면에 찔러 넣는데, 이 과정을 탐색(probing)이라고 한다14,15. 탐색 후, 스타일렛(stylet)이 피부를 뚫고 혈관을 찾아내며, 동시에 침을 주입하면서 혈액을 섭취함으로써 모기는 수 분 내에 자신의 체중을 두 배로 늘릴 수 있다16. 혈액은 중장으로 이동하며, 그곳에서 단백질이 소화되어 알 생산에 사용된다. 흥미롭게도, 숙주로부터 혈액을 가득 섭취하는 것이 반드시 병원체 확산에 필요한 것은 아니며, 탐색 과정만으로도 질병을 전파할 수 있다16,17. 따라서 흡혈 행동의 각 단계를 이해하면 암컷 모기의 숙주 탐색 및 흡혈을 방해하는 전략을 개발할 수 있으며, 궁극적으로 모기 매개 질병의 확산을 제어할 수 있을 것이다.

모델 생물체에서 신경 활성을 조절하기 위해 수많은 도구가 개발되었습니다. 초기 도구들은 상시적으로 작동하거나 열 활성화 방식이었습니다18,19,20,21. 이러한 유전적 시약들은 유용하지만 몇 가지 단점이 있습니다. 상시적 도구들은 발달 과정에 영향을 미쳐 신경의 회로 기능만이 아닌 다른 원인으로 인한 표현형을 유발할 수 있습니다. 모기는 체온을 이용해 숙주 척추동물을 식별하므로, 열 활성화 채널은 모기의 행동 연구에 특히 부적합합니다22,23. 행동 연구에서 광유전학(optogenetics)이란 특정 파장의 빛에 반응하는 유전적 도구를 사용하여 관심 있는 뉴런의 활성화를 조절하는 것을 의미합니다 . 이 기술은 생쥐의 갈증 가치(valence) 조사부터 Drosophila의 구애 행동 연구, 그리고 인체 임상 시험에서의 망막색소변성증으로 인한 시력 상실 회복에 이르기까지 이미 다양한 시스템에서 사용되었습니다24,25,26. 광유전학 채널은 광자를 흡수하여 특정 유형의 이온이 세포막을 통과하게 함으로써 뉴런을 활성화하거나 억제하는 방식으로 작동합니다. 유전자 변형된 빛 민감성 단백질 코딩 유전자를 생물체에 도입함으로써, 이 기술은 기존에는 조절이 불가능했던 특정 뉴런을 활성화하거나 억제하는 데 사용될 수 있습니다. 광유전학은 시간적 및 공간적 제어 측면에서 이점을 제공하며, 실험적 추론을 가능하게 하는 다양한 대조군 설정을 가능하게 합니다.

저자들은 최근 모기 행동 연구에 광유전학 도구를 최초로 사용한 사례를 설명했습니다8. 이러한 도구들은 적색광 활성 양이온 채널인 CsChrimson, 즉 적색 편이된 채널로돕신에 의존합니다27. CsChrimson을 포함한 미생물 옵신은 광자를 흡수하기 위해 화학적 보조인자인 all-trans 레티놀이 필요합니다28. CsChrimson은 tdTomato 형광 리포터와 융합되어 있으며 QF2/QUAS 이진 발현 시스템의 제어를 받으므로, 다양한 드라이버 라인과 유연하게 결합하여 사용할 수 있습니다29. CO2 감각 뉴런을 표적으로 하기 위해, CO2 수용체의 Gr3 서브유닛을 발현하는 뉴런에서 QF2 전사 인자를 발현하는 드라이버 라인이 사용되었습니다30. 모기는 적색광에만 노출되었을 때는 행동 반응이 최소한으로 나타났으며8, 또한 적색광은 생물학적 조직 투과력이 가장 뛰어나기 때문에 적색광 활성 옵신이 광유전학에 이상적입니다25.

본 논문은 광유전학적 자극과 결합하여 숙주 탐색 및 흡혈 행동의 서로 다른 측면을 측정하는 세 가지 분석법에 대한 프로토콜을 설명합니다(그림 1A). 먼저, 광유전학적 모기 라인을 사육하는 프로토콜이 제공됩니다. 두 번째 섹션에서는 모기가 온도 및 빛 자극에 노출되었을 때의 각성 및 탐침(probing) 상태를 추적하는 데 사용할 수 있도록 개조된 PCR 써모사이클러인 opto-thermocycler에 대해 설명합니다. opto-thermocycler 분석은 드라이버 균주를 사용하여 광유전학으로 신경 활동을 제어함으로써, 연장된 시간 범위에 걸쳐 이러한 탐색 행동을 측정하도록 설계되었습니다. 세 번째 섹션에서는 blood blanket 분석에 대해 설명하는데, 이 분석에서는 모기가 개조된 써모사이클러 바닥에 있는 얇은 인공 혈액 식사에 지속적으로 접근할 수 있어, 다양한 빛과 온도 조건에서 비행, 탐침 및 팽창(engorgement) 상태를 추적할 수 있습니다. opto-thermocycler를 기반으로 구축된 blood blanket 분석은 인공 혈액 식사에 대한 팽창 정도를 정량화하는 수단을 제공하여, 정밀하게 타이밍을 맞춘 광유전학적 및 열 자극을 통해 모기의 섭식 행동을 연구할 수 있게 합니다. 마지막 섹션에서는 opto-membrane feeder에 대해 설명하며, 여기서는 모기에게 캐니스터 내의 따뜻한 혈액 식사를 제공하여 빛 자극 노출 하에서 혈액원으로의 유인과 팽창 모두를 추적할 수 있습니다. opto-membrane feeder 분석은 자유 비행 시스템에서 숙주 탐색 및 흡혈의 전체 행동 시퀀스를 조사하는 데 사용됩니다. 각 분석의 예상 결과물 외에도, 분석 중 모기의 신체 부위를 추적하고 행동을 식별하기 위한 머신 비전 모델이 설명되어 있습니다. opto-thermocycler, blood blanket 및 opto-membrane feeder 분석을 통해 빛으로 신경 활동을 조절하면서 모기 흡혈 행동의 뚜렷한 단계들을 측정할 수 있습니다. 이러한 혁신적인 기술들은 모기의 신경 회로가 공중 보건에 위협이 되는 행동들을 어떻게 제어하는지 연구할 수 있게 해줍니다.

프로토콜

본 프로토콜에 사용된 모기는 외래 유전자를 포함하고 있으며, 미국 농무부(USDA) 규정에 따라 절지동물 격리 수준 II(Arthropod Containment Level II) 시설에서 사육해야 합니다32. 모기는 탈출을 방지하기 위해 격리하며, 생물학적 위험 폐기물로 처리합니다. 생물 안전 및 절지동물 격리 프로토콜은 예일 대학교 환경 보건 및 안전처(Yale Environmental Health & Safety)의 검토와 승인을 받았습니다. 본 연구는 인간 또는 동물 피험자를 사용하지 않았습니다. 모기의 유전형은 형광 마커(Gr3-QF2의 경우 3xP3-dsRed, QUAS-CsChrimson의 경우 3xP3-CFP) 또는 삽입된 컨스트럭트에 대한 PCR로 확인할 수 있습니다8. 본 연구에 사용된 모든 재료는 재료 표(Table of Materials)에 기재되어 있습니다.

1. 광유전학적 사육

  1. 실험 중 광유전학 라인의 반응을 극대화하기 위해 다음의 예외 사항을 적용하여 표준 프로토콜31에 따라 모기를 사육합니다.
  2. 동형 접합 Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson, 그리고 야생형 Liverpool 계통을 교배시켜 이형 접합 실험 라인인 Gr3-QF2/+, QUAS-CsChrimson/+, 및 Gr3>CsChrimson을 생성합니다.
  3. 28 °C 및 80% 습도로 설정된 차광 인큐베이터 내에서 14시간 청색광(450 nm), 10시간 암흑 주기로 모기를 기릅니다(그림 1B).
    참고: 청색광을 사용하면 CsChrimson과 같은 적색광 활성 채널의 활성화를 최소화할 수 있습니다. 인큐베이터 외부에서 수행되는 모든 사육 단계는 저조도 환경에서 진행해야 합니다.
  4. 우화 후 최소 1주일이 지난 성체 모기를 대상으로 실험을 시작합니다.
    참고: 행동 실험을 위한 이상적인 연령은 2~3주이지만, 우화 후 최대 4주까지의 모기를 사용할 수 있습니다. 대조군과 실험군 유전형은 동일한 연령이어야 하며, 우화 후 경과 일수로 기록합니다. 개체 연령을 표준화하기 위해 모든 알은 같은 날에 부화시켜야 합니다.
  5. 실험 2일 전, 교배되었으나 흡혈하지 않은 암컷 모기를 케이지에서 조심스럽게 흡입하여 4 °C에서 마취합니다. 깃털이나 흡입기를 사용하여 사용하는 분석법에 맞는 실험 용기로 조심스럽게 옮깁니다.
  6. -20 °C에 보관된 디메틸설폭사이드(DMSO) 내의 0.2 M all-trans retinal (ATR) 분액을 준비합니다. 용기 망에 적신 면심지를 통해 10% sucrose와 400 µM ATR을 공급합니다. 개체들은 암흑 상태에서 이 먹이를 1~3일 동안 섭취할 수 있습니다.
    참고: 청색광 하단이 아닌 암흑 상태에서 급여함으로써 ATR의 탈색을 방지합니다(그림 1B). 또한, 프로토콜의 모든 단계에서 모기는 움직이지 않을 때까지 4 °C에 5~10분 동안 노출시켜 마취했습니다. 각 실험이 끝난 후 모기는 -20 °C에 24시간 동안 노출시켜 안락사시켰습니다.
    주의: All-trans-retinal은 피부 및 눈에 접촉 시 심한 자극을 유발할 수 있습니다. 취급 시 실험복, 장갑, 보안경과 같은 적절한 개인 보호구(PPE)를 착용하십시오. 디메틸설폭사이드는 피부 접촉 시 흡수될 수 있는 가연성 액체이므로, 적절한 PPE 및 보안경을 갖추고 건조한 환경에서 취급해야 합니다. DMSO는 내화성 화학물질 보관 용기에 보관해야 합니다.
  7. 실험 1일(20~24시간) 전, sucrose 급이기를 증류수와 400 µM ATR이 포함된 새 급이기로 교체합니다. 개체들은 실험 전까지 암흑 상태를 유지합니다(그림 1B). 섹션 2, 3 또는 4로 진행합니다.
    참고: 반응률을 극대화하기 위해 실험은 모기의 주간 광주기에 맞춰 수행해야 합니다.

2. 광학-열순환기(Opto-thermocycler)

  1. 분석 구성 요소 조립
    1. 모기를 가두어 둘 수 있도록 아크릴 판을 제작합니다.그림 2). 다음을 참조하십시오. 그림 2A 다이어그램용으로, 그림 2B 전자 부품용으로, 및 그림 2C ~의 이미지에 대하여 아크릴 플레이트. 템플릿은 (https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0)의 파일을 참조하십시오.
      1. 벽면을 제작하려면, 3mm 두께의 아크릴 시트를 레이저 커팅하여 10cm x 1cm 직사각형 4개와 7cm x 1cm 직사각형 6개를 만듭니다. 각 단위가 17mm x 17mm x 10mm 크기의 챔버가 되도록, 아크릴 접착제를 사용하여 이 직사각형들을 5x3 행렬 형태로 부착합니다. 이 부품들의 템플릿은 “ 파일에 있습니다.14_동물_두꺼움_v3.ai”.
        ​주의: 아크릴 접착제는 가연성 물질이며 호흡기 및 눈에 자극을 유발할 수 있습니다. 아크릴 접착제를 취급할 때는 장갑, 실험복, 고글과 같은 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 착용해야 하며, 이 용제는 화기로부터 떨어진 환기가 잘 되는 곳에서 사용해야 합니다.
      2. 챔버 바닥면을 위해 1.5 mm 두께의 아크릴 판을 6.985 cm x 10.16 cm 크기로 자르고 오른쪽 하단 웰 부분을 제거하십시오. 덮개용으로 1.5 mm 두께의 아크릴 판을 6.985 cm x 10.16 cm 크기의 직사각형으로 자르십시오. 이 부품들의 템플릿은 “14_동물_박편_v3.ai”.
    2. UV 차단 검정색 메쉬 시트를 바닥면 아크릴 조각과 동일한 크기로 자릅니다.그림 2C메시를 플레이트 벽면과 바닥 조각 사이에 끼운 다음, 아크릴 접착제로 고정하십시오. 구멍이 막히지 않도록 우측 하단 웰에서 메시를 제거하십시오.
  2. 카메라와 LED를 고정할 프레임을 제작합니다 (그림 2A).
    1. 60.96 cm 길이의 25 mm 정사각형 광학 구성 레일을 사용하여 썰멀 사이클러(thermocycler)의 각 모서리에 네 개의 기둥이 있도록 프레임을 구축하십시오. 두 개의 22.86 cm, 25 mm 구성 레일을 사용하여 전면 우측 기둥과 후면 우측 기둥, 그리고 전면 좌측 기둥과 후면 좌측 기둥을 연결하되, 벤치로부터 30 cm 떨어진 지점에 설치하십시오.
    2. 전면의 좌우 기둥을 벤치에서 24 cm 높이에 설치된 30.48 cm, 25 mm 조립용 레일로 연결하고, 후면의 좌우 기둥을 벤치에서 42 cm 높이에 설치된 30.48 cm, 25 mm 조립용 레일로 연결하십시오.
    3. 프레임의 좌우측 구성 레일에 1피트 길이의 광학 포스트를 부착합니다. 서모사이클러의 PCR 블록 24cm 위에 직렬로 연결된 6개의 627nm(적색) LED를 각 포스트에 묶어 고정합니다.
      참고: CsChrimson의 활성이 정점에 이르는 빛의 파장은 ~590 nm이지만, ~625 nm 부근의 파장은 CsChrimson을 활성화하는 동시에 유전자 대조군에서 빛에 대한 행동 반응을 방지해야 하는 필요성 사이의 균형을 맞춥니다.27각 LED에 히트싱크와 렌즈를 테이프로 부착하여 빛이 서모사이클러 블록을 향하도록 초점을 맞춥니다.
    4. 30.48 cm 광학 포스트를 전면의 두 건설 레일 기둥 상단에 고정하십시오. 직각 클램프를 광학 포스트 중앙에 사용하여, 써모사이클러 블록 위쪽으로 안쪽을 향하는 15.24 cm 광학 포스트를 부착하십시오. 적외선 롱패스 필터가 장착된 카메라를 끝부분에 부착하여 블록 상단 40 cm 높이에서 아래를 향하도록 설치하십시오.
    5. 옵티컬 포스트를 사용하여 PCR 블록 주변에 직사각형 형태로 구성 레일에서 확장되는 프레임을 만들고, 표면보다 약간 높게 설치하십시오. 적외선 LED 스트립을 PCR 블록을 향하게 부착하여 카메라와 직각 방향으로 모기를 비추도록 하십시오.
      참고: 비디오 이미징에 사용되는 적외선 조명은 써모사이클러 표면이 24°C로 유지되므로 아레나를 측정 가능한 수준으로 가열하지 않습니다. °실험 전반에 걸쳐 C를 유지합니다.
    6. 주변광의 간섭을 방지하기 위해 구조물 위에 암막 커튼을 덮어줍니다.
    7. PCR 블록의 표면과 측면을 차광 테이프로 한 겹 둘러서, 어두운 배경의 평평하고 고른 표면을 만듭니다.
    8. 열전대 센서를 PCR 블록의 우측 하단 모서리에 배치하고 차광 테이프로 고정하십시오. 파워 미터를 사용하여 PCR 블록 전체에 빛이 균일하게 분포되는지 확인하십시오. 전원 공급 장치의 전압 또는 전류를 조정하여 12에서 빛이 조사되도록 하십시오. µW/mm2.
    9. PCR 블록의 가장자리에 적외선 LED를 배치하여 비디오와 자극 전달 출력을 동기화합니다.그림 2C). 카메라에 눈부심이 발생하지 않으면서 빛을 검출할 수 있도록 표면을 검은색 테이프로 덮으십시오.
    10. 다이어그램에 따라 열전대, 동기화 LED 및 적색 LED를 연결하십시오. 그림 2B필요한 소프트웨어(SpinView (버전 1.27.0.48), CoolTerm (버전 2.0.1), Arduino IDE (버전 1.8.12))를 다운로드하십시오. GitHub 저장소에서 Arduino 코드와 써모사이클러 프로그램을 다운로드하십시오.
      ​참고: Arduino 코드는 적색광, 체온 수준의 열, 그리고 이 두 자극의 조합을 제공하도록 프로그래밍되었습니다. 자극 순서가 무작위로 설정된 7개의 자극 프로그램이 리소스로 제공됩니다. 이는 서로 다른 자극을 제공하도록 수정할 수 있습니다. 실험당 자극은 총 9회로, 열 단독 자극 3회, 광 단독 자극 3회, 그리고 열과 광의 동시 자극 3회로 구성됩니다. 자극 제공은 Arduino가 열전대를 통해 PCR 블록의 표면 온도 변화를 감지한 후, 지정된 시간에 광 자극을 제공하는 방식으로 이루어집니다. 자세한 내용은 자극 프로그램 내의 주석에서 확인할 수 있습니다.
  3. 시험 준비
    1. 광유전학적 사육 프로토콜에 따라 모기를 사육하십시오. 섹션 1과 다음을 참조하십시오. 그림 1B.
    2. 실험 2일 전, 흡입기(aspirator)를 사용하여 암컷 모기 14마리를 별도의 용기에 옮깁니다. 단계 1.6에 따라 모기에게 ATR을 제공합니다. 여러 유전형을 비교하는 경우, 실험자가 이를 알 수 없도록 맹검 처리합니다.
      ​주의: 모기가 ATR을 투여받은 후에는 어두운 조명 아래에서 취급해야 합니다.
    3. 실험 전날(20-24시간 전), 아크릴 플레이트당 암컷 모기 14마리를 흡입하여 옮기고 4도에서 마취하십시오. °C. 깃털이나 흡입기로 모기를 한 마리씩 각 웰에 조심스럽게 넣습니다.
    4. 덮개가 고정되도록 아크릴 플레이트 측면을 스카치테이프로 테이핑하십시오. 테이프가 아크릴 플레이트의 상단이나 하단을 덮도록 접지 마십시오. 이는 카메라의 시야를 방해할 수 있습니다.
    5. 400 $\mu$L의 용액에 적신 3개의 면 심지 위에 아크릴 판을 놓습니다. µ증류수에 희석한 M ATR(단계 1.6 참조)을 병렬로 배치합니다. 세 개를 각각 정렬합니다. 심지(wick)에 행을 맞춰 배치하여 모든 모기가 물-ATR 용액에 접근할 수 있도록 합니다. 아크릴 플레이트를 암실 인큐베이터에 넣고 하룻밤 동안 보관하십시오.
  4. 시험 실시
    1. 카메라, LED 및 Arduino를 컴퓨터에 연결하십시오. 전원 공급 장치를 켭니다. 광-열순환기(opto-thermocycler) 표면을 70% 에탄올로 닦아낸 후 건조시킵니다.
      ​주의: 에탄올은 가연성 물질이며 심각한 안구 자극을 유발할 수 있습니다. 에탄올 취급 시 적절한 개인 보호구(PPE)를 착용해야 합니다. 또한, 모든 노출된 화염을 피하십시오.
    2. 암실 용기를 사용하여 모기가 담긴 아크릴 플레이트를 PCR 블록 중앙으로 옮깁니다. 광-열순환기(opto-thermocycler)를 차광 커튼으로 덮습니다.
    3. 컴퓨터에서 SpinView를 실행하십시오. 카메라 이름을 클릭하여 카메라 뷰를 엽니다. 적외선 조명을 연결하고 카메라 뷰에 PCR 블록과 아크릴 플레이트가 보이는지 확인하십시오.
    4. 필요한 경우, 아크릴 판이 정렬되고 중심에 위치하며, 아크릴 판의 오른쪽 하단 모서리에 열전대(thermocouple)가 보이도록 조정하십시오. 동기화 표시등이 프레임 안에 들어오도록 확인하십시오.그림 2C).
    5. 아크릴 플레이트가 선명하게 잘려나온 영상이 촬영되도록 카메라와 SpinView의 설정을 조정하십시오. 이미지 형식 탭을 조절하십시오. 너비, 높이, 오프셋 X, 및 Y 오프셋 아크릴 플레이트와 동기화 조명을 확인할 수 있도록 하는 옵션들입니다. 해당 설정 탭, 세트 획득 프레임 속도 활성화 ~로 / ~에게 / ~까지 참 그리고 획득 프레임 속도 ~로 / ~에게 / ~까지 30 초당 프레임 수(fps)
    6. 회전 노출 자동 조절 및 자동 이득 조절 끔. 다음을 조절하십시오. 노출 시간 및 이득 검은색 배경과 모기 사이의 명확한 대비를 만들기 위해 값을 설정하십시오. 우측 상단의 빨간색 녹화 버튼을 클릭하여 비디오 파일을 저장할 별도의 창을 엽니다.
    7. 팝업 창의 상단에서 파일 경로를 설정하십시오: 클릭 찾아보기실험 폴더로 이동하여 클릭하십시오. 새 폴더하고, 시험 이름으로 라벨을 지정하십시오. 기록할 프레임 수를 실험에 적합한 수(예: 43,500)로 설정하거나, 수동으로 기록을 중단하려면 0으로 설정하십시오.
    8. Videos 탭에서 다음 필드를 설정하십시오.비디오 녹화 유형: MJPG, 비디오 파일 분할 크기: 1000 MB, JPEG 압축 품질: 65. ‘ 을(를) 엽니다.광열_광열_무작위1써모사이클러(thermocycler)에서 프로그램을 선택하고 시작하십시오. 써모사이클러는 25℃ 유지 단계(hold step)에서 시작되어야 합니다. °C.
    9. 매칭 프로그램을 엽니다, ‘TC_optothermo_lightheat_random1.inoArduino IDE에서 ', ardından 보드에 업로드하십시오. 시리얼 모니터를 열어 온도가 약 25도인지 확인하십시오. °C.
    10. Arduino IDE의 시리얼 모니터를 닫으십시오. Arduino 시리얼 모니터 출력을 수집하기 위해 CoolTerm을 엽니다. 시리얼 포트와 채널이 Arduino IDE에서 설정한 것과 일치하는지 확인하십시오. CoolTerm 창에 출력이 표시되기 시작합니다.
    11. Arduino 출력 내용을 텍스트/바이너리 파일로 기록하기 시작하십시오. Spinview에서 비디오 녹화를 시작하십시오. 클릭하십시오. 재개 써모사이클러의 홀드(hold) 상태를 종료하십시오. CoolTerm에서 Arduino 출력을 확인하여 온도가 18도까지 떨어지는지 확인하십시오. °C이며 자극 카운터가 1로 증가하여 시험이 시작됩니다. 시험이 완료될 때까지 분석을 계속 진행하십시오.
  5. 정리 및 세척
    1. 비디오 녹화와 CoolTerm 출력 수집을 중단하십시오. 두 프로그램 모두 종료합니다. 써모사이클러 프로그램을 종료하십시오. 써모사이클러에서 모기들이 담긴 아크릴 플레이트를 꺼내 -20°C에 보관하십시오. °모기들을 안락사시키기 위해 하룻밤 동안 영하의 냉동고에 보관합니다.
      ​주의: 형질전환 모기를 안락사시킬 때는 반드시 -20℃ 상태를 유지하십시오. °사멸을 확실히 하기 위해 생물안전 위험 폐기함에 버리기 전 최소 24시간 동안 C 환경에 둔다.
    2. 다른 시험을 시작하려면 섹션 2.3을 반복하십시오. 카메라와 Arduino 케이블의 연결을 해제하십시오. 전원 공급 장치를 끕니다. 적외선 LED의 연결을 해제하십시오. 스카치 테이프를 제거하고 죽은 모기들을 폐기하여 아크릴 판을 세척하십시오.
    3. 뚜껑과 아크릴 플레이트에 70% 에탄올을 분사하고, 장갑을 낀 손가락으로 웰과 메쉬의 모든 측면을 조심스럽게 닦아냅니다. 탈이온수로 충분히 헹군 후, 긁힘을 방지하기 위해 뚜껑 사이에 종이 타월을 끼워 아크릴 플레이트를 쌓아 보관합니다.

3. 혈액 블랭킷 분석(Blood blanket assay)

  1. 어세이 구성 요소 조립 (그림 3)
    1. 섹션 2.1에 기술된 대로 광-써모사이클러(opto-thermocycler) 어세이를 구성한다. 어세이 (그림 3A), 열 자극 (그림 3B), 알루미늄 플레이트 (그림 3C) 그림을 참조한다.
    2. 그림 3C와 같이 알루미늄 혈액 식사 공급 플레이트를 제작한다.
      1. 레이저 커터 또는 워터젯 커터를 사용하여 플레이트의 상단과 하단을 제작한다. 0.8 mm 두께의 알루미늄 시트를 90 mm x 134 mm 크기로 절단하여 플레이트 하단을 제작한다. 1.6 mm 두께의 알루미늄 시트를 90 mm x 134 mm 크기로 절단하여 상단을 제작한다. 상단 플레이트에 15개의 직사각형 구멍(17.2 mm x 18.6 mm)을 뚫는다. 템플릿 파일은 blood blanket GitHub 저장소(https://github.com/sorrellslab/bloodblanket)의 ""Aluminum plate templates"" 항목에서 확인할 수 있다.
      2. 누수를 방지하기 위해 알루미늄 부품 사이에 얇은 실리콘 가스켓(0.5 mm 두께)을 끼운다. 알루미늄 상단의 모양에 맞춰 레이저 커터로 절단한다.
      3. 8개의 0.47625 cm 돔형 육각 4-40 표준 볼트로 층을 결합한다. 포밍 탭을 사용하여 금속 부품에 볼트용 나사산을 만든다. 써모사이클러 블록 위에 놓았을 때 안정성을 높이기 위해 플레이트 하단에 원형 및 "W" 와셔를 통해 연결한다.
    3. GitHub 저장소(https://github.com/sorrellslab/bloodblanket)에서 blood blanket 어세이용 Arduino 코드와 써모사이클러 프로그램을 다운로드한다.
    4. 25 mM NaHCO3에 녹인 20 mM ATP 분액을 준비하여 사용 전까지 -20 ˚C에 보관한다.
      ​참고: ATP 용액은 6개월마다 새로 준비한다. 반복적인 동결-해동 사이클을 피한다. 1 M NaHCO3 및 5 M NaCl을 준비한다(각각 실온 보관). NaHCO3 용액은 7일 동안만 안정적이다.
  2. 실험 준비
    1. 섹션 1 및 2.2에 기술된 대로 모기를 사육하고 아크릴 플레이트로 옮긴다. 서로 다른 유전자형 간의 비교를 수행하는 경우, 실험자가 알 수 없도록 블라인드 처리한다.
    2. 실험 당일에 탈이온수 8.83 mL에 20 mM ATP 750 µL, 5 M NaCl 220 µL, 1 M NaHCO3 표준 용액 200 µL를 첨가하여 10 mL의 최소 인공 혈액 식사(110 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, 1.5 mM ATP)를 준비한다. 뒤집어서 완전히 섞는다.
      참고: 각 실험 전에 인공 혈액 식사를 새로 만든다.
    3. 단계 2.3.4에서 2.3.8에 따라 SpinView 기록 설정을 수행한다.
    4. 실험을 위해 “Red-light-Only__BB_.ino” Arduino 파일(또는 원하는 자극 파일)을 연다.
  3. 시행 수행
    1. 플레이트의 각 웰에 최소 인공 혈액 식사 650 µL를 피펫팅하며, 넘치지 않게 각 웰을 완전히 채운다.
    2. 10.2 cm x 10.2 cm 크기의 파라필름 정사각형을 20.3 cm 직경의 링 위에 펼친다. 파라필름을 플레이트 위에 덮고 가장자리가 밀착될 때까지 누른다. 메스로 플레이트 주변에 1.3 cm 너비의 테두리를 다듬고 남은 파라필름을 아래로 밀어 넣어 혈액 식사를 밀봉한다.
    3. 최대 열전달이 가능하도록 플레이트를 PCR 블록 위에 직접 놓는다 (그림 3A).
      참고: 광-써모사이클러의 경우 PCR 블록 표면에 차광 테이프를 사용하지만, blood blanket의 경우에는 사용하지 않는다.
    4. 알루미늄 플레이트의 오른쪽 하단 모서리 파라필름 표면에 열전대를 배치한다. 카메라, LED 및 Arduino를 컴퓨터에 연결한다. 전원 공급 장치를 켠다. 써모사이클러에서 “BB_thermocycler_program.x50prog” 프로그램을 시작한다.
      참고: 온도 변화 속도는 써모사이클러의 최대 램프 속도로, 모기가 섭식을 위해 숙주에 착륙하는 상황을 가장 잘 모방하도록 선택되었다.
    5. 빛 노출을 최소화하기 위해 어두운 용기를 사용하고 실내 조명을 낮춘 상태에서, 모기가 담긴 아크릴 플레이트를 알루미늄 플레이트로 옮겨 각 웰이 모기와 정렬되도록 한다. 열전대가 플레이트의 오른쪽 하단 모서리에 위치하여 파라필름과 접촉해 인공 혈액 식사의 온도를 측정하고 있는지 확인한다.
    6. Arduino IDE에서 “Red-light-Only__BB_.ino” 프로그램을 다시 업로드하여 프로그램을 시작한다. 시리얼 모니터를 닫는다. CoolTerm에서 Connect를 눌러 현재 온도를 확인한다. 이 시작 온도를 기준으로 Arduino 스크립트의 트리거 온도를 이보다 약 0.6 °C 낮게 조정한다.
    7. CoolTerm 창에서 Capture to Text/Binary File을 선택하고 데이터 수집을 시작한다. SpinView의 기록 창에서 비디오 녹화를 시작한다. Resume을 클릭하여 써모사이클러의 대기 상태를 종료한다. CoolTerm의 Arduino 출력을 통해 온도 저하가 감지되고 시행이 시작되었는지 확인한다.
    8. 시행 시간이 종료되면 Stop Recording을 클릭한다. CoolTerm의 Capture to Text/Binary File 탭에서 시리얼 출력 기록의 Stop을 선택한다.
    9. 모기가 담긴 플레이트를 blood blanket 플레이트에서 제거하여 저온실로 옮겨 마취시킨다. 인공 혈액 식사를 섭취하여 복부가 팽창한 모기의 수를 세어 섭식(engorged)으로 간주하며, 부분적으로 섭식한 모기도 포함한다.
    10. 시행 사이에 70% 에탄올을 적신 Kimwipe로 PCR 블록 표면을 닦아 세척한다. 파라필름을 제거하고 알루미늄 플레이트를 탈이온수로 헹군다. 추가 시행을 위해 섹션 3.3을 반복한다. 일주기 활동 주기의 영향을 최소화하기 위해 날짜별로 시행 순서를 회전시킨다.
  4. 정리
    1. 모든 프로그램의 기록을 중단하고 종료한다. 카메라, Arduino 및 적외선 조명의 USB 코드를 뽑는다. 컴퓨터를 끈다. 써모사이클러에서 실행 중인 “thermocycler_program.x50prog” 프로그램을 중단한다.
    2. 모기 플레이트를 -20 °C 냉동고에 하룻밤 동안 보관하여 모기를 살처분한다. 알루미늄 플레이트를 탈이온수로 세척한다. 아크릴 플레이트에 70% 에탄올을 뿌린 후 탈이온수로 헹구고, 모기를 새로 넣기 전 하룻밤 동안 말린다.
      참고: 세척 후 플레이트를 하룻밤 동안 말려 수분이 남아 있지 않도록 해야 한다. 수분이 있으면 뚜껑에 결로가 생겨 비디오 촬영에 방해가 된다.

4. 광-막 공급기 분석(Opto-membrane feeder assay)

  1. 어세이 구성 요소 조립 (그림 4)
    1. 광학-기계 부품과 30.48 cm x 30.48 cm 크기의 검은색 0.635 cm 두께 아크릴 플랫폼. 레이저 커터를 사용하여 아크릴 중앙에 지름 11.43 cm의 구멍을 뚫는다. 아크릴이 바닥면에서 약 23.495 cm 높이에 있는 프레임 지지대 위에 놓일 수 있도록 각 모서리에서 2.54 cm 떨어진 곳에 구멍을 뚫는다.
    2. 중앙에 내경 19.05 cm, 외경 20.32 cm의 검은색 아크릴 링을 부착합니다.그림 4A). 모든 아크릴 부품의 템플릿은 Arduino 프로그램과 함께 opto-membrane feeder GitHub 저장소(https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)에 있습니다. 전체 구성은 그림을 참조하십시오 (그림 4A), 자극 (그림 4B), 회로도 (그림 4C), 그리고 비디오 정지 이미지 (그림 4D).
      ​참고: 본 플랫폼 구축에 사용된 특정 재료가 결정적인 것은 아니므로, 더 경제적인 대안을 사용할 수 있습니다.
    3. 적외선 롱패스 필터(infrared long-pass filter)가 장착된 카메라를 중앙 구멍 아래에 설치하여 모기 캐니스터를 향해 위쪽으로 조준합니다. 조리개를 완전히 개방하여 캐니스터 상단의 메쉬 부분에 선택적으로 초점이 맞도록 조절합니다.그림 4A).
    4. 캐니스터를 제작하려면 직경 11.43 cm의 투명 폴리카보네이트 튜브를 12.7 cm 길이의 원통형 세그먼트로 절단하십시오.
      1. 0.3175 cm 두께의 아크릴에서 직경 11.43 cm의 원형 조각을 레이저 커팅하여 캐니스터의 바닥면을 제작하십시오. 원형 조각의 가장자리는 튜브 안으로 삽입될 수 있도록 레이저로 식각합니다. 플라스틱 에폭시를 사용하여 튜브에 부착하십시오.
      2. 0.635cm 및 0.3175cm 두께의 검은색 아크릴과 UV 차단 검은색 메쉬를 사용하여 인셋 리드(inset lid)를 제작하십시오. 내부 링의 직경은 10.795cm, 외부 링의 직경은 12.065cm이며, 작은 링 위에 검은색 메쉬를 팽팽하게 덮어야 합니다. 메쉬는 왁스사를 사용하여 레이저로 뚫은 구멍을 통해 꿰매어 고정하십시오.
        ​참고: 비디오 녹화가 이루어지는 아크릴 바닥면에 긁힘이 발생하는 것을 방지하기 위해, 캐니스터는 항상 페이퍼 타월 위에 놓아야 합니다.
    5. 혈액 식이 제공용 아크릴 용기 제작 (그림 4A).
      1. 0.15875 cm 두께의 투명 아크릴에서 내경 5.08 cm, 외경 6.6 cm의 링을 절단하십시오. 이를 아크릴 접착제를 사용하여 내경 5.842 cm, 외경 6.604 cm의 다른 투명 링에 부착하십시오.
      2. 높이 13.97cm, 직경 19.05cm의 금속 메시 실린더를 플랫폼 중앙에 있는 검은색 아크릴 링 내부에 배치하십시오.
      3. 금속 메쉬 내부에, 캐니스터 외벽에서 3.81cm 떨어진 간격으로 RGB LED 조명 코일을 부착하며, 이는 검은색 아크릴 플랫폼 위에 놓인 Arduino Uno 보드에 의해 제어됩니다.그림 4C).
      4. 파워 미터를 사용하여 실린더 내부 전체의 빛 강도를 측정하고, 아레나가 3.5~6 사이로 조명되도록 조명의 위치를 조정하십시오. µW/mm2금속 망 바깥쪽에 850 nm 적외선 LED 링을 케이블 타이를 사용하여 프레임에 고정하고, LED가 안쪽을 향하게 합니다.
    6. USB 케이블을 Arduino Uno 보드에 연결하고 컴퓨터에 연결하십시오. 카메라의 USB 케이블을 컴퓨터에 연결하십시오. 인터넷 연결을 해제하십시오.
    7. 광막 구조체를 26°C의 암실 인큐베이터 또는 환경 제어실에 배치하십시오. °실험 기간 동안 섭씨 C 및 상대 습도 80%를 유지하였다.
  2. 모기 캐니스터 준비하기
    1. 실험 전, 70% 에탄올을 분사하고 부드러운 스펀지로 살살 닦아 모기 캔리스터를 세척하십시오. 탈이온수로 캔리스터를 헹군 후 하룻밤 동안 자연 건조하십시오.
    2. 실험 2일 전, 저온 마취 상태에서 암수 모기를 분류하여 캐니스터당 암컷 20마리씩 넣습니다. 단계 1.6에 따라 ATR에 접근할 수 있도록 합니다.
    3. 이 시점에서 실험자는 유전자형을 알 수 없도록 블라인드 처리해야 합니다. 실험 시간에 따른 행동 결과의 차이를 최소화하기 위해 일자별로 시험 순서를 교대로 변경해야 합니다.
  3. 시험 실행
    1. 혈액식을 준비하려면, 45도 각도의 119 mL 물 병을 배치하십시오. °각 실험당 하나씩 C 항온수조를 준비합니다. 이 부피와 온도는 실험 전 과정 동안 혈액 식이가 체온과 유사하게 유지되도록 합니다.
    2. 탈피브린 양 혈액을 5 mL씩 소분하여 준비하십시오. 4℃에서 보관하십시오. °사용 전 분리가 일어나지 않도록 C와 섞어 뒤집어 줍니다. 매 실험 전 신선한 혈액식을 준비하십시오.
      주의: 병원체 노출을 최소화하기 위해 적절한 개인 보호구(PPE)를 착용한 상태에서 탈섬유소 양혈을 취급하십시오. 혈액과 접촉한 재사용 가능 재료는 10% 표백제에 담근 후 탈이온수(DI water)로 헹궈내야 합니다. 표백제는 피부와 눈에 심한 자극을 일으킬 수 있으므로, 취급 전 과정 동안 적절한 개인 보호구를 착용해야 합니다.
    3. 첫 번째 혈액 분취량을 45 °실험 전 최소 20분 동안 °C 항온 수조(heat bath)에서 가온하십시오. ATP를 얼음 위에서 해동하십시오. 5.08 cm x 아크릴 뚜껑의 더 크고 평평한 원이 있는 쪽에 5.08 cm 정사각형의 파라필름을 덮어 혈액 식사를 위한 웰(well)을 만듭니다.그림 4A).
    4. 사람의 냄새를 제거하기 위해 컴퓨터를 70% 에탄올로 닦으십시오. 컴퓨터를 외장 하드 드라이브에 연결하십시오. 카메라와 Arduino를 연결하십시오. RGB 및 적외선 조명을 전원에 연결하십시오.
    5. SpinView 소프트웨어와 해당 자극에 맞는 Arduino 파일을 엽니다. 실험 데이터를 저장하기 위해 외장 하드 드라이브에 폴더를 생성합니다. 다음을 업로드하십시오: “blue_only.ioRGB LED를 통해 아레나에 471 nm의 희미한 청색광을 제공하기 위한 Arduino 파일 (다음과 같이 그림 4B).
    6. 모기에게 과도한 CO2에 노출시키지 않고2 호흡을 멈춘 후, 시험용 캐니스터를 검사하여 실험 전 사망한 개체가 있는지 기록하십시오. 캐니스터를 중앙에 배치하고, 자극 노출 전 10분에서 20분 동안 어두운 청색광 아래에서 순응시키십시오.
      ​참고: 완전한 암흑 상태에서는 모기의 비행이 억제되므로, 순화 단계와 실험은 어두운 청색광 아래에서 진행합니다.
    7. 비디오 캡처 활성화
      1. SpinView 프로그램에서 카메라를 선택하십시오. 설정 탭에서 밝은 색의 곤충과 어두운 배경 사이에 높은 대조가 유지되도록 노출과 게인을 필요에 따라 조정합니다.그림 4D).
      2. 상단 바의 빨간색 녹화 버튼을 클릭하여 비디오 캡처 설정을 조정하십시오. 다음을 클릭하여 파일 경로를 설정하십시오. 둘러보기그 다음 외부 하드 드라이브로 이동하십시오. 각 실험별로 식별 가능한 이름의 새 폴더를 생성하십시오. 이때 폴더 이름에 공백을 포함하지 마십시오.
      3. ~에서 저장 옵션 탭, 선택 0 프레임 캡처, 이를 통해 수동으로 중지할 때까지 비디오 녹화가 가능합니다. 다음의 녹화 모드선택하십시오 완충된Videos 탭에서 다음 필드를 설정하십시오. 비디오 녹화 형식: MJPG, 비디오 파일 분할 크기: 1000 MB, 그리고 JPEG 압축 품질: 65.
    8. 자극 노출 직전에 500을 피펫으로 취하여 µ준비된 5 mL 혈액 분주액에 최종 농도가 2 mM ATP가 되도록 20 mM ATP 500 $\mu$L를 넣습니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어 줍니다.
    9. ATP-혈액 용액을 혈액 급이 용기에 붓습니다. 혈액 급이물 위에 45mL가 채워진 119mL 병을 거꾸로 세워 놓습니다. °실험 전 과정 동안 혈액의 온도를 인체 온도와 유사하게 유지하기 위해 C water를 사용합니다.
    10. SpinView 소프트웨어에서 Start Recording을 선택하십시오. 모기에게 호흡으로 자극을 주지 않은 상태에서, 모기가 망을 통해 파라필름(parafilm) 막을 뚫고 흡혈할 수 있도록 캐니스터의 망 뚜껑 위에 혈액식을 배치하십시오.
    11. 업로드 그것 아두이노 프로그램 ~을 위한 / ~용으로 “1sON_10sOFF.io” (그림 4B), 또는 원하는 자극을 설정하십시오. 이렇게 하면 “까지 10초마다 1초 동안 624nm 적색광이 조사됩니다.blue_only.io" 파일이 수동으로 업로드됩니다. 624 nm의 파장은 CsChrimson을 광유전학적으로 활성화하기에 충분합니다.
    12. 다음 실험을 위해 혈액 분주액을 항온수조에 넣으십시오. 15분 동안 실험을 진행한 후, 선택하십시오. 녹화 중지“를 업로드하십시오.blue_only.io적색광 자극을 중단하기 위해 ” 파일을 사용하십시오.
    13. 흡혈 홀더와 물통을 제거하십시오. 캐니스터를 제거하고 4°C에서 모기들을 마취시키십시오. °C. 추가 시험을 수행하려면 4.3절로 돌아가십시오. 마취된 모기의 복부가 혈액으로 채워졌는지 육안으로 확인하여 흡혈한 모기의 수를 결정하고 기록하십시오.
  4. 정리 및 세척
    1. 모든 프로그램을 종료하십시오. 외장 하드 드라이브를 꺼내고 컴퓨터에서 연결을 해제하십시오. 컴퓨터 전원을 끄십시오.
    2. 단계 4.2.1에서 이전에 설명한 대로 모기 캐니스터를 세척하십시오. 아크릴 혈액 공급 홀더를 세척하십시오. 하프 사이즈 폴리카보네이트 팬의 2/3까지 물을 채운 후, 표백제 100mL를 첨가하십시오.
    3. 아크릴 혈액 식사 홀더와 플라스틱 병을 팬에 넣으십시오. 덮개로 덮고 10분 동안 담가 두십시오. 표백제로 헹구고 파라필름을 제거하십시오. 부드럽게 문지른 후 헹구어 혈액 잔여물을 모두 제거하십시오.

5. 행동 분석

  1. ffmpeg(버전 8.0.1)를 사용하여 비디오를 .mp4 파일로 압축함으로써 분석 준비를 합니다. 비디오 파일이 분할되어 있는 경우, 임의의 비디오 편집 소프트웨어를 사용하여 하나의 비디오로 병합합니다. SLEAP(버전 1.4.1)에서 학습용 비디오를 그레이스케일(grayscale) 모드로 엽니다.
    ​참고: 비디오 녹화 설정이 적절하다면 모든 대상이 프레임 안에 들어와야 하며, 움직이는 모기 잔상이 흐릿하게 나타나지 않아야 합니다. 다른 신체 부위 추적 소프트웨어를 사용할 수도 있습니다. 본 논문에서 사용된 SLEAP 버전은 1.4.1입니다. 최신 프로토콜은 SLEAP 문서를 참조하십시오.
  2. 평가 중인 행동에 따라 동물의 관련 부위를 표시한 골격을 작성하십시오 (그림 2D, 그림 3D, 그리고 그림 4E).
  3. “를 사용하여무작위 프레임" 옵션 하위의 권장 프레임 탭을 사용하여 무작위로 10개의 프레임을 선택하고, 각 모기를 인스턴스로 레이블링합니다. 모기의 특정 부위가 가려진 경우(예: 탐침 시 구강의 끝부분이 메시 내부로 삽입된 경우), 해당 신체 부위의 대략적인 위치를 레이블링합니다. 이 설정으로 레이블링된 프레임을 사용하여 모델을 학습시킵니다.
    1. 탑다운(Top-Down) 다중 동물 모델(옵토-써모사이클러 및 혈액 담요 모델에 사용됨)의 경우: 훈련 파이프라인 탭, 세트 최대 인스턴스 수 ~로 / ~까지 / ~에게 14Centroid Model Configuration 탭에서 다음과 같이 설정하십시오. 크롭 크기 ~로 / ~에게 / ~까지 자동, 그리고 설정합니다 플라토 최소치. 델타 ~로 / ~에게 / ~하기 위해 1e-04, 세트 플래토 페이션스(Plateau Patience) ~로 / ~까지 / ~하기 위해 10, 세트 보폭 ~로 / ~에게 / ~하기 위해 8, 그리고 그 앵커 부품 ~로서/ ~에 따라 흉부.
    2. Bottom-Up 다중 동물 모델의 경우(Opto-membrane 피더에 사용됨): 다음의 훈련 파이프라인 탭, 세트 최대 인스턴스 수 ~로 / ~에게 / ~하기 위해 최대치 없음Bottom-Up 모델 구성 탭에서 다음과 같이 설정하십시오. 크롭 크기 ~로 / ~에 / ~까지 자동, 그리고 설정하십시오 최소 고원치. 델타 ~로 / ~에게 / ~하기 위하여 1e-04, 세트 플래토 페이션스(Plateau Patience) ~로 / ~까지 / ~에게 10및 설정하십시오 보폭 ~로/으로 16.
  4. 다음 설정으로 정해진 수의 프레임에 대해 예측을 수행합니다: Inference Pipeline 탭에서 opto-thermocycler 및 blood blanket의 설정을 다음과 같이 지정합니다. 최대 인스턴스 수 ~로 / ~에게 / ~까지 14, 트래커 ~로 / ~에 / ~하기 위해 단순함, 최대 트랙 수 ~로/에게/까지 14, 그리고 단일 가닥 절단 연결 ~로 / ~에게 / ~하기 위하여 참.
  5. 광학 막 공급기(opto-membrane feeder)를 위해 다음과 같이 설정하십시오. 최대치 없음 ~을 위한 / ~용으로 최대 인스턴스 수 및 최대 트랙 수, 트래커 ~로/에 (또는 '~하기 위해') 간단한, 그리고 단일 가닥 절단 연결 ~로 / ~에게 / ~하기 위하여 참예측된 프레임을 수정하고 재학습시키십시오. 훈련 데이터 세트에 대해 예측, 레이블링, 학습 과정을 반복하십시오.
    참고: 검증은 레이블링된 프레임을 무작위로 스폿 체크하고 일관된 오류(예: 모기 오검출, 중복 예측, 잘못된 방향 또는 신체 부위의 잘못된 할당)를 식별함으로써 수행되었으며, 이러한 엣지 케이스가 포함된 프레임에 집중하였습니다. 오류 빈도에 따라 최대 150개의 레이블링된 프레임이 필요할 수 있습니다. SLEAP은 추가적인 모델 검증을 위해 GUI 기반의 평가 지표 또한 제공합니다. 시각적 검토를 통해 정확도와 정밀도가 충분함이 확인되면, 모델을 실험 영상에 적용하고 행동 분석을 위해 결과를 .csv 또는 .h5 파일로 내보냅니다. 이후 앞서 설명한 바와 같이 포즈 추정 출력값을 사용하여 행동 분류기를 학습시킬 수 있습니다.8행동은 다음과 같이 정의됩니다: 보행(walking)은 다리 움직임을 동반한 신체의 병진 운동, 비행(flying)은 날개를 펼친 상태에서의 빠른 병진 운동, 그루밍(grooming)은 신체 부위(더듬이, 소관, 날개 또는 다리)를 대상으로 하는 반복적인 다리 움직임, 그리고 탐색(probing)은 용기 바닥의 메시(mesh)를 통해 소관을 삽입하는 행위입니다. 행동 분류기는 다음을 달성해야 합니다. >사람의 주석(annotation)과 비교하여 90%의 정확도를 보임.
  6. 데이터가 일반적으로 정규 분포를 따르지 않으므로, 비모수 검정을 선택하여 통계 분석을 수행합니다. 다중 비교 보정을 적용하여 적절한 사후 검정을 수행하십시오. 흡혈 데이터의 경우 실험 반복구는 모기 집단이며, 행동 데이터의 경우 반복구는 개별 모기입니다.

결과

그림 1A에 나타낸 바와 같이, 모기의 숙주 탐색 및 흡혈 행동을 관찰하기 위해 세 가지 행동 분석법이 사용되었다. 생체 리듬을 동기화하여 각성 기간 동안 실험을 수행할 수 있도록 모기를 청색광-암흑 주기(14:10 LD; 그림 1B) 하에서 사육하였다. 실험 이틀 전, 모기들을 완전한 암흑 상태로 옮기고 옵신 보조인자인 ATR을 공급하였다. 모기가 비동기 상태이거나 ATR이 공급되지 않은 경우, 행동 분석에서 낮은 활성을 보이게 된다. 각 분석에 사용된 유전자형은 Gr3>CsChrimson와 두 가지 유전적 대조군인 드라이버 라인 Gr3-QF2 및 이펙터 라인 QUAS-CsChrimson였다.

광-열 사이클러 분석(섹션 2)을 통해 열 및 빛 자극에 반응하는 모기의 각성과 탐침 행동을 장기간 평가할 수 있습니다. 열 전달은 모기가 온혈 숙주에게 접근하는 것을 모방하며, 5초간의 빛 전달은 숨을 길게 내뱉는 것을 모방합니다33. 열 사이클러를 사용하면 열전대와 마이크로컨트롤러를 통해 광유전학적 활성화와 동기화된 신속한 표면 가열 및 냉각이 가능합니다(그림 2A, B). 세 가지 모기 유전형을 바닥이 메쉬로 된 격리된 웰이 있는 아크릴 플레이트에 배치하여 걷기, 비행 및 탐침 행동을 관찰했습니다(그림 2C). 모기 신체 부위의 위치는 SLEAP34 및 DeepLabCUT35와 같은 포즈 추적 알고리즘을 사용하여 검출했습니다(그림 2D, E). 행동 분류 알고리즘은 포즈 추적(예: SimBA36, A-SOiD37) 또는 비디오(예: FERAL38) 입력을 통해 사용할 수 있습니다. 그림 2E는 필수적인 숙주 탐색 및 섭식 행동인 비행, 걷기 및 탐침 중의 SLEAP 레이블을 보여줍니다. 이러한 행동은 흉부의 속도와 구침의 기부와 끝단 사이의 거리로 분류할 수 있습니다. 여기에서는 APT 및 JAABA를 이용한 행동 추적 결과가 표시되어 있습니다39. 모기를 열 증가, 빛 자극, 또는 열과 빛 자극 모두에 동시에 노출시킨 후, 다음 자극 전까지 20분간의 휴지기를 두었습니다8 (그림 2F). 열에 노출되었을 때 세 가지 유전형 모두 짧은 기간 동안 탐침 행동을 보입니다(그림 2G). 중요한 점은, 5초간의 빛 자극에 노출되었을 때 Gr3>CsChrimson 모기가 각성 또는 "활성화"되어 최대 10–15분 동안 걷기와 비행 행동이 증가한다는 것입니다. 모기는 또한 플레이트의 메쉬 바닥에 구침을 반복적으로 삽입하는 것으로 정의되는 탐침 행동을 보입니다. 데이터는 개별 모기의 행동(그림 2G)과 시간 경과에 따라 각 행동을 보이는 모든 모기의 비율(그림 2H)로 도식화되었습니다. 광-열 사이클러는 여러 개체에 대해 반복적이고 정밀한 광유전학 및 열 자극을 가능하게 하여, 각성과 탐침 행동을 연구하는 데 유용한 도구가 됩니다.

혈액 블랭킷 분석(Section 3)은 광-열 사이클러(opto-thermocycler) 분석을 기반으로 구축되었으나, 모기의 흡혈량을 정량화할 수 있도록 기호성이 좋은 인공 최소 혈액식을 제공합니다(Figure 3A). CO2 감각 뉴런을 광유전학적으로 활성화하기 위해 5초 동안 적색광(~627 nm) 펄스를 조사하였으며, 얇은 인공 혈액식 층을 25 °C에서 ~35 °C까지 가열하였습니다(열전대로 표면 온도 측정; Figure 3B). 세 가지 유전자형의 모기를 각각 알루미늄 급이 플레이트에 담긴 인공 혈액식에 노출시켰습니다(Figure 3C). Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson, 그리고 Gr3>CsChrimson 모기(유전자 그룹당 n = 10회 반복, 각 14마리)를 각각 알루미늄 급이 플레이트의 인공 혈액식에 노출시켰습니다(Figure 3C). 실험 전반에 걸쳐 모기의 시간에 따른 흡혈량을 측정하기 위해, SLEAP을 사용하여 모기 몸체의 지점들을 추적하였습니다. 이는 모기의 복부에 5개의 노드를 포함하는 스켈레톤을 생성함으로써 수행되었습니다(Figure 3D). 각 반복 실험이 끝날 때마다 흡혈한 모기의 수를 수동으로 계산하였습니다. 대조군 모기 라인인 Gr3-QF2와 QUAS-CsChrimson은 유사한 평균 흡혈량을 보였습니다(Figure 3E, p = 0.401). 반면, Gr3>CsChrimson 라인은 평균 53%의 흡혈률을 기록하며 유의미하게 높은 섭식률을 보였습니다(Figure 3E, Gr3-QF2 대비 p = 0.00078, QUAS-CsChrimson 대비 p = 0.00097). 데이터는 바이올린 플롯과 박스 플롯(중앙값, 사분위 범위 및 범위)으로 도식화하였으며, p < 0.05의 유의 수준에서 Kruskal-Wallis 검정과 Holm 보정을 적용한 Dunn 검정을 사용하여 분석하였습니다. 개별 개체의 시간에 따른 흡혈량은 5개의 노드로 둘러싸인 복부 면적의 변화로 식별하였습니다(Figure 3F). 이러한 결과는 혈액 블랭킷 분석이 CO2 반응성 뉴런 집단의 광유전학적 활성화가 인공 혈액식에 대한 모기의 흡혈 행동에 미치는 영향을 평가하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

모기가 원통형 아레나 내에서 따뜻한 혈액 식사에 접근할 수 있도록 하는 광유도 막 피더 분석(Section 4)을 통해 혈액원에 대한 모기의 유인 및 흡혈 정도를 연구할 수 있습니다. CO2 감각 뉴런의 광유전학적 활성화가 혈액원에 대한 유인과 섭식 유발에 충분한지 확인하기 위해, Gr3>CsChrimson 및 대조군 모기(각 유전자형당 n = 10, 여기서 n은 시행 횟수이며, 시행당 캐니스터당 20마리의 모기 사용)를 광유도 막 피더의 따뜻한 혈액 식사에 접근시킨 후, 15분 동안 10초마다 1초간의 밝은 적색광 펄스에 반복적으로 노출시켰습니다(Figure 4B). 막 피더에 대한 유인도를 측정하기 위해, 3개의 포인트로 구성된 SLEAP 모델을 사용하여 착륙한 모기의 머리, 흉부, 복부를 추적하고 관심 영역 내에 있는 개체 수를 측정하였습니다(Figure 4D, Figure 4E). Gr3>CsChrimson 모기는 Gr3-QF2 대조군에 비해 시간이 지남에 따라 혈액 식사 영역에 대한 유인도가 증가했습니다(Figure 4F, p = 0.027). Gr3>CsChrimson 모기는 QUAS-CsChrimson보다 통계적으로 유의미하게 높은 유인도를 보이지 않았습니다(Figure 4F, p = 0.310). 유의성 그룹은 Kruskal-Wallis 검정 후 Holm 보정을 적용한 Dunn 검정으로 결정하였습니다. 유의 수준은 p < 0.05로 설정하였습니다. 데이터는 혈액 식사에 유인된 모기의 평균 백분율로 도식화하였으며, 음영 지역은 표준 오차를 나타냅니다. 대조군 유전자형인 Gr3-QF2와 QUAS-CsChrimson은 각각 26%와 29%의 유사한 흡혈률을 보였으며, 이는 설명된 방식대로 수동으로 점수를 매겨 측정하였습니다(Figure 4G, p = 0.351). 반면, Gr3>CsChrimson 모기는 평균 61%로 두 대조군보다 유의미하게 높은 흡혈률을 나타냈습니다(Figure 4G, Gr3-QF2 대비 p < 0.001, QUAS-CsChrimson 대비 p = 0.002). 데이터는 바이올린 플롯과 박스 플롯(중앙값, 사분위 범위 및 범위)으로 도식화하였으며, 유의 수준 p < 0.05에서 Kruskal-Wallis 검정과 Holm 보정을 적용한 Dunn 검정을 사용하여 분석하였습니다. 이러한 결과는 광유도 막 피더 분석이 CO2 뉴런의 광유전학적 활성화가 모기의 유인 및 혈액 식사 흡혈에 미치는 영향을 평가하는 실행 가능한 수단임을 나타냅니다.

모기 행동 분석 차트; 방법: 광-열 사이클러(opto-thermocycler), 혈액 담요; 자극: 열, CO2.
그림 1: 모기 광유전학을 위한 분석 및 사육. (A) 제시된 행동 분석의 특성과 함께 모기의 숙주 탐색 행동을 나타낸 모식도. 각 행동 분석으로 측정된 숙주 탐색 단계는 회색 막대로 표시되어 있다. (B) 광유전학 실험을 위한 모기 사육 일정. 그림 1은 저자들이 Adobe Illustrator를 사용하여 본 출판물을 위해 제작하였으며, 사용에 별도의 라이선스가 필요하지 않다. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

모기 행동, 적외선 써모사이클러, LED-적색광 설정, 그래프 분석, 자극 반응.
그림 2: 광-써모사이클러(opto-thermocycler)를 이용해 광유전학적 활성화 동안의 각성 및 탐색 행동을 정량화함. (A) 상단 LED와 카메라가 장착된 PCR 써모사이클러 블록 위 모기 플레이트로 구성된 광-써모사이클러 분석법의 모식도. (B) 써모사이클러 온도를 감지하고 LED를 제어하는 마이크로컨트롤러의 회로도. 회로도는 CC-BY-SA 3.0 라이선스(https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md) 하에 Fritzing으로 작성됨. 이 라이선스는 적절한 출처 표기 시 이미지의 완전한 재사용을 허용함. (C) 최대 14마리의 모기를 수용하는 아크릴 플레이트를 보여주는 분석법의 정지 이미지. 열전대는 우측 하단 웰에 위치함. (D) 포즈 추정을 위해 SLEAP 모델에 사용된 모기 스켈레톤. 신체에 표시된 지점은 다음과 같음: 프로빙 행동 감지에 사용되는 구침의 끝과 기부(빨간색으로 표시); 흉부 연결 부위, 대퇴마디와 경절 연결 부위, 경절과 부절 연결 부위인 앞다리(파란색으로 표시); 그리고 복부 끝(노란색으로 표시). 하향식 다수 개체 모델이 사용됨. 모기의 각성과 프로빙 행동을 정량화하기 위해 포즈 추정기 및 행동 분류기가 사용됨. (E) SLEAP 예측값이 겹쳐진 모기의 보행, 비행 및 프로빙 예시. 보행과 비행은 각성을 측정하는 행동 지표로 사용됨. (F) 자극 전달 출력. 노란색 물결선은 체온 열 자극을 나타내고, 적색 LED는 적색광 자극을 나타냄. (G) 자극 전달 후 Gr3-QF2, QUAS-CsChrimson, Gr3>CsChrimson 모기(유전자형당 n = 22–23마리)의 보행, 비행 및 프로빙 행동 에토그램. (H) Gr3>CsChrimson 모기(n = 68–70마리)에서 광유전학적 활성화 이후 나타나는 지속적인 행동. 그림 패널 A–E는 저자들이 Adobe Illustrator를 사용하여 본 출판물을 위해 제작하였으며, 사용에 별도의 저작권 라이선스가 필요하지 않음. (F–H)의 데이터는 CC BY 4.0 라이선스8를 통해 Sorrells et al, 2022에서 재현됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

모기 흡혈 실험 설정, 데이터 분석 차트, 인공 혈액 식사 도식, 온도 그래프.
그림 3: 블러드 블랭킷 분석을 통해 광유전학적 활성화에 따른 포만도를 정량화함. (A) 블러드 블랭킷 분석의 모식도. 모기를 아크릴 케이지에 가두고 메쉬 스크린 아래에 접근 가능한 인공 혈액을 제공함. (B) 분석 중 측정된 온도 및 적색광 자극의 리드아웃. (C) 알루미늄 블러드 블랭킷 흡혈 플레이트 조립체의 모식도. (D) 포즈 추정에 사용된 SLEAP 스켈레톤에는 그림 2D에 기술된 지점들과 더불어, 복부가 흉부와 만나는 측면의 네 지점 및 복부의 가장 두꺼운 부분의 가장자리 지점들이 포함됨. 포만도는 하향식 다수 동물 모델의 예측값을 사용하여 복부 둘레를 따라 5개의 지점 내의 면적으로 측정됨. (E) 유전자형별 인공 혈액 식사 포만도 평균 백분율을 나타내는 바이올린 플롯 (유전자형당 trial당 모기 14마리, 총 n = 10 trials). 유의성은 Kruskal-Wallis 검정 후 Holm 보정을 적용한 Dunn 검정을 사용하여 결정함. 서로 다른 문자는 그룹 간 p < 0.05의 유의성을 나타내며, 동일한 문자를 가진 그룹은 서로 유의미한 차이가 없음. (F) Gr3>CsChrimson 동물에서 복부 면적으로 측정한 시간에 따른 포만도 변화. 적색 추세선은 실험 8분 동안의 30초 슬라이딩 윈도우를 표시하며, x = 0은 포만도가 시작되는 시점을 나타냄. 그림 3의 모든 모식도는 저자들이 Adobe Illustrator를 사용하여 본 출판물을 위해 제작하였으며, 사용을 위한 저작권 라이선스는 필요하지 않았음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

모기 광유전학 설정; RGB 조명 제어; Arduino; 혈액 식사; 유인율 그래프; 결과.
그림 4: 광막 급이 장치 분석을 통한 유인 및 흡혈 측정. (A) 개별 구성 요소가 포함된 광막 급이 장치의 모식도. (B) 실험 시행의 타임라인. 파란색 선은 적응 기간과 실험 전체에 걸쳐 조사된 어두운 청색광을 나타낸다. 실험 자극의 일부 구간이 표시되어 있으며, 이는 10 s 간격으로 1초 동안 적색광 펄스를 가한 것을 나타낸다. (C) 광막 급이 장치의 배선을 나타낸 도표. 저자들이 CC-BY 라이선스 하에 Fritzing으로 작성한 회로도이다. (D) 광막 급이 장치 비디오의 예시 프레임. 유인율을 결정하기 위해 빨간색 원 안에 있는 모기 수를 측정한다. (E) 흡혈하지 않은 모기와 흡혈하여 배가 부푼 모기의 예시로, 광막 급이 장치용 SLEAP 추적 모델에 의해 머리, 흉부, 복부가 표시되어 있다. 혈액 식사가 배치된 관심 영역에 대한 유인도를 측정하기 위해 하향식 다중 동물 SLEAP 모델이 사용되었다. (F) 유전자형별로 시간에 따른 혈액 식사 영역의 평균 점유율(착륙의 행동 지표로 사용됨)을 나타낸 선 그래프(유전자형당 모기 20마리, n = 10회 시행). 평균값은 30 s마다 플롯되었다. 음영 처리된 영역은 표준 오차를 나타낸다. 유의성은 Kruskal-Wallis 검정 후 Holm 보정을 적용한 Dunn 검정으로 결정하였다. 서로 다른 문자는 유의미한 그룹을 나타내며, 임계값은 p < 0.05로 정의되었다. (G) 유전자형별 혈액 식사 후 평균 흡혈률을 나타낸 바이올린 플롯. (F, G)에서 유의성은 Kruskal-Wallis 검정 후 Holm 보정을 적용한 Dunn 검정으로 결정하였다. 동일한 문자로 표시된 유전자형들은 서로 유의미한 차이가 없다. 유의성 임계값은 p < 0.05로 정의된다. 그림 4는 Adobe Illustrator를 사용하여 제작되었으며, 데이터는 본 출판물을 위해 저자들이 수집하였고 사용을 위한 저작권 라이선스는 필요하지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 논문은 숙주 유인 및 흡혈 단계에서 특정 신경세포 유형의 충분성을 평가하기 위한 상세 프로토콜을 설명합니다. 흡혈 행동은 원거리 감지부터 단거리 유인, 피부 천공, 그리고 흡혈 및 팽창에 이르기까지 일련의 행동 단계로 구성됩니다. 원칙적으로, 신경세포 유형은 특정 동작이나 단계를 제어하거나, 행동이 특정 순서로 진행되도록 유도하거나, 전체 행동의 지속 시간을 증가시키는 등 다양한 역할을 수행할 수 있습니다. 따라서 이 과정에서 신경세포의 기능을 분석하기 위해 제시된 여러 가지 분석법이 필요합니다.

이러한 분석에서 모기의 반응이 저조하게 나타나는 몇 가지 일반적인 원인이 있을 수 있습니다. 모기의 활동성이 가장 높은 시기인 배양 챔버의 명암 주기 전환 시간 근처에 실험을 수행함으로써 낮은 활동성과 섭식률을 방지할 수 있습니다. blood blanket 및 opto-membrane feeder에서의 낮은 섭식률은 저품질의 인공 혈액 식사나 부적절한 온도로 인해 발생할 수 있습니다. 모든 시약(NaHCO3, ATP, 탈섬유소 양 혈액)의 유효 기간이 지나지 않았는지, 그리고 적절하게 보관되었는지 확인하십시오. 최대의 신선도를 유지하기 위해 모든 용액은 실험 당일에 조제하는 것을 권장합니다. blood blanket 플레이트가 PCR thermocycler 블록 표면에 직접 접촉하는지 확인하십시오. opto-thermocycler와 blood blanket의 플레이트에 잔류 수분이 있을 경우 결로 현상이 발생할 수 있습니다. 실험 전, 플레이트를 종이 타월 위에 올려 수분을 흡수시키십시오. 광유전학적 반응이 저조할 경우, 모기의 연령이 최소 일주일 이상 되었는지, 그리고 ATR을 섭취할 충분한 시간이 제공되었는지 확인하십시오. ATR은 CsChrimson 채널의 필수 화학 보조인자입니다.

가시광선 스펙트럼 전체를 아우르는 청색(~450 nm)에서 적색(~650 nm) 파장에 민감한 광유전학 도구들이 개발되었습니다. 곤충은 일반적으로 이러한 적색 파장에 대한 민감도나 행동 반응이 낮기 때문에 적색광이 특히 유용합니다40. 흥미롭게도, 모기는 비행 중 인간의 피부 톤에 존재하는 장파장의 시각적 자극 영역에 끌리는 반응을 보입니다41. 따라서 적색광을 사용하는 것은 모기의 숙주 유인 분석에서 광유전학적 활성화의 해석을 혼동시킬 수 있는 제한 요인이 될 수 있습니다. 하지만 유전적 대조군 모기는 강한 강도의 광범위한 적색광 조사에도 최소한의 반응만을 보였습니다(그림 2-4). 행동 효과를 정확하게 해석하기 위해서는 드라이버 또는 이펙터 구조체가 결여된 유전적 대조군과 무광조 대조군을 사용하는 것이 권장됩니다. 다른 종의 광유전학 실험에서는 로돕신 보조인자인 ATR이 결여된 대조군이 자주 사용되지만, 모기 유충 먹이로 사용되는 물고기 사료에는 ATR의 전구체인 비타민 A가 포함되어 있어 이 시스템에서는 대조군으로서의 효과가 떨어집니다.

여기서 제시된 광유전학적 자극은 광도를 조절할 수 있는 연속적인 자극으로 제한됩니다. 자연적인 신경 활동 패턴을 밀접하게 재현하는 광유전학적 자극이 관심 대상이 되는 행동을 유도할 가능성이 가장 높습니다. 따라서 신경 기록 데이터가 있는 경우, 관찰된 강도 및 시간적 역동성에 맞춰 자극을 설계할 수 있습니다. 이를 알 수 없는 경우에는 다양한 자극과 행동 맥락을 통해 뉴런의 기능을 스크리닝할 수 있으나, 결과가 자연스러운 행동에서의 뉴런 기능을 반영하지 않을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 그럼에도 불구하고, 전기생리학이 세포 특성을 조사하는 데 사용되는 것과 마찬가지로, 뉴런의 활동을 자연 범위를 벗어나 구동함으로써 회로 또는 행동 특성을 독특한 방식으로 조사할 수 있습니다. 현재 광유전학 도구는 모기의 감각 뉴런에만 적용되었으며, 이러한 응용 방식은 자연 자극을 전달하는 것보다 몇 가지 장점을 제공합니다. 모기의 숙주 탐색을 측정하는 전통적인 전략은 실제 CO2 가스의 전달에 의존합니다. 실제 CO2를 사용하려면 여과 및 가습 처리된 공기 흐름이 필요하며, 이를 짧은 시간 간격으로 정밀하게 전달하고 제거하기 위해서는 복잡한 실험 설정이 필요합니다9,10,42,43. 공기 흐름과 습도는 모두 모기의 유인 및 항법을 위한 신호이므로, 광유전학적 전달 방식은 이러한 다른 자극들과 분리하여 후각 자극의 영향을 연구하는 방법으로서 매력적입니다. 또한 광유전학 도구는 성별 및 생리적 상태가 행동에 미치는 영향을 연구하는 데 사용되어 왔으며8, 모기 생물학의 이러한 중요한 문제들에 대한 통찰력을 제공했습니다.

광유전학 외에도, 본 프로토콜은 모기 행동을 평가하는 데 사용되어 온 표준 분석법을 활용하며 이는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 세척의 편의성을 위해, blood blanket은 모기가 흡혈하는 데 필요한 미각 자극제만 포함된 인공 혈액식을 사용합니다. 이러한 제한은 (opto-membrane feeder에서와 같이) 실제 혈액을 사용하거나 숙주 조직의 특성을 재현하는 생체 모사 재료를 사용하여 극복할 수 있습니다. opto-thermocycler와 blood blanket의 열은 비행 중인 모기가 아니라 걷거나 정지해 있는 모기에 전달되며, PCR thermocycler의 승온 속도에 의해 제한됩니다. 따라서 이러한 분석법은 탐침 및 흡혈 행동은 감지할 수 있으나, 유인 행동은 감지할 수 없습니다. 실험실 기반 분석법의 또 다른 제한점은 특정 신호의 행동학적 영향을 이해하기 위해 모기가 사용하는 다른 신호들을 배제해야 한다는 점입니다. 모기가 숙주로부터 흡혈하는 자연 환경의 추가적인 측면을 연구하기 위해 더욱 복잡한 실험실 분석법 및 반야외(semi-field) 분석법을 개발할 수 있을 것입니다.

모기 광유전학의 또 다른 한계는 감각 뉴런 외에 생성된 드라이버 라인이 거의 없다는 점입니다. 따라서 다른 접근 방식으로는 직접 자극할 수 없는 중간 뉴런에서 발현되는 드라이버와 결합될 때 그 잠재력이 완전히 실현될 것입니다. Aedes aegypti Mosquito Cell Atlas와 같은 새롭게 등장하는 리소스는 모기 신경유전학의 발전에44 길을 열어줍니다. 모기 신경 회로를 조사하기 위해 이러한 드라이버를 개발하는 후속 연구가 필요할 것입니다. 마찬가지로, 특정 뉴런 유형이 특정 행동에 필수적인지를 결정하기 위해 억제를 위한 추가적인 광유전학 도구가 필요합니다. 본 논문에서 제시한 분석법은 숙주 유인 및 흡혈 측정을 위해 설계되었으나, 이러한 접근 방식은 숙주 탐색의 추가 단계와 교미, 산란, 꿀 섭취와 같은 행동 연구로 확장될 수 있습니다. 광유전학 연구는 모기 행동이 신경 회로 수준에서 어떻게 제어되는지에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것이며, 모기 매개 질병의 확산을 방지하기 위한 새로운 접근 방식으로 이어질 수 있습니다.

공개 사항

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

감사의 글

원고에 대해 의견을 주신 Kim Lezon-Geyda, Fernanda Medeiros Contini 및 Yaoyu Jiao 씨에게 감사드립니다. 본 연구는 NIH grant DP2AI177891의 지원을 받아 수행되었습니다. 기술적 조언을 제공해주신 Yale Kavli Institute for Neuroscience 지원 Neurotechnology Core에 감사드립니다. T.S.는 HHMI Freeman Hrabowski Scholar입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1⁄8인치 블랙 아크릴McMaster-Carr8650K32광막 피더 구조
1⁄8인치 투명 아크릴McMaster-Carr8536K134광막 공급 장치 캐니스터
¼ 인치 블랙 아크릴McMaster-Carr8560K259광막 급이 구조체
AC 어댑터Jameco ReliaPro2197581광막 급이 구조
아크릴 접착제United States Plastic Corp 97562광학 막 피더 캐니스터, 혈액 담요 케이지
아데노신 5′-트리포스페이트 이나트륨염 수화물Sigma AldrichA6419-1G인공 혈액식
올트랜스-레티날 (All Trans-Retinal)Spectrum ChemicalR3041-1GM광유전학적 사육
알루미늄 브레드보드ThorlabsMB12광막 공급 장치 구조
알루미늄 시트 0.03125 inMcMaster-Carr89015K11혈액 블랭킷 피딩 플레이트
알루미늄 시트 0.0625 inMcMaster-Carr89015K37혈액 도말 공급 플레이트
동물 부위 추적기 (Animal Part Tracker, APT)HHMI Janelia Farm의 Branson 연구실제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.버전 3.0, 광학-열순환기(Opto-thermocycler) 재현 데이터(그림 2), 2020년 7월 9일 다운로드됨
Arduino IDE아두이노입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 제공해 주시기 바랍니다.버전 1.8.12, 광-열순환기(opto-thermocycler) 및 블러드 블랭킷(blood blanket)의 자극 제어에 사용됨, & 및 광막 피더(opto-membrane feeder)
Arduino Uno Rev3 마이크로컨트롤러 보드아두이노A000066 광막 피더 프로그래밍
검정색 유리섬유 윈도우 스크린획기적인 프리미엄 제품 IHLRS3684BL블러드 블랭킷 케이지
검정색 테이프ThorlabsT137-2.0광-열순환기
검은색 케이블 타이 케이블 타이 및 기타 소모품ct242광막-피더 구조
암막 커튼셋샵6520SF광-온도순환기 및 혈액 담요
청색 LED 조명21LEDUSARB5730BLWP모기 사육
병SKS 병 &포장 및 패키징0604-07광막 피더 혈액 가열기
저층어용 펠릿응용 프로그래밍 인터페이스(API)5352983유충 먹이 주기
카메라BlackflyU3-13S2M-CS, FLI어세이 영상 촬영
클릭 카운터ULineH-7350유충 선별(Thinning larvae)
컴퓨터Asus X1407Q어세이 수행
농축 표백제 (8.25% 차아염소산나트륨)VWR89501-620광학 막 피더 세척
CoolTermRoger Meier의 프리웨어제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.버전 2.0.1, 광-써모사이클러(opto-thermocycler), 혈액 담요(blood blanket)의 시리얼 포트 기록에 사용됨, &광막 급이 장치(opto-membrane feeder)
제섬유소 양 혈액 헤모스탯 연구소(Hemostat Laboratories) DSB100광막 공급기(opto-membrane feeder)용 혈액 식사
돔형 헤드 4-40 육각 볼트McMaster-Carr제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.혈액 블랭킷 공급 플레이트
에폭시Loctite1363118광열 사이클러 아크릴 플레이트, 광막 공급 장치 구조
에탄올Decon Labs2716살균 처리
외장 하드 드라이브LaCieLAC9000298비디오 저장물
ffmpegFFmpeg제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다.버전 8.0.1, 비디오 전처리
4인치 면 심지리치몬드 덴탈(Richmond Dental)201226성체 모기 급이
GitHubGitHub, Inc제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.opto-thermocycler (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0), blood blanket (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0) 및 opto-membrane feeder (v1.0.0, https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)를 위한 코드, 부품 파일 및 SLEAP 모델 저장소
Gr3>CsChrimson제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다.제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.단계 1.2에 기술된 바와 같이, 본 연구를 위해 제작됨
Gr3-QF2 모기제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.유전 시약, DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
불투명 도어 배양기Caron7340-25모기 사육
적외선 LED 광원Adafruit387광학-써모사이클러 및 혈액 담요
적외선 LED 스트립웨이브폼 라이팅(Waveform Lighting)7031.85광-온도순환기, 혈액 담요 및 광-막 구조
적외선 통과 필터Edmund Optics65-796어세이 영상 촬영 
곤충 사육장BugdormDP1000성체 모기 사육장
Janelia 자동 동물 행동 주석 도구 (JAABA)HHMI Janelia Farm의 Branson 연구실제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.광학 열순환기(Opto-thermocycler) 재현 데이터 (그림 2); 버전 0.5.0
대형 수프 컵WebstaurantStore50016SOUPPLA모기 사육
LED 방열판Luxeon StarN25-15B광학-써모사이클러 및 블러드 블랭킷
LED 렌즈Luxeon Star10209광학-써모사이클러 및 혈액 담요
LED 렌즈 홀더Luxeon Star10235광-써모사이클러 및 블러드 블랭킷
LED 렌즈 테이프Luxeon StarLT-01광학 열순환기 및 혈액 담요
LED 광원Luxeon StarSP-01-D9Opto-thermocycler 및 혈액 담요(blood blanket)를 위한 적색광 자극
LED 방열 테이프Luxeon StarLXT-S-12광학-열순환기 및 혈액 보온 담요
광학 구성 레일ThorlabsXE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12광열 사이클러 및 혈액 담요 구조
광학 포스트 ThorlabsTR12광막 급식 구조
종이 타월Pacific Blue27385캐니스터 세척
파라필름AmcorPM-996혈액 담요 막, 광학 막 식사 용기
PCR 열순환기Eppendorf2231001196광학-열순환기 및 혈액 담요
플라스틱 소분 컵선택999P2C성체 모기 급이
플라스틱 소스 컵 뚜껑선택999PL2성체 모기 먹이 주기
폴리카보네이트 팬Cambro21410CWCHCL유충 사육 
폴리카보네이트 팬 하프 사이즈Cambro24CW135 광막(Opto-membrane) 식사 세척
폴리카보네이트 팬 하프 사이즈 뚜껑Cambro20CWCH135 광막(Opto-membrane) 식사 세척
폴리카보네이트 팬 덮개Cambro10CWCH135유충 사육
폴리카보네이트 튜브McMaster-Carr8585K56광막 피더 캐니스터 
전력계코히런트1299161모든 분석법
QUAS-CsChrimson 모기제시된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주시기 바랍니다.유전자 시약, DOI: 10.7554/eLife.76663
RGB 조명Digikey 289-1189-ND광막 피더 자극 전달
직각 클램프ThorlabsRA90광막 급이기 구조
Scotch 매직 테이프3M104광학-열순환기 및 혈액 담요 아크릴 덮개
실리콘 가스켓, 0.5 mmMcMaster-Carr1460N22혈액 담요 피딩 플레이트
SLEAPTalmo Lab제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.버전 1.4.1a2, 각 분석 내 모기의 포즈 추적
탄산수소나트륨, 1M 완충액, pH 8.0Thermo ScientificJ62495.AP인공 혈액 식사
염화나트륨 용액Sigma-AldrichS5150-1L 100 3532552인공 혈식
스핀뷰(SpinView)Teledyne Vision Solutions제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.Version 1.27.0.48, 세 가지 분석 모두에 사용된 비디오 녹화 소프트웨어
분무기UlineS-11686살균 및 소독
설탕(Sucrose)Sigma AldrichS0389-500G성체 모기 급이
열전대 (T-타입)Harold G Schaevitz Industries LLCCPTC-120-X-N광-온도 순환 장치 및 혈액 담요
열전대 증폭기AdafruitMAX31856광-열사이클러 및 혈액 워머
타이머EnduraLightRAC-MT모기 사육을 위한 광주기 제어
전이 피펫 Thermo ScientificSAM-225유충 선별 (Thinning larvae)
쓰레기 봉투UlineS-23040곤충 운송
UV 내성 메쉬McMaster-Carr 87655K13광막 공급기 캐니스터
물Sigma AldrichW4502-1L블러드 블랭킷(blood blanket)을 위한 인공 흡혈 식이
왁스 처리된 실McMaster-Carr6356K91광학 멤브레인 캐니스터 덮개
금속 망McMaster-Carr9322T65광막 급이 구조체

참고문헌

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