골관절염을 위한 통비 포뮬러의 네트워크 약리학 및 분자 결합 연구

RuiGe Liang; Wei Zhang; Jin Xiong; Yi Peng; Jun Hu

doi:10.3791/71487

연구 논문

골관절염을 위한 통비 포뮬러의 네트워크 약리학 및 분자 결합 연구

DOI:

10.3791/71487

⸱

2026년 7월 3일

RuiGe Liang¹ , Wei Zhang¹ , Jin Xiong¹ , Yi Peng¹ , Jun Hu¹

¹Department of Traditional Chinese Medicine, Suining First People's Hospital

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 네트워크 약리학과 분자 도킹을 활용하여 TongBi Formula의 골관절염 치료 표적 및 분자 기전을 예측합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 네트워크 약리학과 분자 도킹을 결합하여 골관절염(OA)에서 통비 포뮬러(TBF)의 잠재적 치료 표적과 분자 기전을 예측하였습니다. TBF의 활성 성분과 해당 표적은 전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼에서 수집되었으며, OA 관련 표적은 온라인 멘델리안 상속 인테리턴스, GeneCards, DrugBank, 치료적 표적 데이터베이스에서 수집되었습니다. 네트워크 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용하여 화합물-표적 및 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 구축하였습니다. 유전자 온톨로지 기능 주석과 교토 유전자 및 게놈 백과사전 경로 풍부화 분석은 주석, 시각화 및 통합 발견 데이터베이스 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. 분자 도킹 소프트웨어를 사용하여 주요 활성 화합물과 핵심 표적 단백질 간의 예측된 결합 친화도를 평가하기 위해 분자 도킹 분석이 수행되었습니다. TBF와 OA 사이에 총 47개의 중복 표적이 확인되었습니다. PPI 네트워크 분석에서는 JUN, RELA, IL6, MAPK1, IL10이 잠재적 허브 표적으로 강조되었습니다. 농축 분석은 TBF가 염증, 지질 대사 및 OA 진행과 관련된 여러 세포 내 신호 경로를 조절할 수 있음을 시사했습니다. 분자 결합 결과는 핵심 활성 화합물과 주요 OA 관련 단백질 표적 간에 유리한 예측 결합 친화도를 보여주었습니다. 이 발견들은 골키퍼에 대한 TBF의 잠재적 메커니즘을 이해하기 위한 계산적 틀을 제공하며, 추가 실험적 검증을 지원합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

골관절염(OA)은 관절 연골의 퇴행성 염증성 질환입니다^. 현재 약 5,800만 명의 성인이 OA의 영향을 받고 있으며, 이 수는 2040년까지 7,840만 명으로 증가할 것으로 예상됩니다. 골관절염은 전 세계적으로 관절 통증과 기능 장애의 흔한 원인^입니다. 골관절염과 관련된 심한 통증으로 인해 환자들은 일상생활에서 상당한 장애를 경험하는 경우가^{많습니다.} 연령, 여성, 비만, 관절 손상이 OA⁵의 주요 위험 요인입니다. OA의 유병률이 매우 높고 의료 시스템에 상당한 영향을 미치지만, 이용 가능한 치료 옵션은 여전히 제한적입니다⁶. 현대 의학은 일반적으로 비스테로이드 소염제나 연골 보호제와 같은 증상 완화 치료를 채택합니다. 그러나 장기간 투여는 위장 손상과 간 및 신장 기능 이상 등 부작용을 자주 일으킵니다⁷. 따라서 골관절염에 대한 새로운 치료법이나 대체 요법 개발이 시급히 필요합니다.

전통 중의학(TCM)은 골관절염 치료에 있어 풍부한 경험을 축적해 왔으며, 증후군 분화와 전체론적 조절을 강조합니다. 통비 공식(TBF)은 주로 당귀, 단선, 지서텅, 하이펑텅, 투구차오, 두화, 웨이링선, 샹푸로 구성된 고전적인 처방입니다. 한의학의 관점에서 OA의 병리적 특성은 주로 바람-냉기-습기의 침입과 기혈 정체에서 비롯됩니다^. TBF의 한방 적합성은 이 핵심 병리학적 메커니즘에 맞게 설계되었으며, 모든 약용 성분이 바람과 습기를 제거하고 경락을 준설하며 혈액 순환을 촉진하는 시너지 작용을 하여 골골관절염의 전형적인 한의학 증후군 특징과 일치합니다. 임상 연구가 증가하는 중, 변형 TBF가^{OA 환자의} 관절 통증 완화와 사지 운동 기능 개선에 효과가 있을 수 있음을 시사합니다. 추가 임상 관찰은 골관절염 사례에서 염증 반응 조절 가능성을 입증했으며, 최근 메타분석은 골관절염 개입에 대한 임상 적용 가능성을 뒷받침했다¹¹.

TBF는 전통적으로 바람을 막고, 통로를 막으며, 추위를 분산시키고, 습기를 제거하며, 혈액 순환과 영양을 촉진하는 데 사용됩니다. 그러나 TBF가 OA에 대해 잠재적 치료 효과를 발휘하는 구체적인 메커니즘은 아직 명확하지 않으며, 그 활성 성분과 주요 표적은 아직 밝혀지지 않았습니다. 이러한 메커니즘을 보다 체계적이고 포괄적으로 조사하기 위해, 우리는 약물, 표적, 질병 간의 관계를 보여주는 네트워크 약리학 접근법을 사용하여 네트워크 지도를 구축했습니다¹². 또한, 유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 풍부화 분석을 수행하여 TBF¹³의 약리학적 작용에 관여하는 분자 메커니즘과 신호 전달 경로를 탐구하였습니다. TCM 처방의 약리학적 기전을 체계적으로 조사하기 위해, 본 연구는 활성 성분 선별, 표적 예측, 네트워크 구축, 기능 풍부 분석, 분자 결합을 포함하는 완전한 분석 워크플로우를 확립하였습니다. 이러한 연구 프레임워크는 OA¹⁴에 대한 TCM 공식의 분자 메커니즘을 탐구하는 표준화되고 재현 가능한 패러다임으로 인정받고 있습니다. 기존의 방법론 연구들은^{이 연구 전략}의 과학적 합리성과 실용적 적용성을 더욱 뒷받침했습니다. 방법론적 표준화를 넘어, 본 연구는 OA에서 TBF의 물질적 기초와 핵심 규제 목표를 정의하는 데 도움을 줍니다. 또한 TBF의 임상 적용과 향후 실험적 검증을 위한 이론적 참고 자료를 제공하며, 다른 한의학 처방의 기전적 탐색을 위한 실현 가능한 방법론적 틀도 제시합니다.

본 연구에서는 네트워크 약리학 접근법을 사용하여 활성 성분을 선별하고 OA 관련 표적 유전자와 결합된 복합물-표적 네트워크를 구축하였습니다. 이후 메커니즘 탐사를 위해 기능 농축 분석과 분자 도킹이 수행되었습니다. 네트워크 약리학은 생물학 및 약리학적 정보를 통합하여 약물-표적-질병 관계를 포괄적이고 다면적인 관점에서 조사합니다. 우리는 이 접근법이 TBF의 잠재적 약리학적 기전을 명확히 하고 이후 실험 연구의 이론적 기반을 제공할 수 있다고 믿습니다. 연구의 작업 흐름은 그림 1에 제시되어 있습니다.

figure-introduction-1
그림 1. 네트워크 약리학 및 분자 도킹 연구 설계의 워크플로우. 골관절염(OA)에 대한 통비 포뮬러(TBF)의 잠재적 메커니즘을 조사하기 위해 사용한 분석 워크플로우의 개략적 개요. 워크플로우에는 능동 화합물 스크리닝, 표적 예측, OA 관련 표적 수집, 교차 분석, 네트워크 구축, 단백질-단백질 상호작용(PPI) 분석, 유전자 온톨로지(GO) 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 증축 분석, 분자 결합 검증이 포함되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에는 인간 참가자, 척추동물, 조직 샘플이 포함되지 않았습니다. 모든 분석은 공개적으로 접근 가능한 생물정보학 데이터베이스와 분자 도킹 방식을 사용하여 수행되었으며; 따라서 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다.

TBF의 구성 요소 및 해당 표적 스크리닝
TBF의 모든 한방 성분, 즉 당귀, 단신, 지서탕, 하이펑텅, 투구차오, 두화, 웨이링선, 샹푸 등이 TCM 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP, 2026년 1월 접속)에서 검색되었습니다. 정확한 검색어는 각 한약의 표준 라틴어 명칭에 해당했습니다: Angelicae Sinensis Radix (당귀), Radix Salviae (단셴), Spatholobus suberectus Dunn(지슈에텅), Caulis Piperis Kadsurae (하이펑텅), Impatiens balsamina (투구차오), Radix Angelicae Biseratae (두화), Radix Clematidis (웨이링시안), 그리고 Cyperi Rhizoma (향부). 화학 성분은 경구 생체이용률(OB) 30%의 고정 임계치와 약물 유사성(DL) 0.18≥ 기준≥ 선별되었습니다. 이 컷오프 값들은 생체 내 활성 가능성을 가진 생체이용률 및 약물 유사 활성 화합물을 식별하는 데 TCM 네트워크 약리학 연구에서 널리 사용됩니다. 활성 화합물 스크리닝의 신뢰성과 일관성을 유지하기 위해 명시적 OB 또는 DL 값이 없는 화합물은 제외하였습니다.

선별된 활성 화합물의 해당 단백질 표적은 이후 TCM 약리학 데이터베이스에서 검색되었습니다. 대상 유전자 표준화는 Universal Protein Resource(UniProt) 단백질 주석 데이터베이스를 사용하여 수행되었으며, 종은 호모 사피엔스(Homo sapiens )로 제한되었습니다(2026년 1월 접속). 원래 단백질 이름은 공식 인간 유전자 기호로 변환되었고, 중복되거나 비인간 표적 항목은 수동으로 제외되었습니다. 중복 표적은 수동 비교 및 집계를 통해 제거하여 최종 TBF 표적 데이터셋을 생성했습니다.

OA 관련 표적 및 TBF의 잠재적 치료 표적 식별
OA 관련 표적은 온라인 멘델리안 유전 인 인간(OMIM), GeneCards, DrugBank, 치료적 표적 데이터베이스(TTD) 데이터베이스(2026년 1월 접속)에서 정확한 검색어인 "골관절염"을 사용하여 검색되었습니다. 서로 다른 데이터베이스에서 얻은 중복 표적은 데이터 집계 및 비교를 통해 수동으로 제거하여 OA 관련 표적 데이터셋을 생성했습니다. GeneCards에서는 관련성 점수가 3≥ 대상만 유지되었습니다. OMIM, DrugBank, TTD에서 "골관절염" 키워드를 사용해 검색한 표적은 추가 필터링 기준을 받지 않았습니다. 활성 화합물 관련 표적과 OA 관련 표적 간의 겹치는 표적은 Venny 2.1.0 온라인 Venn 분석 도구를 사용하여 확인되었습니다. 교차 분석은 골관절염에 대한 TBF의 잠재적 치료 표적을 규명하기 위해 수행되었습니다.

TBF–컴포넌트–타겟 네트워크 구축
Component–Targets 상호작용 데이터는 Cytoscape 3.10.2 네트워크 시각화 및 분석 소프트웨어에 도입되어 TBF–Component–Target 네트워크를 구축했습니다(2026년 1월 접속). 구성된 네트워크에서 노드는 허브 화합물과 표적 유전자를 나타내고, 가장자리는 활성 화합물과 해당 표적 간의 상호작용을 나타냈습니다. 중복 분석을 피하기 위해, 여러 허브에 공유된 중복 화합물을 하나의 고유 노드로 통합했습니다. 이후 차 값을 주요 평가 매개변수로 사용하여 네트워크 위상 분석을 수행했습니다. 핵심 활성 화합물은 등급 순위에 따라 확인되었고, 이후 분자 도킹 분석을 위한 리간드 후보로 선정되었습니다.

PPI 네트워크 구축
잠재적 치료 표적은 PPI 분석을 위해 STRING PPI 데이터베이스로 수입되었습니다(2026년 1월 접속). 종 매개변수는 호모 사피엔스로 제한되었고, 최소 필요한 상호작용 신뢰도 점수는 0.9로 설정되었으며, 나머지 매개변수는 기본 설정으로 유지되었습니다. 생성된 상호작용 데이터는 내보내져 네트워크 시각화 및 분석 소프트웨어를 통해 추가로 시각화되었습니다. PPI 네트워크의 위상 분석은 CytoHubba 네트워크 위상 분석 플러그인을 사용하여 수행되었습니다. 상호작용 네트워크 내 노드 중요성을 평가하기 위해 정도, 간간성 중심성, 근접성 중심성을 계산하였다. 코어 표적 단백질은 통합 위상 특성을 기반으로 확인되었고, 이후 분자 도킹 분석을 위해 선정되었습니다. 최대 클리크 중심성 알고리즘이 허브 표적을 스크리닝하는 데 채택되었습니다. 상호작용하는 파트너가 없는 노드는 제외되어 최종 네트워크의 노드 수가 원래 가져온 대상 데이터셋보다 적게 나타났습니다.

가서 케그
GO 기능 풍부 분석 및 KEGG 경로 풍부 분석을 수행하여 골골관절염에 대한 TBF의 치료 표적과 관련된 잠재적 생물학적 기능과 신호 전달 경로를 조사하였다. GO 분석은 생물학적 과정(BP), 세포 구성 요소(CC), 분자 기능(MF)이라는 세 가지 표준 존재론 범주를 포함했으며, 생물학적 과정을 해석의 주요 초점으로 지정했습니다.

기능 풍부 분석은 주석, 시각화 및 통합 발견 데이터베이스(DAVID)와 R 통계 분석 소프트웨어(버전 4.3.1; 2026년 1월 접속)를 결합하여 수행되었습니다. 풍부화 결과는 clusterProfiler 패키지를 사용하여 처리 및 시각화되었으며, 도트플롯과 바플로트 함수를 사용해 풍부도 다이어그램을 생성했습니다. 모든 표적 유전자는 호모 사피엔스 배경에 대해 주석이 달렸습니다. 벤자미니-호흐버그 방법을 다중 검정 보정에 적용했으며, 조정된 P-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

GO 및 KEGG 농축 결과의 시각화는 MicrobiomeAnalyst/MicrobiomeNet 온라인 분석 플랫폼(2026년 1월 접속)을 통해 수행되었습니다. 막대 그래프와 버블 차트가 생성되어 가장 유의미하게 풍부화된 GO 항과 KEGG 경로를 표시하였습니다.

분자 도킹
상위 핵심 표적의 공식 유전자 이름과 해당 단백질 데이터 뱅크(PDB) 식별자는 단백질 주석 데이터베이스에서 추출되었으며, 이들의 3차원 결정 구조는 RCSB PDB(2026년 2월 접속)에서 다운로드되었습니다. 각 표적 단백질에 대해 사슬 A는 수용체 구조로 유지되었고, 중복된 단백질 사슬, 이형원자, 관련 없는 구조 조각들은 수용체 준비 과정에서 제거되었습니다. 핵심 활성 화합물의 3차원 구조는 PubChem 데이터베이스(2026년 2월 접속)에서 수집되었습니다. 이 연구에서 쿼세틴은 구성 요소-표적 네트워크에서 가장 높은 위상적 중심성을 보이며, 골격증 발병 기전을 보호하는 효과가 보고된 잘 알려진 플라보노이드라는 점에서 대표적인 결합 리간드로 선정되었습니다.

수용체 및 리간드 전처리는 분자 도킹 준비 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며, 여기에는 물 분자 제거, 수소 원자 첨가, 프로톤화 처리, 가스티거 전하 할당 등이 포함되었습니다. 분자 도킹 분석은 이후 분자 도킹 소프트웨어 버전 1.5.7을 사용하여 수행되었습니다. 격자 박스 치수는 각 표적 단백질의 예측된 결합 영역을 포함하도록 조정되었습니다. 그리드 박스는 각 표적 단백질의 천연 리간드 결합 주머니를 중심으로 40 Å× 40 Å× 40 Å의 균일한 크기와 0.375 Å의 격자 간격을 가졌습니다. 도킹 계산은 전복성 매개변수 8로 수행되었으며, 각 리간드-표적 쌍에 대해 9개의 후보 결합 구조가 생성되었습니다. 예측된 결합 에너지가 가장 낮은 도킹 구조가 이후 구조 해석을 위한 대표적인 결합 자세로 선택되었습니다. 재도킹 검증과 양성 대조군 리간드 비교는 이 연구에서 수행되지 않았습니다. 모든 도킹 절차와 매개변수 설정은 예측된 결합 모드의 신뢰성을 지원하기 위해 네트워크 약리학 연구에서 일반적으로 채택된 표준 프로토콜을 따랐습니다. 도킹 구조는 분자 시각화 소프트웨어 버전 2.5.4를 사용하여 시각화되었습니다. 결합 에너지가 ≤−5.0 kcal/mol로 안정된 리간드-수용체 결합을 시사하는 것으로 간주되었습니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TBF의 화학 조성 및 표적 스크리닝
선별 결과 당귀에서 2개, 단셴에서 65개, 지쉬에텡에서 24개, 하이펑텅에서 21개, 투구차오에서 6개, 두화에서 9개, 웨이링선에서 7개, 샹푸에서 18개가 확인되었다. 선별된 활성 화합물에 대한 자세한 정보는 보충표 1에 제공되어 있습니다. 총 2672개의 잠재적 목표물이 처음에 회수되었으며, 당귀 266개, 단셴 689개, 두화개 236개, 하이펑텅 188개, 지쉬에텅 545개, 투구차오 192개, 웨이링선102개, 향부454개 포함이었다. 자세한 목표 정보는 보충표 2에 제시되어 있습니다. 중복 항목을 제거한 후, TBF와 관련된 비중복 표적 258개가 확보되었습니다.

TBF–컴포넌트–타겟 네트워크
TBF–Component–Target 네트워크는 TCM 약리학 데이터베이스에서 수집한 데이터를 사용하여 구축되었으며, 여기에는 152개의 활성 화합물, 258개의 비중복 표적, 8개의 한방 약물 노드가 포함됩니다. 이 데이터는 "네트워크"와 "유형"으로 지정된 두 개의 파일로 정리되었습니다(보충 표 3). 파일을 네트워크 시각화 및 분석 소프트웨어에 가져오면, 578개의 노드와 3022개의 엣지를 포함하는 포괄적인 네트워크가 구축되었습니다(그림 2). 구성된 네트워크에서 노드는 한약, 생리활성 화합물 및 해당 표적 단백질을 나타내고, 가장자리는 화합물과 표적 간 예측된 상호작용을 나타냈습니다. 더 큰 노드 크기와 더 어두운 색상 강도는 더 높은 등급 값과 네트워크 연결성 증가를 나타냈습니다. 네트워크 위상학 분석을 통해 얻은 정도 순위에 근거하여, 상위 5가지 활성 화합물은 쿼세틴(A7-MOL000098), 베타-시토스테롤(B8-MOL000358), 루테올린(A1-MOL000006), 캐프페롤(C1-MOL000422), 스티그마스터롤(C2-MOL000449)으로 확인되었습니다.

figure-results-1
그림 2. TBF–컴포넌트–타겟 상호작용 네트워크. TBF, 활성 화합물, 예측 표적 유전자 간 상호작용의 네트워크 시각화. 노드는 한약, 활성 화합물 또는 표적 단백질을 나타내며, 가장자리는 화합물과 표적 간 예측된 상호작용을 나타냅니다. 더 큰 노드 크기와 더 어두운 색상 강도는 더 높은 등급 값과 향상된 네트워크 연결성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

골관절염과 관련된 표적 정보 및 TBF의 잠재적 치료 표적
"골관절염" 키워드를 네 개의 데이터베이스에서 검색하여 428개의 잠재적 질병 관련 표적을 찾았으며, 이 중 9개는 OMIM, 349개는 GeneCards, 32개는 DrugBank, 38개는 TTD에서 나왔습니다. 네 데이터베이스 간 목표 분포를 보여주는 벤 다이어그램이 그림 3에 제시되어 있습니다. 중복된 항목을 합치고 제거한 후, 398개의 고유한 OA 관련 표적이 획득되었습니다. OA 관련 표적과 TBF 활성 화합물 관련 표적 간의 교차 분석에서 47개의 중복 표적이 확인되었으며, 이들은 골관절염에 대한 TBF의 잠재적 치료 표적으로 간주되었습니다. 온라인 벤 분석 도구를 사용해 생성된 해당 벤 다이어그램은 그림 4에 나와 있습니다.

figure-results-2
그림 3. 여러 데이터베이스에서 검색한 OA 관련 표적들의 벤 다이어그램. OMIM, GeneCards, DrugBank, 치료 표적 데이터베이스(TTD) 데이터베이스에서 확인된 OA 관련 표적 간 중복을 보여주는 벤 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-3
그림 4. TBF와 OA 간 중복 표적 식별. TBF의 활성 화합물 관련 표적과 OA 관련 표적 간의 교차점을 보여주는 벤 다이어그램. 겹치는 표적들은 골관절염에 대한 TBF의 잠재적 치료 표적으로 간주되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

PPI 네트워크의 구축 및 분석
47개의 겹치는 표적에 대한 PPI 네트워크 분석은 PPI 데이터베이스(그림 5)를 사용해 수행되었고, 이후 네트워크 시각화 및 분석 소프트웨어를 통해 시각화되었습니다. 네트워크 구축 과정에서, 단백질-단백질 상호작용(PPI)이 없는 분리된 표적을 나타내는 분리된 노드들은 표준 네트워크 토폴로지 절차에 따라 제거되어, 39개의 노드와 108개의 엣지로 구성된 정교한 네트워크가 완성되었습니다(그림 6). 노드 크기와 색상 강도는 그 정도 값을 반영하여 네트워크 내 타겟의 상대적 중요성을 나타냅니다.

figure-results-4
그림 5. STRING PPI 네트워크, 겹치는 표적들. TBF와 OA 간 겹치는 타겟에 대해 STRING 데이터베이스를 사용해 생성된 PPI 네트워크. 노드는 목표 단백질을, 엣지는 예측된 PPI를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-5
그림 6. 핵심 PPI 네트워크 분석. 분리된 노드를 제거한 후 정제된 PPI 네트워크. 노드 크기와 색상 강도는 등급 값을 나타내며 네트워크 내 타겟의 상대적 중요성을 나타냅니다. JUN, RELA, IL6, MAPK1, IL10 등 핵심 목표물들은 높은 네트워크 연결성을 보여주었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

PPI 네트워크의 위상 분석은 Degree 알고리즘이 포함된 네트워크 위상 분석 플러그인을 사용하여 노드 위상 특성을 계산했습니다. 학위 가치별로 순위가 매겨진 상위 10개 목표는 표 1에 제시되어 있습니다. JUN, RELA, IL6, MAPK1, IL10을 포함한 상위 5개 표적이 차도 값, 근접성 중심성, 간도 중심성을 기준으로 후속 분자 도킹 분석의 핵심 표적으로 선정되었습니다.

OA에서 TBF의 GO 생물학적 기능과 KEGG 경로 분석
GO 풍부화 분석은 사이토카인 활성, 전사인자 결합, 성장인자 활성 등 여러 OA 관련 생물학적 기능을 확인하여, TBF가 염증, 전사 활성, 연골 항상성 조절에 관여할 가능성을 시사했습니다. 상위 20개의 농축된 GO 용어는 카운트 값에 따라 순위를 매기고 막대 플롯(그림 7)을 사용해 시각화되었습니다. KEGG 경로 풍부화 분석은 골관절염 관련 신호전달 경로에 초점을 맞췄으며, 여기에는 골관절염 조절, 연골세포 이화작용 및 면역 반응과 관련된 첨단 당화 최종 산물-수용체 신호 전달 경로, 인터루킨-17(IL-17) 신호 전달 경로, 종양 괴사 인자(TNF) 신호 전달 경로, T 세포 수용체 신호 경로 등이 포함됩니다. 풍부 분석 중 확인된 감염병 관련 경로는 본 연구에서 직접적인 OA 기전으로 해석되지 않았습니다. KEGG 경로 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 버블 플롯 시각화를 생성했습니다(그림 8). 총 20개의 유의미하게 풍부해진 신호전달 경로가 확인되었습니다. 이 결과는 TBF가 다표적 약리학적 메커니즘을 통해 OA 관련 생물학적 과정과 신호 전달 경로를 조절할 수 있음을 시사했습니다.

figure-results-6
그림 7. 잠재적 치료 표적의 GO 농축 분석. TBF의 잠재적 치료 표적과 관련된 상위 20개의 농축 GO 용어를 보여주는 막대 플롯. 풍부한 용어에는 생물학적 과정, 분자 기능, 염증, 전사 조절, 연골 항상성과 관련된 세포 구성 요소가 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-7
그림 8. 잠재적 치료 표적의 KEGG 경로 풍부화 분석. 골관절염에 대한 TBF의 잠재적 치료 표적과 관련된 상위 농축 KEGG 신호 경로의 버블 플롯 시각화. 버블 크기는 풍부 유전자 수를 나타내며, 색상 강도는 풍부도 유의수준을 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

분자 도킹 검증
TBF의 주요 활성 화합물과 PPI 네트워크에서 확인된 핵심 표적 간의 잠재적 결합 상호작용을 더 자세히 조사하기 위해, 구성 요소-표적 네트워크에서 가장 높은 활성 화합물인 케르세틴과 다섯 개의 핵심 표적 JUN, RELA, IL6, MAPK1, IL10 간의 분자 결합 분석이 수행되었습니다(표 2). 쿼세틴은 구성 요소-표적 네트워크에서 가장 높은 위상학적 중요성을 보였으며, 항염증 활성 및 연골 대사 조절과 관련된 대표적인 생리활성 화합물로 널리 보고되었습니다^18,19. 예측된 결합 에너지는 JUN의 −8.4 kcal/mol, RELA의 −7.6 kcal/mol, IL6의 −6.9 kcal/mol, MAPK1과 IL10 모두의 −6.7 kcal/mol로, 퀘르세틴과 선택된 핵심 표적 간의 유리한 결합 친화도를 나타냈다. 리간드-수용체 결합 구조의 시각화는 잠재적 분자 상호작용의 해석을 용이하게 했습니다. 분자 시각화 소프트웨어 버전 2.5.4를 사용하여 쿼세틴과 다섯 핵심 표적 간의 최적의 도킹 구조를 시각화하였습니다(그림 9–13).

figure-results-8
그림 9. JUN과 함께한 쿼세틴의 분자 도킹 모델(PDB ID: 1JNM). JUN에 결합한 쿼세틴의 3차원 분자 결합 구조. 퀘르세틴은 JUN의 bZIP 도메인 내에 결합하여 구조적 상보성을 가진 소수성 결합 공동에 적합할 것으로 예측되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-9
그림 10. RELA와 함께한 퀘르세틴의 분자 도킹 모델(PDB ID: 7LEU). RELA에 결합된 쿼세틴의 3차원 분자 도킹 구조. 쿼세틴은 비공유 상호작용을 통해 RELA Rel 상호몰로지 도메인의 활성 영역과 상호작용할 것으로 예측되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-10
그림 11. IL6와 케르세틴의 분자 결합 모델(PDB ID: 1ALU). IL6에 결합한 쿼세틴의 3차원 분자 도킹 구조. 쿼세틴은 IL6의 보존된 수용체 결합 홈을 차지할 것으로 예측되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-11
그림 12. MAPK1과 함께한 퀘르세틴의 분자 도킹 모델(PDB ID: 6D5Y). MAPK1에 결합된 케르세틴의 3차원 분자 결합 구조. 쿼세틴은 MAPK1의 ATP 결합 포켓을 차지할 것으로 예측되어 키나아제 관련 상호작용이 있을 가능성을 시사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-12
그림 13. IL10과 함께한 쿼세틴의 분자 결합 모델(PDB ID: 1ILK). IL10에 결합된 쿼세틴의 3차원 분자 결합 구조. 쿼세틴은 IL10의 이물질체 경계 영역 근처에서 상호작용할 것으로 예측되었으며, 단백질 복합체의 안정화에 기여할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

데이터 가용성:
이 연구 결과를 뒷받침하는 모든 데이터는 원고, 표, 도표 및 보조 자료에 포함되어 있습니다. 보충표 1에는 통비 공식(TBF)의 선별된 활성 화합물이 포함되어 있으며, 보충표 2 는 해당 예측 표적 정보를 제공하고, 보충표 3 은 네트워크 구축 및 위상 분석에 사용되는 네트워크 코딩 및 상호작용 데이터를 담고 있습니다.

진	단백질 이름	학위	근접성 중심성	중간 중심성
준	전사 인자 AP-1	18	0.58	0.22
렐라	전사 인자 p65	15	0.56	0.15
IL6	인터루킨 6	14	0.59	0.33
MAPK1	미토겐 활성화 단백질 키나제 1	13	0.54	0.16
IL10	인터루킨 10	10	0.47	0.12
ESR1	에스트로겐 수용체	10	0.44	0.03
IL2	인터루킨 2	9	0.53	0.05
AKT1	RAC-알파 세린/트레오닌-단백질 키나제	9	0.44	0.04
MMP1	매트릭스 메탈로펩티다아제 1	8	0.44	0.03
MMP2	매트릭스 메탈로펩티다아제 2	8	0.44	0.03

표 1: PPI 네트워크 내 핵심 타겟의 위상 매개변수. PPI 네트워크 분석에서 확인된 주요 타깃의 위상 매개변수. 결절 중요성을 평가하고 골관절증에 대한 TBF와 관련된 핵심 치료 표적을 확인하기 위해 정도, 근접성 중심성, 간도 중심성을 계산하였다. 상호작용 네트워크 내에서 차수와 중심성 가치가 높은 표적은 더 중요하다고 여겨졌습니다.

목표	PDB ID	활성 사이트 좌표 (X, Y, Z)	리간드	결속 친화력 (칼로리/몰)
준	1JNM	X = 10.201; Y = 0.493; Z = 19.492	퀘르세틴	−8.4
렐라	7LEU	X = 1.717; Y = 23.889; Z = −0.778		−7.6
IL6	1ALU	X = 2.599; Y = −20.016; Z = 8.749		−6.9
MAPK1	6D5Y	X = 7.052; Y = 12.800; Z = 20.749		−6.7
IL10	1ILK	X = 17.836; Y = 46.443; Z = 38.685		−6.7

표 2: 쿼세틴과 핵심 표적 단백질 간의 분자 결합 매개변수 및 결합 친화도. 쿼세틴과 선택된 핵심 표적 단백질인 JUN, RELA, IL6, MAPK1, IL10 간의 분자 결합 결과가 나타납니다. 표는 단백질 데이터 뱅크(PDB) 식별자, 도킹 계산에 사용되는 활성 부위 격자 중심 좌표, 분자 도킹 분석에서 얻은 예측 결합 친화도 값을 제시합니다. 결합 에너지 값이 낮을수록 예측되는 리간드-수용체 결합 친화도가 더 강함을 나타냅니다.

보충표 1: TBF에서 확인된 활성 화합물. TBF에서 선별된 활성 화합물에 대한 상세 정보로, 화합물명, 분자 식별자, OB 값, DL 값 및 해당 한방 원료 등이 포함됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 2: TBF의 활성 화합물에 해당하는 예측 표적. 표적 정규화 및 중복 제거 후 얻은 표준화된 인간 유전자 기호를 포함해, TBF의 스크리닝된 활성 화합물에 대응하는 예측 단백질 표적의 종합 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 표 3: TBF–컴포넌트–타겟 네트워크에 대한 네트워크 코딩 정보. TBF 구성 요소-표적 상호작용 네트워크 구축에 사용되는 분자 식별자, 표적 정보, 네트워크 관계, 네트워크 토폴로지 분석에 사용되는 노드 분류 데이터를 포함한 상세 코딩 정보. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 네트워크 약리학과 분자 도킹 방법을 활용하여 골관절염에 대한 TBF의 잠재적 기전을 조사하였습니다. 분석된 핵심 한약에는 당귀, 단선, 지서텅, 하이펑텅, 터구차오, 두화, 위링선, 향부가 포함되었습니다. 이전 연구들은 당귀(Angelica sinensis Radix)가 연골 퇴행, 연골하 골경화, 비정상적인 보행, 무릎 부종 등 골관절염 관련 병리학적 변화를 완화할 수 있음을 입증했습니다²⁰. IL-1β 유도 OA 세포 모델에서 당귀는 활성 산소종 축적을 줄이고 슈퍼옥사이드 디무타제와 글루타치온²¹을 포함한 항산화 효소의 활성을 증가시켰다. 살비아 밀티오리자의 활성 성분인 Danshenindione IIA는 연골 퇴행을 완화하고, 연골하 뼈 재형성 항상성을 회복하며, OA 마우스 모델에서 비정상적인 혈관형성을 억제하는 것으로 보고되었습니다²². 또한 S. miltiorrhiza에서 유래한 성분들은 산화 스트레스와 골 대사를 조절할 수 있습니다^23,24. 스파톨로부스 수베렉투스 던은 연골 대사와 골관절염 진행과 관련된 PI3K/Akt/mTOR과 Ras/Raf/MAPK 신호 전달 경로를 조절하는 것으로 보고되었습니다. S. suberectus Dunn의 추출물은 염증성 화학물질 생성도 억제합니다²⁶. 더 나아가, 임파티엔스 발사미나에서 보고된 항염증 및 항산화 활성은 만성 염증과 산화 스트레스가 연골 퇴행에 기여하기 때문에 골관절염 발병 기전과 관련이 있을 수 있다²⁷. Radix Angelicae Biseratae는 혈액 순환 개선과 관절염 관련 증상 완화와도 관련이 있습니다^28,29. 지쉐텡(Spatholobus suberectus Dunn), 하이펑텡(Caulis Piperis Kadsurae), 샹푸(Cyperi Rhizoma)의 OA 치료 효과에 대한 제한된 연구가 조사되었습니다.

PPI 네트워크를 기반으로 한 계산 예측은 TBF가 염증 반응 조절과 관절 연골 보호를 통해 골골증에 대한 치료 효과를 낼 수 있음을 시사했으나, 이러한 예측은 추가적인 실험적 검증이 필요하다. PPI 네트워크에서 비교적 높은 등급을 가진 핵심 표적에는 JUN, RELA, IL6, MAPK1, IL10이 포함되었습니다. 이전 연구들은 JUN이 연골 세포 노화 및 골관절염 진행과 관련이 있음을 입증했습니다. JunB/Jun 이중 돌연변이 마우스는 관절 조직에 염증성 침윤이 나타나며 뼈 파괴와 골막염을 동반^합니다. 골관절염 연골과 유막의 전사체 분석에서도 JUN 발현 감소가 나타났습니다³¹. 또한, 전부 십자인대 절개로 유도된 OA 쥐 모델과 노화 연골 세포에서 JUN 단백질 발현 감소가 관찰되었습니다³². 이전 연구들은 JUN 관련 신호전달이 골골 연골 연골 변행, 세포자사멸사, 자가포식, 세포외 기질 대사를 조절할 수 있음을 시사했습니다³³. 이전 연구들은 또한 전달된 RNA 유래 조각이 RELA 관련 신호 경로를 통해 관절 연골세포의 증식과 생존을 조절한다는 것을 입증했습니다³⁴. 또한, Sox9 유전자의 상향 조절과 중간엽 기질 세포에서의 RELA 발현 억제가 결합되어 연골형성 및 면역조절 능력을 향상시키고 OA 진행을 지연시켰습니다³⁵. 이 발견들은 현재 계산 분석에서 확인된 JUN 및 RELA 관련 신호 전달 경로의 잠재적 관련성을 뒷받침합니다.

IL6는 골관절염에서 핵심 염증 매개체이며, 연골 대사에 중요한 역할을 하여 분해와 수리 과정 모두에 영향을 미칩니다. 만성 저등급 염증 상태에서 IL6 수치 상승은 연골 노화, 연골 기질 합성 감소, 연골 항상성 파괴에 기여합니다³⁶. 이전 연구들은 IL6 수용체/JAK2 신호가 노화 세포 세포자멸사(apoptosis) 조절에 관여하며, 노화 세포의 표적 제거가 골관절염 진행을 완화할 수 있음을 입증했습니다³⁷. 또한 Li Q와 동료들은 miR-186-5p의 상향 조절이 IL-1β 자극 연골세포의 염증 반응을 조절하는 반면, miR-186-5p 억제는 MAPK1 발현 증강을 통해 OA 진행을 완화한다고 보고했다³⁸. 이러한 발견은 본 계산 분석에서 확인된 IL6 및 MAPK1 관련 신호전달 경로의 잠재적 관여를 뒷받침합니다.

IL10은 연골 항상성에 보호 역할을 하며, 연골 미세환경 유지에 기여할 수 있습니다. 이전 연구들은 IL10이 미토콘드리아 세포자멸사 경로 조절, 카스파제 활성 감소, Bax/Bcl-2 비율 조절을 통해 연골세포 세포자멸사를 억제한다는 것을 입증했습니다³⁹. 또한, IL10은 압축된 관절연^{골 모델에서} 세포 외 기질 분해 감소와 기질 분해 관련 인자(예: MMP3, MMP13, ADAMTS4, 유도성 일산화질소 합성효소 등)의 발현 감소와 연관되어 있습니다. 본 연구의 KEGG 경로 풍부화 분석은 IL-17, TNF, 저산소 유도 인자-1(HIF-1) 신호 전달 경로가 골관절염에 대한 TBF의 예측된 치료 효과와 연관될 수 있음을 시사했으나, 이러한 계산적 예측은 실험적 확인이 필요하다. 이전 연구들은 IL-17이 염증 반응과 滑막 세포 활동 조절을 통해 OA 진행에 기여한다는 것을 입증했습니다^41,42. IL-17 발현 증가는 무릎 골관절염⁴³의 질환 중증도와도 양의 상관관계가 있습니다. TNF-α는 골관절염 관련 염증, 통증, 연골 퇴행과 관련된 또 다른 주요 염증 매개체이며, TNF-α 신호 전달 억제는 질병 진행을 완화할 수 있습니다⁴⁴. 또한 HIF-1α는 연골⁴⁵에서 연골 저산소 대사, 세포외 기질 조절, 활막 염증, 연골하 뼈 재형성에 중요한 역할을 합니다. 이전 연구들은 또한 HIF-1α 관련 신호전달 억제가 연골 기능을 보호하고 연골 퇴행을 줄일 수 있음을 제안했습니다⁴⁶. 이 결과들은 현재의 계산 풍부 분석을 통해 확인된 신호 전달 경로와 일치합니다.

실 리코 연구에는 몇 가지 중요한 한계가 있습니다. 첫째, 분석은 허브 화합물과 표적 주석에 관한 불완전하거나 편향된 정보를 포함할 수 있는 공개 데이터베이스에 의존했습니다. 또한, 계산 대상 예측 방법은 본질적으로 불확실성을 수반하며, 본 연구에서 확인된 상호작용은 실험적 검증이 필요합니다. 분자 도킹 분석은 직접적인 생리학적 또는 약리학적 활성보다는 이론적 결합 잠재력을 반영합니다. 더불어, 계산 예측을 검증하기 위한 시험관 내 또는 생체 내 실험은 수행되지 않았습니다. 허브 용량, 약물동역학, 그리고 결합 조제액의 전반적인 생체이용률 등 요인도 평가되지 않았습니다. 따라서 본 연구에서 도출된 모든 결론은 예측 능력이 있으며 추가 실험적 확인이 필요합니다.

본 연구는 네트워크 약리학 및 분자 도킹 분석을 기반으로 하며, TBF가 OA에 대해 잠재적 메커니즘을 조사할 수 있는 예측적 틀을 제공합니다. 결과는 TBF가 8가지 성분 허브에서 유래한 활성 화합물 간 상호작용을 통해 여러 OA 관련 표적을 조절할 수 있음을 시사했습니다. 확인된 표적들은 염증 조절, 지질 대사, 저산소 관련 신호 전달과 관련된 생물학적 과정과 신호 전달 경로(IL-17, TNF, HIF-1 경로)에 풍부해졌습니다. 분자 결합 분석 결과, 쿼세틴과 핵심 표적 JUN, RELA, IL6, MAPK1, IL10 간의 결합 친화도가 예측 가능하다는 점도 입증되었습니다. 이 결과들은 TBF가 OA에 대해 다성분적이고 다표적 조절 효과를 발휘할 수 있음을 시사합니다. 또한 본 연구는 향후 OA 연구에서 TCM 공식의 기전적 연구와 실험적 검증을 위한 이론적 전략과 방법론적 틀을 제공합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

경쟁 이익 선언:

저자들은 경쟁하는 재정적 또는 개인적 이해관계가 없다고 선언한다. 모든 저자는 이 진술을 검토하고 승인하였습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에는 자금, 기관 지원 또는 기술 지원을 받지 않았습니다.

재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AutoDockTools	소프트웨어	버전 1.5.7; Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
AutoDock Vina	소프트웨어	버전 1.5.7; Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
barplot 함수	R 시각화 함수	clusterProfiler 패키지	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
clusterProfiler	R 패키지	생물정보학 분석을 위한 Bioconductor 패키지	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
CytoHubba	플러그인	Cytoscape 3.10.2과 호환	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba
Cytoscape	소프트웨어	버전 3.10.2; Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/
DAVID	데이터베이스	Annotation, Visualization 및 Integrated Discovery 데이터베이스	https://david.ncifcrf.gov/
dotplot 함수	R 시각화 함수	clusterProfiler 패키지	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
DrugBank	데이터베이스	앨버타 대학교	https://go.drugbank.com/
GeneCards	데이터베이스	GeneCards Suite	https://www.genecards.org/
MicrobiomeAnalyst / MicrobiomeNet	온라인 플랫폼	온라인 엔리치먼트 시각화 플랫폼	https://microbiomenet.com/
OMIM	데이터베이스	Online Mendelian Inheritance in Man	https://www.omim.org/
PDB	데이터베이스	RCSB 단백질 데이터 은행	https://www.rcsb.org/
PubChem	데이터베이스	국립 생물기술 정보 센터	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOL	소프트웨어	버전 2.5.4	https://pymol.org/
R	소프트웨어	버전 4.3.1; R 통계 컴퓨팅 재단	https://www.r-project.org/
STRING	데이터베이스	상호작용하는 유전자/단백질 검색 도구	https://cn.string-db.org/
TCMSP	데이터베이스	전통 중국 의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼	http://tcmspw.com/tcmsp.php
TTD	데이터베이스	치료 표적 데이터베이스	https://db.idrblab.net/ttd/
UniProt	데이터베이스	유니버설 단백질 자원	https://www.uniprot.org/
Venny	소프트웨어	버전 2.1.0	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html

```

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

골관절염을 위한 통비 포뮬러의 네트워크 약리학 및 분자 결합 연구

이 논문에서

요약

초록

서론

프로토콜

결과

토론

공개 사항

감사의 글

재료

재인쇄 및 허가

태그

관련 논문