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방법 논문

행동 분석 및 고함량 영상을 이용한 제브라피시 유충의 도파민성 신경퇴행성 생체 내 표현형 분석

348 조회수

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DOI:

10.3791/71516

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2026년 6월 16일

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1Department of Clinical Pharmacy Practice, UC Irvine School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Robert A. Mah Molecular Innovation Center, University of California Irvine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 생 체 내 제브라피시를 이용한 표준화된 고처리량 화합물 스크리닝 방법을 제공하여 도파민성 뉴런 손실과 운동 행동 결손을 정량화하여 신경보호 화합물의 효율적인 스크리닝을 가능하게 합니다.

초록

신경퇴행 분야의 신약 발견 연구는 전통적인 포유류 모델의 높은 비용과 낮은 처리량에 의해 제약을 받고 있습니다. 이 병목 현상은 특히 파킨슨병 연구에서 관찰되며, 엄격하고 확장 가능한 도파민성 신경퇴행성 연구가 여전히 느리고 자원 집약적입니다. 이 격차를 해소하기 위해, 우리는 DA 뉴런에서 니트로환원효소를 발현하는 형질전환 제브라피시 모델을 이용한 표준화된 고처리량 표현형 파이프라인을 제시하여 수정 후 5일 이내의 DA 뉴런 손실을 연구합니다. 제브라피시는 빠른 유충 발달, 생체 내 전뇌 영상 촬영을 가능하게 하는 광학 투명성, 파킨슨병 관련 유전자 및 경로의 강력한 보존, 세포 배양 모델에서는 접근하기 어려운 온전한 신경 회로 등 번역 신경과학에 핵심적인 이점을 제공합니다. 우리 프로토콜은 화학유전학적 소작술과 고함량 영상을 통합하여 신속한 스크리닝용 데이터셋을 생성합니다. DA 뉴런은 메트로니다졸(MTZ)을 이용해 선택적으로 소결되어 특이적이고 조절 가능한 신경퇴행을 생성합니다. MTZ 치료는 서맥 유사 표현형과 일치하는 용량 의존적 이동 감소를 만들어 DA 세포 손실과 강력한 행동 상관관계를 제공합니다. 파킨슨병은 근본적으로 운동 장애이기 때문에, 해부학적 측정과 기능적 행동 측정값을 짝지어 봅니다. 운동 활동은 플레이트에 직접 기록되고 자동 추적을 통해 정량화되어 총 이동 거리, 수영 빈도, 버스트 시작 등 지표를 추출합니다. 제브라피시는 최소한의 손길로 수백 마리의 유충을 동시에 분석할 수 있는 효율적이고 확장 가능한 모델 시스템을 제공합니다. 우리는 학부 연구에서 실험적 분산을 최소화하기 위해 고처리량, 플레이트 기반 약물 스크리닝 프로토콜을 최적화했습니다. 신경보호 또는 기능적 구조를 위한 후보 화합물을 선별하는 이 표준화된 플레이트 기반 형식은 서로 다른 연구자들이 수집한 데이터가 통계적으로 비교 가능하고 신경보호 후보를 식별하는 데 효과적임을 보장하여 재현성을 향상시킵니다. 이 방법론은 신경퇴행 연구를 위한 견고하고 확장 가능한 틀을 제공합니다.

서론

신경퇴행 분야의 신약 개발 연구는 전통적인 포유류 모델1,2의 높은 비용과 낮은 처리량으로 인해 상당한 효율성 병목 현상에 직면해 있으며, 신중한 실험 계획과 대규모 인력 활용이 필요합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) 이 형질전환 제브라피시 모델은 니트로레환원효소-m체리를 도파민성 뉴런(DA) 뉴런에서 특이적으로 발현하여 DA 뉴런 손실과 이동 결손을 연구하는 모델입니다. 이 기법의 사용에 근거한 이유는 신경퇴행 연구를 위한 엄격하고 확장 가능하며 경제적으로 실현 가능한 생체 내 모델의 필요성에서 비롯됩니다 3,4,5. 시험관 내 세포 배양은 신속한 약물 스크리닝을 가능하게 하지만, 번역적 관련성에 필수적인 신경 회로와 전체 생물체 맥락이 온전하지 않습니다6. 반면, 설치류 모델은 뛰어난 생리학적 맥락을 제공하지만, 신경보호 화합물의 초기 고처리량 스크리닝에는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요됩니다 7,8.

제브라피시는 빠른 유충 발달, 생체 내 전뇌 영상 촬영이 가능한 광학 투명성, 특히 신경퇴행과 관련된 질병 관련 경로의 강한 유전적 보존성을 가지고 있습니다 9,10,11. 이 프로토콜은 표준화된 사육 관리, 메트로니다졸(MTZ)을 이용한 화학유전학적 소작, 고농도 영상 검사와 기능적 행동 추적을 구체적으로 통합합니다. 운동 활동을 직접 측정하면 도파민 뉴런 손실이 행동 이상과 연관되어 있어 DA 신경 손실과 강력한 행동 상관관계를 제공합니다 12,13,14. 표준화된 판 기반 형식은 운영자 간 실험 분산을 최소화하며, 제브라피시 유충 시스템의 높은 처리량 덕분에 큰 표본 크기를 가능하게 하여 신경 보호 효과를 감지할 충분한 통계적 검정력을 제공합니다. 이로 인해 이 프로토콜은 조사자 경험이 다를 수 있는 환경까지 포함하여 확장 가능하고 재현 가능한 스크리닝이 필요한 응용 분야에 적합합니다.

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프로토콜

척추동물 피험자를 사용하는 모든 방법은 기관동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 승인 AUP-25-098)를 준수하여 수행되었습니다.

1. 제브라피시 사육

  1. 수생 시스템 조건 유지
    1. 순환 수생 시스템을 28.5°C(허용 범위: 26°C–30°C), pH 7.1–7.8, 전도도도 600–700 μS/cm로 유지하세요. 성체 제브라피시는 가정용 수조에서 약 5마리/L의 방류 밀도로 유지하세요.
    2. 제조사 지침에 따라 암모니아, 아질산염, 질산염 수치를 매일 측정하세요. 암모니아와 아질산염은 0ppm, 질산염은 10–20ppm 사이로 유지하세요.
    3. 암모니아 또는 아질산염이 0 ppm을 초과하고, 질산염이 20 ppm을 초과하며, 눈에 띄는 탁도나 이물질이 존재하거나, pH/전도도 값이 1.1.1.1 단계에서 설명한 목표 범위를 벗어날 때 물 교환을 수행하십시오. 암모니아와 아질산염이 0 ppm으로 돌아오고, 질산염이 10–20 ppm으로 돌아오며, pH/전도도 값이 목표 범위로 회복될 때까지 교환을 계속합니다.
    4. 생체 리듬과 번식을 동기화하기 위해 14시간 빛: 10시간 어둠 주기를 유지하세요.
  2. 발달 단계에 따라 제브라피시에게 먹이가 있습니다
    1. 성체 물고기에게는 하루 두 번 0.5mm 느리게 가라앉는 펠릿을 먹이세요. 먹이를 섭취 시간별로 표준화하고 3–5분 이내에 섭취한 양만을 제공합니다. 실험 코호트마다 동일한 펠릿 크기와 식단 유형을 일관되게 사용하세요.
    2. 유충 물고기 Gemma Micro 75 ZF 또는 약 75 μm 입자 크기의 동등한 유충 제브라피시 사료를 하루 세 번 먹이하세요. 어린 물고기(1개월)인 Gemma Micro 150 ZF 또는 약 150 μm 입자 크기의 동등한 제브라피시 사료를 하루 세 번 먹입니다.
    3. 동등한 사료는 제브라피시 유생이나 어린 개체를 위해 조제되었고, 입자 크기가 비슷하며, 발달 단계에 적합한 고단백 영양소 완전 사료를 제공할 경우에만 대체해야 합니다.
    4. 유충과 유충 사료에 갓 부화한 살아있는 브라인 쉬림프 나우플리이를 평일 정오에 하루 한 번 보충하세요. 제조사 지침에 따라 통기된 염수에서 24–36시간 동안 염수 새우 낭종을 부화시키세요.
    5. 활발히 헤엄치는 나우플리를 모아 몸의 물로 헹구고, 5분에서 10분 이내에 섭취한 양만큼만 먹이세요.
    6. 과도한 사료는 암모니아 수치를 높여 피하세요.
      참고: 매일 부드럽게 빨아들여 먹지 않은 음식과 눈에 보이는 이물질을 제거하세요. 수조에서 죽거나 건강하지 않은 물고기가 있는지 점검하고, 이물질이 쌓인 것이 관찰되면 수조 표면이나 체를 깨끗이 청소하세요. 실험 코호트 전반에 걸쳐 수조 밀도, 먹이, 세척, 수질 모니터링을 일관되게 유지합니다. 제브라피시 사육, 발달 단계, 염수새우 양식, 장기 시설 유지에 관한 자세한 내용은 Westerfield15 및 Avdesh 등16을 참조하십시오.

2. 배아 채취, 시약 준비 및 형질전환 스크리닝

  1. 번식 교배 개조
    1. 배아 채취 전 저녁에 교배 수조를 칸막이로 조립하세요.
    2. 각 횡단 수조에 수컷 1마리와 암컷 2마리를 넣고, 수컷과 암컷은 밤새 칸막이로 분리해 두세요.
    3. 다음 날 아침 빛 주기 시작 시 칸막이를 제거하고 고정된 2시간 동안 스폰을 허용하세요. 산란 창 직후 배아를 채취하여 발달 단계 변동성을 최소화하세요.
  2. 배아를 채취하고 배양합니다
    1. 400 μm 메시 필터를 통해 수조 물을 부어 배아를 채취합니다. 배아를 시스템 워터 또는 블루 에그 워터(BEW)로 부드럽게 헹구어 이물질을 제거한 후, 일회용 이식 피펫을 사용해 100mm 페트리 접시로 배아를 이식합니다. 배아를 다루는 것을 최소화하고 장기간 공기에 노출되는 것을 피하세요.
    2. 배아를 30mL BEW가 들어 있는 100mm 페트리 접시에 이식하며, 접시당 50–60개의 배아 밀도로 옮깁니다. 일관된 발달과 산소 공급을 유지하기 위해 접시당 60개를 초과하지 마십시오.
    3. 배아는 28.5°C에서 14시간 빛: 10시간 암흑 주기 하에 배아를 배양합니다.
    4. 수정되지 않은 난자와 생존 불가능한 배아는 매일 제거하세요.
      참고: BEW는 60mg 인스턴트 오션 소금, 1% 메틸렌 블루 50 μL, 그리고 탈이온수1L 17을 사용하여 준비하세요.
  3. 1-페닐-2-티오우레아(PTU) 용액을 준비하여 적용하세요
    1. 디메틸 설폭화물(DMSO)에 100 mM PTU 스톡 용액을 준비합니다.
    2. PTU 기본 용액은 빛으로부터 보호된 상태로 4°C에 보관하세요.
    3. 수정 후 24–36시간(hpf)에 각 접시에 30 mL BEW가 들어 있는 각 접시에 60 μL PTU 스톡 용액을 추가하여 최종 농도는 200 μM에 도달합니다.
    4. 페트리 접시를 부드럽게 원을 그리며 5–10번 돌려 섞으세요. 기계적 스트레스를 최소화하기 위해 배아에 직접 피펫팅하는 것은 피하세요.
      주의: PTU는 호흡기 및 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 장갑을 끼고 통풍이 잘 되는 곳에서 준비하세요.
  4. 트리카인 마취제 준비해
    1. 400 mg 트리카인 메탄설포네이트를 97.9 mL 밀리-Q 물에 녹입니다.
    2. 용액에 1 M 트리스 염기(pH 9) 2.1mL를 추가합니다.
    3. 0.1M 수산화나트륨 또는 염산을 사용해 용액을 pH 7.0으로 조절합니다.
    4. 용액을 라벨이 붙은 튜브에 알리쿼트하여 4°C에서 보관합니다.
    5. 저용량 적용 시 1:25로 희석하면 작동 농도가 160 μg/mL가 되거나, 1:100으로 희석하면 40 μg/mL가 됩니다.
      주의: 트리카인 메탄설포네이트는 화학적 마취제입니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
  5. 교배 수행
    1. 아웃크로스 동형접합 Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) AB 야생형 제브라피시와 함께 AB 야생형 제브라피시 성체를 하룻밤 동안 교배 수조에 넣어 분할기를 설치했습니다. 빛 주기 시작 시 칸막이를 제거하고, 고정된 2시간 산란 창 후에 배아를 수집하세요.
  6. 화면 형질전환 유충
    1. 수정 3일째(dpf)에 유충을 마취하여 최종 농도인 160 μg/mL로 마취합니다.
    2. mCherry 필터 세트를 사용해 형광 입체현미경으로 유충을 관찰합니다(여기 ~587 nm, 방출 ~610 nm). 실험 내 모든 유충에 대해 동일한 스크리닝 설정을 사용하세요. 여기에는 객관적 배율, 노출 시간, 게인, 조명 강도 등이 포함됩니다.
    3. 알려진 양성 형질전환 유충을 사용하여 노출과 이득을 설정하여 DA 뉴런 형광이 포화 없이 명확히 보이도록 하고, 실험 내 남은 모든 유충에 대해 이 설정을 유지합니다.
    4. 눈 사이 복측 이뇌 내 DA 신경세포 클러스터에 국한된 mCherry 양성 신호가 존재하는지 확인하라(그림 1A).
    5. 양성 유충은 복측 간뇌의 예상되는 DA 뉴런 클러스터에서 명확히 검출 가능한 mCherry 형광을 보이는 유충으로 식별합니다. 고정 스크리닝 설정에서 배경 위에 mCherry 신호가 보이지 않으면 비형질전환 또는 알려진 음성 유충을 배경 대조군으로 사용하여 유충을 음성으로 분류합니다.
      참고: 3 dpf는 복측 두뇌의 DA 뉴런이 신뢰할 수 있는 형광 신호를 생성하여 정량화하는 가장 초기 단계입니다.

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그림 1: 형질전환 스크리닝, 유충 부착 및 플레이트 설계. (A) 도파민성 뉴런(DA) 뉴런에서 니트로환원효소(NTR)를 발현하는 형질전환 제브라피시 유생의 형광 이미지(mCherry 채널, 4× 목적)로, 눈 사이 복측 이뇌에서 DA 뉴런 클러스터를 보여줍니다. (B) 약 1.5mm 개구부로 다듬은 수정된 P200 피펫 팁, 아가로스 매입 시 유충 이동에 사용됨. (C) 고처리량 약물 스크리닝을 위한 대표적인 96웰 플레이트 배치, 포함 차량 제어, 메트로니다졸(MTZ) 처리 웰, 스크리닝 화합물 조건. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 화학유전학 소작 및 형광 영상

  1. 아가로스 임베딩 배지를 준비합니다
    1. 4 dpf 함정 당일, 1.2% 저녹점 아가로스(LMA)를 밀리-Q 물에 준비합니다.
    2. 아가로스 용액을 전자레인지에 5–10초 간격으로 짧게 가열하며, 간격 사이를 부드럽게 돌려 아가로스가 완전히 녹아 용액이 투명해질 때까지 가열합니다. 증발로 인해 최종 아가로스 농도가 바뀔 수 있으므로 과열이나 장시간 가열을 피하세요.
    3. 아가로스를 1.5mL 마이크로 원심분리관에 알리코트합니다.
    4. 70°C에서 알리코트를 녹인 후 42°C 열블록에서 평형을 맞추세요.
    5. 각 아가로스 알리코트에 20 μL 트리카인 정액(4 mg/mL)을 첨가하여 약 40 μg/mL의 작동 농도를 만듭니다.
    6. P200 피펫으로 5–10번 부드럽게 피펫팅하여 트라이카인을 녹인 아가로스에 섞습니다. 소용돌이 현상이나 거품 도입은 유충의 위치 잡기와 촬영에 방해가 될 수 있으므로 피하세요.
  2. 마취 및 유충 삽입
    1. 4마리의 dpf 유충이 포함된 페트리 접시에 트리카인 스톡 용액을 첨가하여 최종 농도는 160 μg/mL로 만듭니다.
    2. 유충을 트리카인에서 약 5분간 부양시키거나, 자발적인 헤엄치기 능력이 사라지고 탐침으로 부드러운 접촉에 반응이 없을 때까지 기다립니다. 이 마취 종료 지점에 도달한 후에만 삽입을 진행하세요.
    3. P200 피펫 팁의 원위 끝을 깨끗한 가위나 멸균 칼날로 다듬어 약 1.5mm 간격의 구멍을 만드세요. 사용 전에 입체 현미경으로 자나 보정된 스케일로 개구 크기를 확인하세요. 가장자리가 거칠거나 유충이 접촉 없이 통과할 수 없을 만큼 좁은 입구가 있는 끝부분은 버려집니다(그림 1B).
    4. 수정된 피펫 팁을 사용해 최소한의 액체에 유충 한 마리를 흡인하세요.
    5. 피펫 팁을 아가로스 알리코트에 담가세요.
    6. 유충 한 마리가 들어있는 아가로스 40μL을 평평한 바닥 96웰 플레이트의 한 웰에 투여합니다. 실험 내 모든 웰에 동일한 아가로스 부피를 사용하세요. 다른 판 유형을 사용할 경우, 실험 시작 전에 아가로스 부피를 최적화하고 모든 웰에서 선택한 부피를 유지하세요.
      참고: 일관된 영상을 위해 평평한 바닥판을 사용하세요. 판 형상을 바탕으로 아가로스 부피를 최적화하세요.
  3. 동양 및 매입 유충
    1. 플레이트를 입체 현미경(해부 현미경) 아래에 놓으세요.
    2. 가늘게 땡은 겸자나 0.25mm 프로브를 사용해 유충을 복측 간뇌가 목표물을 향하도록 방향을 잡으세요.
    3. 거꾸로 현미경을 사용할 때는 유충을 등을 아래로 향하게 하거나, 세워 있는 현미경에서는 등을 위로 배치하세요.
    4. 아가로스가 굳어지기 1–2분 이내에 완전히 방향을 잡습니다.
    5. 미리 정의된 96웰 플레이트 맵에 따라 각 우물당 유충 1마리를 심습니다. A행은 차량 통제군, H행은 MTZ 단독 통제군용으로, B–G행은 후보 복합 조건 또는 용량-반응 그룹에 할당합니다. 위치적 편향을 줄이기 위해 가능한 경우 B–G 행 내에 화합물 배치를 무작위로 배치하세요. 기저선 및 치료 후 영상 촬영에는 동일한 판 지도를 사용하세요.
    6. 아가로스 응고화 후에는 각 웰에 트리카인 없이 BEW를 첨가하여 최종 웰 부피를 정확히 200 μL로 만듭니다. 플레이트 내 모든 웰에 동일한 최종 부피를 사용하여 확산과 처리 노출을 일관되게 유지합니다.
  4. MTZ 처리 솔루션을 준비하세요
    1. BEW에서 1% DMSO와 200 μM PTU를 보조하여 MTZ 작업 용액을 준비합니다. 용액에 MTZ 가루를 넣고 보이는 입자가 남지 않을 때까지 소용돌이를 돌립니다. 빛을 차단한 로커나 튜브 로테이터 위에서 실온에서 15–30분간 혼합하세요. 사용 전에 용액이 투명하고 눈에 띄는 침전물이 없는지 확인하세요.
    2. 3, 4.5, 9 mM 농도를 준비하여 선량 반응 최적화를 수행합니다.
    3. 200 μM PTU와 함께 BEW에 1% DMSO를 포함한 차량 대제를 준비합니다.
    4. 최적화 후 정기 선별을 위해 검증된 MTZ 농도만 준비하세요.
      주의: MTZ는 빛에 민감합니다. 각 실험마다 신선한 용액을 준비하고, 은박지로 빛을 막으며, 남은 용액은 재사용하지 마세요.
      참고: 모든 치료 및 대조군에서 최종 DMSO 농도를 동일하게 유지하세요. 대체 MTZ 제형을 사용하지 마십시오.
  5. 사전 처리 형광 이미지 획득
    1. 4 dpf 시, 임베딩 후 20× 대물렌즈를 가진 형광현미경을 사용해 기준선 형광 이미지를 획득합니다(그림 2).
    2. 각 우물은 mCherry 채널(여기 ~587 nm, 방출 ~610 nm)을 사용하여 영상을 찍습니다.
    3. 실험 내 모든 웰에 동일한 영상 설정을 사용하세요. 차량 제어 유충을 사용해 노출 시간, 조명 강도, 검출기 이득을 설정하여 가장 밝은 DA 뉴런 픽셀이 포화 없이 검출기 동적 범위의 약 70%–80%에 도달하도록 합니다. 최종 노출 시간, 조명 강도, 검출기 이득, 대물렌즈, 획득 프로파일을 기록하고, 모든 기준선 및 처리 후 이미지에 대해 이 설정을 유지하세요.
    4. 가능한 한 번의 세션 내에서 모든 이미지를 획득하여 시간대에 따른 램프 강도나 검출기 감도의 변동성을 최소화하세요. 자동 단계 제어가 있는 시스템의 경우, 다중 획득을 사용하여 영상 세션 전반에 걸쳐 동일한 좌표를 유지합니다.
    5. 획득 프로필을 저장하여 치료 후 영상(Step 3.7) 및 이후 실험에서 재사용하세요.
      참고: 20× 대물렌즈는 이뇌성 DA 뉴런 클러스터 영상화를 위한 시야각과 해상도의 균형을 제공합니다.
  6. 기저선 영상 검사 후 MTZ 치료를 적용하세요
    1. 4 dpf에서 기준선 영상 촬영 직후, 각 웰에 MTZ 함유 용액 또는 차량 용액을 직접 첨가하여 최종 웰 부피를 200 μL로 만듭니다.
    2. 화합물 선별 실험의 경우, 이 단계에서 후보 화합물을 MTZ와 함께 첨가하여 유충이 같은 24시간 처리 기간 동안 MTZ± 화합물에 노출되도록 합니다.
    3. 플레이트를 28.5°C에서 14시간 빛: 10시간 암 주기 동안 4 dpf에서 5 dpf 사이 24시간 배양합니다.
    4. 배화 중에는 배열판을 건드리지 마세요.
      참고: 용량-반응 실험의 경우, 치료 조건을 최적화하기 위해 추가 잠복 시간(예: 12시간 및 48시간)을 평가하십시오.
      일시정지: 플레이트는 정해진 처리 기간 동안 인큐베이션 상태로 유지한 후 영상 촬영으로 진행할 수 있습니다.
  7. 처리 후 형광 이미지 획득
    1. 5 dpf 시, 4 dpf 기준선 영상에 사용된 동일한 현미경 설정을 사용하여 노출 시간, 조명 강도, 검출기 이득, 대물, 획득 프로파일 등을 포함하여 처리 후 이미지를 획득합니다(그림 2).
    2. 웰 간이나 처리 전후 영상 세션 사이에 노출 시간, 검출기 이득, 조명 강도, 초점, 대물렌즈, 획득 설정을 조정하지 마십시오.
    3. 현미경이 세션 사이에 전원이 꺼져 있다면, 저장된 획득 프로필을 다시 불러오고 영상 촬영 전에 모든 설정을 기록된 파라미터와 비교해 검증하세요.
    4. 가능한 경우 기초 영상 시 동일한 순서로 영상 웰을 촬영하고, 모든 처리 후 영상은 동일한 영상 세션 내에서 획득합니다.
    5. 이 쌍립된 치료 전후 영상 설계는 기저 DA 뉴런 형광의 개인 간 변동성을 조절하며, 신호 변화가 획득 차이가 아닌 치료에 기인함을 보장합니다.

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그림 2: 메트로니다졸 치료 후 DA 뉴런 형광의 용량 의존적 감소. MTZ 농도가 다양한 24시간 처리 후 간뇌성 DA 신경세포를 보인 형질전환 제브라피시 유충의 대표 형광 이미지(mCherry 채널, 20× 목적). 형광 강도는 선량 의존적으로 감소하여 NTR 발현 신경세포의 성공적인 화학유전학적 소작을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

4. 고처리량 플레이트 기반 약물 스크리닝

  1. 유전자 형질전환 유충을 생성하고 선별합니다
    1. 새로운 동형접합 형질전환 유충 코호트를 생성한다.
    2. 배아를 채취해서 BEW에서 키우세요.
    3. 2.3단계에 설명된 대로 수정 후 24–36시간(hpf)에 200 μM PTU를 투여합니다.
    4. 3 dpf에서 mCherry 채널을 사용해 고정 현미경 설정으로 실험 내 모든 유충을 선별합니다. 알려진 양성 유충을 사용해 노출 시간, 검출기 이득, 조명 강도를 설정하여 포화 없이 DA 뉴런 형광을 명확히 감지하고, 스크리닝 중에는 이 설정을 변경하지 않습니다.
    5. 고정 선별 환경에서 복측 간뇌의 예상 DA 뉴런 클러스터에서 명확한 m체리 형광이 관찰되면 유충을 양성으로 분류합니다. 이 영역에서 배경 신호가 없거나 약하거나 확산형, 또는 자소성 형광을 가진 유충은 버려집니다.
  2. 유충을 삽입하고 기준선 이미지를 획득합니다
    1. 4 dpf 상태에서 3.2–3.3단계에 설명된 대로 96웰 플레이트에 유충을 삽입하고, 각 웰당 유충 1마리를 사용합니다.
    2. 3.5단계에서 설명한 치료 전 기준 형광 이미지를 획득합니다.
  3. MTZ와 후보 화합물을 도포하세요
    1. 4 dpf에서 기준선 형광 이미지를 획득한 후, 플레이트 맵에 따라 처리 용액을 직접 웰에 첨가합니다(그림 1C).
    2. 차량 제어 우물의 경우, 화합물 처리 우물에서 사용되는 최종 DMSO 농도를 포함한 BEW를 첨가합니다.
    3. MTZ 전용 대조정의 경우, 후보 화합물이 없는 MTZ 용액을 추가하세요.
    4. 화합물 선별용 우물의 경우, MTZ와 후보 화합물을 함께 첨가하여 유충이 동일한 24시간 처리 기간 동안 두 가지 모두에 노출되도록 합니다.
    5. 초기 스크리닝에서는 10 μM과 같은 단일 화합물 농도를 사용하며, 화합물별 용해도, 독성 또는 이전 용량-반응 데이터가 다른 농도를 사용해야 한다고 명시하지 않는 한 사용하세요.
    6. 각 유정을 최종 부피 200 μL로 조정합니다. 차량 제어, MTZ 단독 제어, MTZ 플러스 유정을 포함한 모든 유정에서 동일한 최종 DMSO 농도를 유지합니다.
    7. 플레이트를 28.5°C에서 14시간 빛: 10시간 암 주기 동안 4 dpf에서 5 dpf 사이 24시간 배양합니다.
      참고: 이 프로토콜에는 화합물 노출 전 MTZ 제거나 세척 절차는 포함되지 않습니다. 후보 화합물은 기초 영상 검사 직후 MTZ와 동시에 적용됩니다.
  4. 치료 후 이미지를 획득하고 형광 저류율을 계산합니다
    1. 5 dpf 시, 4 dpf에서 기저선 영상에 사용된 동일한 획득 설정을 사용하여 치료 후 형광 영상을 획득합니다.
    2. 가능한 한 기준선 영상 촬영 시 동일한 순서로 이미지 웰을 사용합니다.
    3. 각 유충의 형광 보유량을 다음과 같이 계산하세요:
      figure-protocol-3
    4. 형광 보존 값을 동일한 판의 평균 차량 제어 값으로 정규화합니다.
    5. 후보 보호 화합물을 MTZ 단독 대조군보다 유의하게 높은 형광 보존 값을 가진 화합물을 식별합니다.
  5. 타격 컴파운드 식별
    1. 형광 보존 비율이 음극 대조군보다 유의미하게 높은 화합물(MTZ 단독)으로 명중화합물을 식별합니다.
    2. 웰치 t-검정을 사용하여 MTZ 단독 대조군과 MTZ 및 복합 처리군을 비교하기 위한 통계 분석을 수행합니다.
    3. 독립적인 생물학적 복제와 용량-반응 분석을 사용하여 명중 화합물을 검증합니다. 명중을 MTZ 단독 대조군에 비해 형광 보유율을 반복적으로 증가시키는 화합물로 확인하며, p < 0.05이고 유충 독성이나 이상 형태가 보이지 않습니다.
    4. 운동 행동 분석, 용량-반응 검증, 독립 생물학적 복제 검사와 같은 2차 검사에 대한 사전 검증된 결과가 있습니다.
      참고: 화합물 라이브러리 스크리닝의 경우, 양성 및 음성 대조군을 사용하여 각 플레이트의 Z-인자를 계산하십시오. Z 인자가 0.5> 경우, 히트 식별에 적합한 견고한 분석법을 나타냅니다.

5. 운동 행동 평가

  1. 유충을 처리 그룹에 배정하세요
    1. 4 dpf 시, 각 유전자형의 유충을 최소 10마리의 유충이 있는 세 가지 처리 그룹으로 나누어 배정합니다: BEW 전용, DMSO 임체 대조, MTZ 처리.
    2. 그룹은 다음과 같이 할당합니다: (1) BEW 전용(미처리 기준선), (2) 1% DMSO 차량 대조, (3) 최적화된 MTZ 농도(200 μM PTU로 1% DMSO/BEW 4.5 mM).
    3. 동일한 조건에서 차량 또는 MTZ로 처리한 AB 야생형 유충도 포함합니다. MTZ가 Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) 유충이지만 AB 야생형 유충에는 포함되지 않습니다.
  2. 방제를 하고 유충을 배지하세요
    1. 5.1.2단계에서 정의된 조건을 사용하여 28.5°C에서 유충을 24시간 처리합니다: BEW 단독, DMSO 차량 1% 대조, 또는 4.5 mM MTZ를 1% DMSO/BEW에 200 μM PTU로 투여합니다.
    2. 넓은 보통 이동 피펫을 사용해 2.5mL 신선한 BEW가 들어있는 6웰 플레이트의 각 웰에 5마리의 유충을 옮깁니다. 유충의 양을 최소화하고 스트레스나 부상을 방지하기 위해 부드럽게 다루세요.
      참고: 우물당 5마리의 유충을 사용하면 데이터 수확량이 균형을 맞추고 과밀을 최소화할 수 있습니다. 밀도가 높을수록 경로 교차가 증가하고 행동 분석에서 추적 오류를 유발합니다.
  3. 조명 조건 설정하세요
    1. 6웰 플레이트를 25°C에서 28°C로 유지된 균일한 확산 조명으로 흰색 LED 조명 패드 위에 올려놓습니다. 실험 내 모든 녹화에 동일한 조명 패드, 밝기 설정, 플레이트 위치를 사용하세요(그림 3A).
    2. 그림자, 눈부심, 반사를 최소화하기 위해 확산된 광원을 사용해 아래와 위에서 판을 밝히세요.
  4. 비디오 녹화 설정 설정
    1. 고해상도 카메라를 플레이트 위에 고정된 탑다운 방향으로 고정하여 삼각대 또는 암 마운트(예: 삼각대 또는 암 마운트)를 사용해 장착합니다(그림 3B).
    2. 공간 보정을 위해 플레이트 옆에 자(자)를 놓으세요.
    3. 시차 왜곡을 최소화하기 위해 카메라가 판 표면에 수직이 되도록 하세요.
  5. 기록적인 운동 활동
    1. 14시간 빛: 10시간 어둠 주기의 빛 단계에서 기록을 수행하여 일주기 변동성을 최소화합니다.
    2. 유충이 1시간 동안 적응할 시간을 주고 기록하세요.
    3. 60분 동안 이동 활동 기록.
    4. 녹화 중에는 설치를 방해하지 마세요.
      참고: 일주기 변동성을 최소화하기 위해 실험 간 동일한 시간에 기록을 수행하세요.
  6. 행동 추적 소프트웨어 구성
    1. 녹화된 영상을 EthoVision XT(행동 추적 소프트웨어)로 가져오세요(그림 3C).
    2. 다음 설정을 설정하세요: 6개의 아레나, 각 아레나당 5명의 피사체, 중심점 감지, 밀리미터 단위의 거리, 초 단위의 시간 설정.
    3. 비디오 프레임에 있는 자를 사용해 공간 스케일을 보정합니다.
    4. 각 우물에 대해 아레나 경계를 정의하여 각 아레나가 우물 내부를 완전히 포함하되 우물 가장자리를 넘어 확장되도록 하세요.
  7. 탐지 설정 최적화
    1. 소프트웨어 인터페이스(Detection Settings → Reference Image → 학습 시작 단계)를 사용하여 참조 이미지를 생성하세요.
    2. 모든 유충을 잘못 발견하지 않고 정확하게 추적할 수 있도록 검출 임계값을 조정하세요.
    3. 짧은 테스트 획득 테스트를 실행하세요(~2분).
    4. 추적된 경로를 육안으로 점검한 후 전체 분석을 진행하세요. 모든 유충이 검출되었는지, 거품, 이물질, 반사, 또는 우물 가장자리가 유충으로 잘못 식별되지 않았는지 확인하세요.
      참고: 일반적인 아티팩트로는 대형 경기장으로 인한 엣지 트래킹, 거품이나 잔해에 의한 잘못된 감지, 장기간 비활성 시 트래킹 상실이 있습니다.
    5. 지속적인 추적 실패, 과도한 경로 횡단, 눈에 띄는 잔해 또는 기포, 죽은 유충, 이상 형태, 또는 유정 가장자리에 갇힌 유충 등으로 신뢰할 수 있는 정량화가 어렵다면 분석에서 우물을 제외하십시오.
    6. 통계 분석 전에 모든 치료군에 동일한 제외 기준을 적용하세요.
  8. 전체 분석 수행 및 데이터 내보내기
    1. 전체 인수를 진행하세요.
    2. 트랙 시각화 및 히트맵 생성(트랙 및 히트맵 → 결과 분석→).
    3. 전체 이동 거리(mm), 평균 속도(mm/s), 이동 횟수 등 대상별 지표가 포함된 원시 데이터 스프레드시트를 내보내세요.
    4. 60분 이상 이동한 총 거리를 주요 운동 종점으로 사용하세요(그림 3D).

figure-protocol-4
그림 3: 운동 행동 기록 설정 및 분석 워크플로우. (A) 공간 보정용 자와 실험 조건 유지를 위한 온도 조절 열원이 있는 조명 패드 위에 위치한 6웰 접시를 보여주는 실험 장치. (B) 유충 움직임을 기록하는 상향식 카메라를 이용한 비디오 수집 장치, 대표적인 추적 오버레이 포함. (C) EthoVision XT(행동 추적 소프트웨어)를 이용한 행동 추적, 유충 이동의 자동 탐지 및 추적 사례. (D) 비디오 획득부터 운동 행동의 정량적 분석까지의 단계를 개괄하는 워크플로우 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

6. 데이터 분석

  1. 분석을 위한 이미지 준비
    1. 피지에서 오픈 사전 처리 및 처리 후 이미지 쌍(ImageJ, 이미지 분석 소프트웨어)을 운영하고 있습니다.
    2. 이미지를 Z-스택으로 획득할 경우, 최대 강도 투영(Image → Stacks → Z Project → 최대 강도)를 생성합니다.
    3. 데이터셋 내 모든 이미지에 대해 동일한 고정 디스플레이 설정을 사용하여 밝기/명암비를 조정합니다. 정량적 측정에는 자동 스케일링을 사용하지 말고, 원본 조정되지 않은 이미지에 대해 형광 정량을 수행하세요.
  2. 관심 영역(ROI) 정의
    1. 다각형 선택 도구를 사용해 치료 전 이미지에서 간뇌성 DA 뉴런 클러스터 주위에 ROI를 그리세요. 형광 영상에서 보이는 해부학적 랜드마크, 예를 들어 눈의 내측 가장자리와 두뇌의 복측 중앙선을 포함하여 ROI 경계를 정의합니다(그림 2). ROI가 인접한 형광 구조로 확장되지 않고 전체 DA 뉴런 클러스터를 포함하도록 해야 합니다. 운영자 간 일관성을 위해 대표적인 ROI 템플릿을 저장해 모든 팀원에게 공간적 참조로 배포하세요.
    2. "t"를 눌러 ROI를 ROI Manager에 추가하세요.
    3. ROI를 적용하기 전에 눈과 복측 간뇌 등 해부학적 랜드마크를 사용하여 치료 전후 이미지를 정렬하세요. 정렬을 확인한 후에만 동일한 ROI를 치료 후 매칭 이미지에 적용하세요.
    4. 재현성과 재분석을 위해 각 판의 모든 ROI를 저장하세요.
  3. 형광 강도를 정량화합니다
    1. 측정 설정(분석 → 측정값 설정)을 설정하고 "영역"과 "평균 회색값"을 선택하세요.
    2. 각 이미지를 측정하세요(분석→ 측정).
    3. 같은 이미지 내 인접한 비뉴런 영역에서 배경 형광을 측정하고 DA 뉴런 ROI 측정에서 이를 빼는 것입니다. 배경 보정 통합 밀도를 다음과 같이 계산합니다: 보정된 IntDen = IntDenROI − (면적ROI × 평균 배경).
    4. 각 유충의 형광 보유 비율을 IntDen(처리 후) / IntDen(전처리 상태)으로 계산합니다.
    5. 동일한 판에서 평균 차량 제어 값에 형광 보존비를 정규화합니다. 처리 그룹19를 비교하기 전에 각 판별로 차량 통제 평균을 별도로 계산하십시오.
      참고: 고처리량 분석을 위해서는 자동 ROI 검출기능을 갖춘 CellProfiler(이미지 분석 소프트웨어)를 사용하여 동일한 정량화를 수행하세요.
  4. 쌍별 통계 분석 수행
    1. 한 처리군과 한 대조군 간의 비교를 위해, 그룹 간 분산이 같다고 가정하지 않는 쌍이 없는 양측 웰치 t-검정을 수행한다.
    2. 그룹마다 분산이 달라질 때 이 검정을 사용하세요.
  5. 다그룹 통계 분석 수행
    1. 여러 처리 그룹이 포함된 실험에 대해 일원 ANOVA를 수행하세요.
    2. GraphPad Prism 또는 동등한 통계 소프트웨어를 사용해 Dunnett의 사후 검정을 적용하여 각 처리 그룹을 대조군과 비교하세요.
  6. 통계 결과 보고
    1. 유의성 임계값을 α = 0.05로 설정하세요.
    2. 범주적 임계값이 아니라 정확한 p-값을 보고하세요.
    3. GraphPad Prism 또는 동등한 그래프 소프트웨어를 사용해 평균 ± 표준오차(SEM)로 데이터를 표시하고, 개별 데이터 포인트를 산점도로 겹쳐 표현합니다.
    4. 표본 크기(n), 통계 검정, 검정 통계량, 자유도, 그리고 그림 전례의 정확한 p-값. 대규모 데이터셋의 경우, 전체 통계 결과를 보조 표에 포함하세요.
      참고: 스크리닝 분석의 경우, 각 플레이트의 Z-인자를 Z = 1 − [3(σp + σn)/|μp − μn|]로 계산하세요. 여기서 σp 와 μp 는 차량 대조군의 표준편차와 평균이고, σn 과 μn 은 MTZ 전용 대조군의 표준편차와 평균입니다. Z 인자 > 0.5가 선별 검사에 적합하다고 간주됩니다.

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결과

MTZ 치료는 용량 의존성 도파민성 신경세포 손실과 운동 장애를 유발합니다

MTZ 매개 DA 뉴런 절제의 최적 매개변수를 결정하기 위해, DA 뉴런 생존 대리 지표로 사용되는 형광 강도와 운동 거리를 3, 4.5, 9 mM MTZ 농도에서 24시간 치료 후 평가하였다. 각 처리 그룹은 n = 10명의 개별 Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry) 유충은 매칭된 차량 대조군(200 μM PTU를 사용한 BEW에서 1% DMSO, n = 10). 유충은 검증된 동형접합 육종자로부터 채집된 단일 클러치에서 유래했습니다. MTZ 처리는 차량 처리된 대조군에 비해 DA 뉴런 형광의 선량 의존적 감소를 보였으며, 이는 대표적인 형광 이미지(그림 2)와 형광 정량(그림 4B)에서 확인할...

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토론

이 프로토콜은 NTR–MTZ 화학유전생 시스템을 이용해 형질전환 제브라피시에서 DA 신경 손실을 정량화하고 신경보호 화합물을 스크리닝할 수 있는 확장 가능한 생체 내 파이프라인을 제공합니다. 표준화된 판 기반 워크플로우는 학부생 연구팀을 위해 특별히 개발되었으며, 운영자 이직률이 높고 학기 간 연구자 경험이 다르기 때문입니다. 워크플로우의 각 단계는 재현성과 학습 용이성을 우선시하도록 구조화되어 여러 사용자 간에 최소한의 변동성으로 일관된 실행을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 표준 워크플로우에서 쌍으로 이루어진 치료 전후 DA 신경 이미징과 판 기반 행동 분석을 결합하여 기존의 제브라피시 기반 신경퇴행 방법을 발전시켰으며, 동일한 확장 가능한 스크리닝 플랫폼 내에서 구조적 뉴런 손실 측정과 기능적 운동 결과를 비교할 수 있게 합니다. 이 워크플로우를 사용하면 96웰 플레이트 한 장을 4 dpf로 임베딩하고 기준선 영상을 찍고, 24시간 처리한 후 5 dpf로 재영상화...

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공개 사항

저자들은 금전적 이해 충돌이 없음을 선언합니다.

감사의 글

형질전환 제브라피시를 제공해 준 캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스의 수 궈 박사와, 야생형 배아와 제브라피시 사육 및 어류 시설 유지에 관한 지침을 제공해 준 엄 대석 박사, 마이클 파슨스 박사, 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스에 감사드립니다. 또한 수상 시설에 인프라를 제공해 준 로버트 A. 마 분자 혁신 센터와 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 폴링 리브 이노베이션 빌딩 직원들에게도 감사드립니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
성어 제브라피쉬 사료, 0.5 mm 펠릿ZeiglerAH271일상적인 사육 중 성어 제브라피쉬 사료에 사용
아가로오스, 저용융점(LMA)Sigma-AldrichA9414-10G이미징 중 안정적인 위치 지정을 위해 우물에 애벌레를 박제하는 데 사용
알루미늄 호일ULINES-20197MTZ와 같은 광에 민감한 시약을 준비하고 배양할 때 사용
CellProfilerBroad InstituteRRID: SCR_007358선택적 자동화된 형광 이미지 분석에 사용
원추형 튜브, 15 mLCorning352097시약 준비 및 시료 취급에 사용
원추형 튜브, 50 mLCorning352070시약 준비 및 용액 저장에 사용
교배 탱크(1.0 L)AquaneeringZHCT100제어된 제브라피쉬 사육 및 배아 수집에 사용
Danio rerio (AB 야생형)——나이트로레덕타제 의존 효과의 특이성을 검증하는 데 사용되는 비형질전환 대조 계통
Danio rerio (Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry))——표적화된 화학유전 억제를 위해 도파민성 뉴런에서 나이트로레덕타제-mCherry를 발현하는 형질전환 제브라피쉬 계통
디메틸 설폭사이드(DMSO), 무수(≥99.9%)Sigma-Aldrich472301-500MLPTU, MTZ 및 스크리닝 화합물용 용매
EthoVision XTNoldusRRID: SCR_000441애벌레의 운동을 정량화하는 데 사용되는 행동 추적 소프트웨어
Fiji (ImageJ)NIHRRID: SCR_003070형광 정량화에 사용되는 이미지 분석 소프트웨어
세밀한 팁의 포셉 또는 0.25 mm 프로브World Precision InstrumentsWPI0118아가로오스 박제 중 애벌레 방향 지정에 사용
형광 현미경Zeiss11845460mCherry 형광을 통해 도파민성 뉴런을 이미징하는 데 사용
Gemma Micro 150 ZF (유소 사료, 100–200 µm)Skretting10818945유소 제브라피쉬 사료에 사용
Gemma Micro 75 ZF (애벌레 사료, 50–100 µm)Skretting10818935애벌레 제브라피쉬 사료에 사용
GraphPad PrismGraphPadRRID: SCR_002798데이터 분석 및 플로팅에 사용되는 통계 분석 소프트웨어
히트 블록(42°C 및 70°C 가능)Thermo Fisher88870001제어된 온도에서 아가로오스를 녹이고 유지하는 데 사용
고해상도 카메라(상향식 장착 호환)Basler88-327애벌레의 운동 활동을 기록하는 데 사용
염산(HCl), 0.1 MFisher ScientificSA48-500트리카인 준비 중 pH 조절에 사용
인큐베이터(28.5°C, 14시간 광:10시간 암 광주기)MilliporeZ763314제브라피쉬 발달을 위한 제어된 환경 조건 유지
Instant Ocean 바다 소금Instant OceanSS15-10파란 알 물(BEW) 준비에 사용
광 확산 시트(또는 동등한 것)Edmund Optics27-103행동 기록 중 균일한 조명을 제공하고 눈부심을 최소화하는 데 사용
광 패드LightcraftLC2004LED운동 추적 중 하단 조명 제공
메트로니다졸(MTZ)Sigma-AldrichM3761-100G도파민성 뉴런의 화학유전 억제에 사용
메틸렌 블루, 1% 수용액Sigma-AldrichM9140배아의 미생물 성장을 방지하기 위해 BEW에 첨가
마이크로센트리퓨지 튜브, 1.5 mLEppendorf22363204시약 알리쿼트 및 저장에 사용
마이크로파이펫, P200GilsonFP10005S애벌레 취급 및 용액 준비에 사용
100 mm 페트리 접시CorningCLS430167배아 수집 및 배양에 사용
파이펫 팁, 200

참고문헌

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