환자 유래 골수 및 말초혈 단핵세포에 적용된 군집형성 단위 분석법

요약

이 프로토콜은 환자의 골수 및 말초혈 단핵세포에서 유래한 인간 조혈 줄기세포 및 전구세포의 분화를 유도하는 절차를 설명합니다. 이 검사법은 적혈구 및 골수계통 확립을 지원하는 반고체 배양지를 사용하며, 전임상 약물 특성화를 위한 재현 가능한 집락 분류를 위한 표준화된 지표를 통합합니다.

초록

콜로니 형성 단위(CFU) 검사법은 골수형성이상증후군(MDS)과 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함한 혈액 질환을 연구하는 기초 기초입니다. 이 분석법은 반고체 배지를 사용하고, 정의된 사이토카인 조합을 보충하여 적혈구 및 골수체 전구세포의 3차원 성장과 계통별 특이적 분화를 지원합니다. 그러나 환자 유래 말초혈액 및 골수 샘플은 생존 능력 저하, 다루기 민감성 증가, 군락 성장 변동성 등으로 인해 기술적 어려움을 겪습니다. 더불어, 기존 군집 식별 및 계수 지침은 군체 크기와 계통 유형 정의에 상당한 변동성이 있어 연구 간 재현성이 제한되고 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 MDS 및 AML 환자 샘플에서 분리된 조혈 줄기세포 및 전구세포의 성장과 분화에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 부드러운 세포 처리, 환자 표본의 멸균 처리, 최적화된 배양 조건, 그리고 환자 유래 세포에 맞춘 성장 기간을 강조합니다. 이 프로토콜은 환자 유래 샘플을 이용한 CFU 검사의 실용적인 틀을 제공하며, 혈액학 악성 종양 연구에서 일관된 콜로니 카운팅 및 분석을 위한 표준 지표를 확립합니다.

서론

조혈은 골수 지위에 존재하는 조혈줄기세포(HSC)가 모든 성숙한 혈액 세포 계통을 생성하는 엄격하게 조절되는 과정입니다. 계층적 분화 과정을 통해 HSC는 다능 전구세포를 생성하며, 이들은 점차 적혈구, 골수계, 림프구 계통에 전념하다가 말단 성숙하여 기능하는 순환 혈액세포로 성장합니다. 이 과정은 골수 미세환경 내에서 조정된 신호전달과 내재적 전사 및 후생유전학적 조절 메커니즘에 의해 지배됩니다. 특히 HSC에서 유전적 또는 체세포 돌연변이가 축적되면서 이러한 조절 경로가 교란되면, 정상적인 분화가 저해되고 비정상 전구세포의 클론 확장을 초래할 수 있습니다. 이러한 변화는 궁극적으로 비효율적인 조혈과 세포감소증을 특징으로 하는 혈액학적 질환, 예를 들어 골수이형성 증후군(MDS)과 급성 골수성 백혈병(AML^)을 초래할 수 ^{있습니다.}

콜로니 형성 단위(CFU) 분석법은 조혈 줄기세포 및 전구세포(HSPC)의 분화 가능성을 평가하기 위한 잘 확립된 시험관 내 기법입니다. 원래 조혈 전구세포 ^6,7,8의 증식 및 분화 능력을 측정하기 위한 단기 검사로 개발된 CFU 검사법은 이후 임상 및 실험^{혈액학 모두}에서 널리 사용되는 도구가 되었습니다. 전임상 실험실 환경에서 이 분석법은 유전적 교란이나 후보 치료제가 조혈 분화에 미치는 영향을 평가하는 데 자주 사용됩니다. MDS 및 AML 연구 맥락에서 CFU 검사는 분자 및 유전적 변화가 환자 유래 골수 또는 말초혈액 세포의 분화 능력에 어떻게 영향을 미치는지 이해하기 위한 기능적 판독을 제공합니다.

CFU 분석은 혈통 특이적 확장과 분화를 지원하는 정의된 성장 인자를 보충한 메틸셀룰로오스 기반 반고체 배지에서 HSPC 배양하는 과정을 포함합니다. 이러한 조건에서 전구세포는 증식하여 분리된 집단을 형성하며, 이는 계통 동일성에 따라 형태학적으로 분류될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 적혈구 및 골수계 분화에 최적화된 상업적으로 이용 가능한 메틸셀룰로오스 기반 반고체 배지를 사용합니다. 배지에는 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-6(IL-6), 줄기세포 인자(SCF), 에리트로포이에틴(EPO), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 그리고 그립적구-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF) 등 사이토카인이 복합적으로 포함되어 있습니다. 이 인자들은 함께 콜로니 형성 단위 적혈구(CFU-E), 폭발 형성 단위 적혈구(BFU-E), 골수형 그립적구-대식세포 전구(CFU-GM), 그리고 과립구, 적혈구, 단핵구, 메가핵세포 전구(CFU-GEMM)와 같은 다능성 전구의 성장을 지원합니다^10,11.

광범위한 용도에도 불구하고, 위에서 언급한 반고체 배지는 거대핵세포와 혈소판의 분화를 충분히 지지하지 못해 분화 능력이 제한적입니다. 이러한 용도에는 혈소판 성장인자를 포함한 보다 전문화된 제형이 더 적합하며; 하지만 이들은 해당 프로토콜의 범위 밖입니다. 전반적으로, 배지 제형의 신중한 선택과 형태학적 평가 및 유세포분석과 같은 후속 분석을 결합함으로써, 연구자들은 계통 약속과 분화 잠재력 분석을 통해 약물 민감도를 효과적으로 평가할 수 있습니다^.

본 연구에서는 CFU 검사를 사용하여 재발/난치성 고위험 MDS 치료를 위한 복합 요법의 치료 잠재력을 조사합니다. 피리메타민은 톡소플라즈마증과 기생충성 말라리아 치료에 사용되는 임상적으로 승인된 항폴레이트제이며, 최근에는 항암제로 연구되고 있습니다 13,14,15. 최근 연구들은 피리메타민 치료가 신규 피리미딘 합성을 조절하는 주요 경로를 억제함으로써 작용할 수 있음을 입증했습니다¹⁶. 이 프로토콜에서는 CFU 검사를 사용하여 피리메타민의 단일 제제 치료법 및 현재 MDS 및 AML 치료의 1차 치료인 베네토클락스와의 병용 요법으로서의 임상 효능을 조사합니다^17,18.

광범위한 유용성에도 불구하고, CFU 측정법은 여러 기술적 한계를 제시합니다. 군체 식별과 분류는 형태학적 기준에 크게 의존하며, 이는 관찰자 간과 연구 센터 간 변동성을 초래할 수 있습니다^{6, 19, 20, 21}. 또한, MDS 또는 AML 환자에서 얻은 환자 샘플은 세포 생존력 저하, 취약성 증가, 이질성을 보여, 콜로니 형성과 후속 분석을 복잡하게 만들 수^{있습니다.} 따라서 유세포분석을 포함한 추가 특성 분석을 위한 집락 준비는 세포 무결성을 유지하기 위해 신중한 취급이 필요할 수 있습니다. 군체 식별, 계수, 후속 분석에 대한 표준화된 절차의 부재는 연구 간 변동성을 더욱 증가시킵니다. 이러한 기술적 고려사항은 환자 유래 조혈 샘플에 최적화된 표준화된 절차의 필요성을 강조합니다.

이 프로토콜은 혈액학적 악성 환자의 원발성 골수 또는 말초혈 표본에서 유래한 단핵세포를 이용한 CFU 검사를 수행하는 최적화된 워크플로우를 제시합니다. 이 접근법은 민감한 환자 유래 세포를 다루는 실질적인 전략, 신뢰할 수 있는 배양 조건 확립, 그리고 군집 식별 및 정량을 위한 일관된 기준 구현에 중점을 둡니다. 상세한 방법론적 지침을 제공하고 재현 가능한 분석 관행을 강조함으로써, 본 프로토콜은 MDS 및 AML의 전임상 연구에서 조혈 분화 및 치료 반응의 신뢰성 평가를 촉진하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

이 연구는 알버트 아인슈타인 의과대학/몬테피오레 의료센터의 기관심의위원회(IEB) 승인 프로토콜인 "양성 및 악성 혈액 질환의 분자 생물학"(IRB 프로토콜 #200536)에 따라 바이오뱅크에서 얻은 식별 해제된 인간 생체 샘플을 활용합니다. 모든 절차는 기관 윤리 지침에 따라 진행되었습니다. 모든 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 환자 유래 골수 또는 말초혈 단핵세포 제조

참고: 일반적인 환자 샘플 취급 지침에 따르면, 혈액 매개 병원체 노출로부터 개인 보호를 위해 전신 실험복과 찢어지지 않는 일회용 장갑을 착용하고, 실험실 세포 배양 후드 아래에서 작업할 것을 권장합니다. 환자 세포에 접촉하는 모든 피펫 팁과 혈청학적 피펫은 생물학적 폐기물에 버리기 전에 최소 30분 이상 표백제 용액에 담가야 합니다.

1. 실험적 준비
   1. 따뜻한 IMDM 배지, 태아 소 혈청(FBS), 페니실린-스트렙토마이신(Pen-strep) 항생제를 37°C에서 최소 30분간 투여.
   2. 반고체 매체는 4°C에서 하룻밤 동안 해동하세요. 플레이팅 당일에는 병을 실온(RT)으로 최소 30분 이상 데우세요.
   3. 세포 배양 후드를 UV 멸균으로 15분간 소독한 후, 후드 표면, 피펫, 튜브 선반에 70% 에탄올(EtOH)을 뿌립니다.
   4. 오염된 피펫 팁과 혈청학적 피펫을 수집할 수 있을 만큼 충분한 10% 표백제 용액이 담긴 폐비커를 준비하세요.
   5. 밀도 구배 원심분리 방법으로 골수 또는 말초혈 단핵세포를 분리합니다. 세포는 채취 당일에 사용하거나 냉동 바이오뱅크 샘플에서 사용할 수 있습니다.
2. 샘플을 냉동한 경우, 37°C 수조에서 빠르게 해동하여 대부분의 얼음이 녹고 작은 얼음 결정만 남게 합니다. 해동 후 즉시 샘플을 얼음 위에 올려놓으세요.
   참고: 환자 샘플은 해동에 매우 민감합니다. 세포 사멸을 최소화하기 위해 샘플을 가능한 한 빠르고 한꺼번에 해동하는 것이 중요합니다.
3. 5mL 가열한 완전 성장 배지(IMDM 배지에 4% FBS와 1% 펜-연쇄상구균 보조)에 세포를 현탁합니다.
4. AO/PI 염색 염료와 자동 세포 계수를 사용하여 세포 농도와 생존 가능성을 측정합니다.
5. 셀을 350 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리하여 셀을 알렛으로 만듭니다. 상정액 버려.
6. 세포를 5mL 멸균 Dulbecco's 인산염 완충 식염수(DPBS)에 재현탁합니다. 펠릿 세포를 원심분리하고 상정액을 버리세요.
7. 세포를 완전한 배지 내에서 200만 개의 생세포/mL 농도로 현탁합니다. 6웰 플레이트의 웰당 100K 셀 분량의 셀을 준비하세요.

2. 약물 준비 및 치료 투여.

참고: 피리메타민은 동성 분말로 얻어지며, 100 mM 농도로 디메틸 설폭화물(DMSO)에서 내부에서 재구성됩니다; 알리코트는 −80°C에 저장됩니다. 베네토클락스는 DMSO에 미리 용해된 상태로 10 mM 농도로 구입하여 -20 °C에서 보관합니다. 이 실험에서는 베네토클락스와 피리메타민을 차량 대조군 DMSO 치료 조건과 병행하여 자유 흡수 를 통해 단일 용량으로 투여합니다.
주의: 피리메타민, 베네토클락스, DMSO는 생물학적 위험 물질입니다. 보닛 아래에서만 다루고, 개인 보호 장비를 착용하며, 각별히 조심해서 사용하세요.

1. 도금 당일에는 얼음 위에서 해동한 약물 알리코트, 소용돌이를 사용하고, 테이블탑 미니 원심분리기에서 최대 속도로 30초 동안 회전시킵니다.
2. 소용돌이를 하고 반고체 매체 한 병을 격렬하게 혼합하여 모든 성분이 균질화될 때까지 합니다. 후드 안에서 30분간 방치해 거품이 표면으로 올라오도록 하세요.
3. 멸균된 15mL 원뿔 튜브에 반고체 배지 3mL 알리코트를 준비합니다. 튜브를 30분간 방해받지 않고 두어 거품이 표면으로 올라오도록 하세요. 초반고체 미디어 알리코트는 다시 냉동하여 -20°C에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.
4. 반고체 배지에 약 부피를 10 μL 이하로 추가하지 마세요. 이 실험에서는 베네토클락스와 피리메타민 농도를 경험적으로 결정된 시너지 조건에 따라 조정합니다. 차량 대조군에 동등한 부피의 DMSO를 추가하세요. 각 질환마다 3mL 알리코트를 복제해 준비하세요.
   참고: 반고체 배지 내 약물 농도에 영향을 주지 않도록 첨가된 약물 양을 무시할 만한 양으로 유지하는 것이 중요합니다.
5. 보텍스 미디어는 4-5번의 짧은 폭발로 나누어 약물을 완전히 포함시킵니다.
   참고: 세포 혼합물을 소용돌이에 장기간 보관하지 마세요. 이는 세포 사멸을 초래할 수 있습니다.
6. 반고체 배지의 3 mL 알리코트에 100 μL 또는 200,000 세포에 해당하는 부피를 추가합니다. 소용돌이 혼합물을 짧은 간격으로 가열하다가 완전히 통합되거나 균질화됩니다.
7. 무딘 끝 16G 바늘을 3mL 주사기에 연결하고, 바늘과 주사기를 세포 혼합물에 떨어뜨립니다. 거품이 표면으로 올라오도록 30분간 건드리지 않고 두세요.

3. 약물 처리 세포 현탁 플레이트.

1. 침수된 바늘과 주사기를 사용해 세포와 약물 혼합물을 채취하며, 공기 방울을 흡입하지 않도록 주의하세요. 3–5분을 기다린 후 15mL 원뿔관 옆면에 남은 혼합물을 꺼내세요.
2. 멸균 6웰 플레이트에서는 세포 혼합물을 드롭 방향으로 추가하며, 플레이트의 바깥 기둥 두 웰에 큰 드롭을 번갈아 가며 분배합니다. 플레이트를 부드럽게 원을 그리며 기울여 웰 바닥 전체를 고르게 덮어 혼합물을 펴 뿌리세요. 이 두 유정은 기술적 복제품입니다.
   참고: 기포가 생기거나 우연히 웰에 첨가되면, 피펫 필터 팁을 사용해 기포를 부드럽게 터뜨리거나 플레이트 가장자리로 옮기세요. 판에 남아 있는 큰 기포는 군집 성장에 영향을 줄 수 있습니다.
3. 콜로니 분석 혼합물은 6웰 플레이트의 바깥 기둥에만 첨가합니다. 중앙 기둥에는 각 우물에 멸균수 5mL를 추가하세요. 우물에 물을 추가하면 반고체 매질이 마르지 않도록 충분한 수분이 유지됩니다.
4. 플레이트를 5%_CO2가 포함된 37 °C 인큐베이터에서 배양하세요. 세포 성장과 수분 수분을 주 2회 모니터링하세요. 세포는 플레이트 부착 후 약 7일경 눈에 보이는 콜로니를 형성해야 하며, 플레이트는 플레이트 후 14일에서 21일 사이에 75%–80% 합류율에 도달해야 합니다.

4. 군체 영상 및 계수

참고: 이 프로토콜은 EVOS M7000 영상 시스템에서 검증된 매개변수를 설명합니다. 이러한 설정은 다른 플레이트 이미징 시스템과의 호환성을 위해 최적화되거나 조정되어야 할 수 있습니다.

1. 현미경 플랫폼에서 보호 광 필터 덮개를 제거하세요. 현미경을 켜고 관련 소프트웨어 프로그램을 열어보세요.
2. 현미경 장치의 상단 렌즈에 빛 디퓨저를 삽입합니다.
3. 플레이트 위치를 플랫폼에 삽입하여 우물 A1이 왼쪽 상단 모서리에 위치하도록 합니다.
4. 영상 소프트웨어에서 다음 초점 설정을 입력하세요:
   1. 촬영할 선박을 선택하세요. 이 프로토콜에서는 6웰 플레이트가 사용됩니다.
   2. 목표 지점을 4배로 설정하세요.
   3. 광원을 트랜스(Trans )로 선택하거나 현미경을 밝은 시야 모드로 전환하세요.
   4. 현미경 조명을 켜고 거친 슬라이더를 사용해 빛 세기를 수동으로 조절하세요. 이 프로토콜에 사용되는 기기의 경우 군락 영상 최적 범위는 약 0.03입니다.
   5. 기기에 자동 초점 기능이 있다면 초점을 조절하는 데 사용하세요. 필요하다면 수동 파인포커스 설정을 사용해 초점을 더 조정하세요.
5. 다음 자동 이미지 캡처 설정을 입력하세요:
   1. 각 웰에서 영상화할 전체 영역을 선택하세요.
   2. 자동 이미지 캡처를 선택하여 우물 중앙에서 시작해 나선형 방향으로 가장자리를 향해 나선형으로 이동하게 합니다.
   3. 각 웰에서 기기가 다시 초점을 맞추도록 자동 초점 설정을 선택하세요.
   4. 각 웰에서 RAW 이미지를 타일링하거나 병합하도록 선택하세요.
   5. 이미지를 수평과 수직으로 뒤집을 선택하세요.
   6. "타일드 이미지"와 "병합된 이미지"를 수집하려면 데이터 저장 설정을 선택하세요.
   7. 자동 번호판 스캔을 실행하세요. 이 프로토콜에 사용되는 기기는 1.5분 속도로 작동합니다.
   8. 플레이트를 제거하고, 보호 필터 커버를 현미경 플랫폼 위에 덮은 뒤 현미경을 끄고 소프트웨어를 종료하세요.
   9. 영상 촬영 후, 타일로 합쳐진 우물 이미지를 사용해 각 우물의 개별 군락 총수와 골수종 및 적혈구 아형을 수동으로 세어보세요.
6. 다음 형태학적 특징에 따라 군집을 정의합니다:
   1. 개별 집단이나 집단 중 하나가 다른 세포 집단에서 충분히 멀리 떨어져 있을 때, 즉 그 집단의 길이와 같은 거리를 구분한다고 생각해보자. 이 거리 제한 내에 있는 개체군은 하나의 집단 집단으로 묶입니다.
   2. 적혈구 집락이 짙게 색소가 짙고 짙은 붉은색을 띠도록 하세요. 이 군체들은 뚜렷한 경계를 가진 밀집하게 성장하는 단일 개체군 또는 군집으로 나타납니다. 성장이 느린 미성숙 세포 집단으로 구성된 작은 적혈구 집락은 CFU-E로 분류됩니다. 더 성숙한 개체군을 가진 더 큰 집단은 BFU-E로 분류됩니다.
   3. 골수계 집락에 더 반투명하고 색이 밝은 세포가 있는지 확인하세요. 골수형 군락은 더 분산되어 있으며 뚜렷한 경계를 포함하지 않습니다. 골수계 집락은 군집보다는 단일 집단으로 더 자주 성장하는 경향이 있으나, 가끔 군집이 관찰되기도 합니다. 두 경우 모두 골수성 집락은 CFU-GM으로 분류됩니다.
   4. 적혈구와 골수계 아형을 모두 포함하는 혼합 집단을 CFU-GEMM으로 분류합니다.

5. 유세포분석을 통한 세포 채취 및 냉동 분석

1. 시작하기 전에 아래 단계를 수행하세요:
   1. a. 형광 활성화 세포 분류 완충제(FACS 버퍼, DPBS/4% FBS 구성)와 동결 배지(FBS/10% DMSO)를 37°C 수조에서 최소 30분간 가열합니다.
2. 각 웰 표면에 5mL의 가열된 FACS 버퍼를 추가하세요. 반고체 배지를 용해하기 위해 37°C 인큐베이터에서 최소 30분간 배양판을 배양합니다.
3. 5mL 피펫으로 세포를 철저히 재현탁한 후 멸균된 50mL 원뿔 튜브로 옮깁니다.
4. 5mL의 가열된 FACS 버퍼를 사용해 각 웰을 3번 세척한 후 전체 부피를 50 mL 원뿔 튜브로 옮깁니다.
5. 세포를 4–5번의 짧은 소용돌이 소용돌이 부속으로 잘 재현지한 후, 400 x g 에서 10분간 RT에서 원심분리하여 펠릿 세포에 넣습니다. 원심분리 후 펠릿이 보이지 않으면 세포는 반고체 배지 내에 떠 있습니다. 흡입하지 않고 튜브에 10–15mL DPBS를 추가하여 반고체 배지를 더 희석하고 잘 재현탁합니다. 필요하다면 37 °C에서 10–15분간 배양하여 배지를 완전히 녹인 후 다시 세포 펠릿을 투여합니다.
6. 상청액을 흡인하고 세포를 10 mL FACS 완충액에 재현탁합니다. 400 x g 에서 10분간 RT에서 원심분리기로 펠릿 세포를 만듭니다.
7. 냉동 배지에 세포를 재현탁하고 300만 개의 세포를 냉동 보관 상태로 분리하세요. 바이알을 -80 °C에서 조절 속도 냉동 용기에 24시간 동안 냉동하여 분당 1 °C의 냉각 속도를 달성하세요.
8. 크라이오비얼은 가능한 한 빨리 액체 질소 저장소로 옮겨.
   참고: -20 °C에서 장기간 보관된 샘플은 생존율이 감소합니다. 장기 보관을 위해 세포를 액체 질소로 옮기는 것이 중요합니다.

결과

그림 1은 환자 샘플 분리부터 집락 개수 및 집단 형태 분석까지의 집단 분석 과정을 보여줍니다. 그림 2 는 밝방야 현미경에서 군집 이미징의 주요 설정을 보여줍니다. 그림 3과 그림 4 는 플레이트 이식 13일 후 단일 환자 유래 샘플에서 집락 형성의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 그림 3에서는 집단이 자동 형광 영상 시스템을 통해 촬영됩니다. 이미지는 형태에 따라 집단수를 수동으로 세어 점수를 매깁니다. 그림 3A 는 대조군 DMSO 처리 세포와 피리메타민 단일 약물, 베네토클락스 단일 약물, 그리고 병용 ...

토론

여기서 설명된 프로토콜은 환자의 1차 골수 및 말초혈 샘플을 이용한 CFU 검사를 수행하는 최적화된 워크플로우를 개략적으로 제시하며, 특히 세포 생존력 유지와 재현 가능한 콜로니 성장 보장에 중점을 둡니다. 환자 유래 샘플을 다룰 때 신뢰할 수 있는 콜로니 형성을 달성하기 위해 프로토콜의 여러 단계가 매우 중요합니다. 냉동 보존 단핵 세포의 빠른 해동 후 즉시 냉각하는 것은 세포 생존 보존에 필수적입니다. 장기간 해동은 연약한 1차 샘플에서 세포 사멸을 크게 증가시킬 수 있기 때문입니다. 세척과 재현각 단계 시 부드럽게 다루는 것도 중요한데, 과도한 기계적 스트레스는 전구동물의 생존을 감소시키고 군집 형성에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문입니다.

메틸셀룰로오스 기반 반고체 배지 준비도 신중한 취급이 필요합니다. 배지 내에서 사이토카인과 보충제를 균질화하기 위해서는 철저한 혼합이 필요하며, 도금 전에 혼합물을 휴지시키면...

재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	MethoCult 배지 분배 및 플레이팅용
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	세포 카운터
CHT4 Counting Chambers (세포 카운터 슬라이드)	Revvity	CHT4-SD100-002	세포 카운터용 슬라이드
Dimethyl sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231-100	약물 재구성 및 세포 동결 배지용
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	세포 배양용
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	세포 배양 표면 멸균용
EVOS M7000 이미징 시스템	ThermoFisher Scientific	AMF7000	콜로니 및 플레이트 이미징용
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106	세포 배양 및 동결 배지 보충제
IMDM Modified Culture media	Cytiva	SH30228.01	환자 샘플 처리에 적합한 농축 배양 배지
LuerLok Tip 3 mL Syringes	BD	309657	MethoCult 배지 분배 및 플레이팅용
MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	04435	콜로니 분석용 메틸셀룰로오스 반고체 배지
Multiwell 6-well plate	FALCON	353046	콜로니 분석 플레이팅용
Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence Microscope	Coastal Microscopes	51623	콜로니 형태 이미징 및 특성화용
Pen Strep	Gibco	15140-122	세포 배양용 항생제 보충제
pyrimethamine	Sigma-Aldrich	46706	FDA 승인 항엽산제
UltraPure Distilled water	Invitrogen	10977-015	콜로니 분석 플레이팅용
venetoclax	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	FDA 승인 화학 요법
ViaStain AOPI Staining Solution	Revvity	CS2-0106	생세포 계수용 생존성 염색

```