본 프로토콜은 표준화된 분석법(ALP 활성, RANKL 면역형광 [골 형성], DMP-1 면역형광 [상아 형성])과 연구 간 비교 가능성을 보장하기 위한 표준화 전략을 사용하여, 나노물질 스캐폴드 상에서 배양된 인간 치아 줄기세포의 증식 능력과 골 형성 및 상아 형성 분화 능력을 평가하기 위한 표준화되고 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.
방법 논문
나노물질 스캐폴드 상에서 인간 치수 줄기세포의 분화 및 증식을 평가하기 위한 표준화된 In Vitro 프로토콜
이 논문에서
요약
초록
골 형성 및 치성 분화와 줄기세포 증식에 대한 신뢰할 수 있는 평가는 스캐폴드 기반 재생 전략의 생물학적 성능을 평가하는 데 필수적입니다. 그러나 실험 프로토콜, 분석법 선택 및 데이터 해석의 가변성으로 인해 재현성과 연구 간 비교가 제한되는 경우가 많습니다. 본 논문에서 설명하는 프로토콜은 생체 재료 스캐폴드 상에서 배양된 줄기세포의 골 형성 및 치성 분화와 증식 능력을 체외(in vitro)에서 평가하기 위한 표준화되고 재현 가능한 워크플로우를 제시합니다. 골 형성 분화는 alkaline phosphatase (ALP) 효소 활성과 Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand (RANKL) 면역형광법으로 평가하며, 치성 분화는 DMP-1 (dentin matrix protein-1) 면역형광법으로 평가합니다. 두 단백질 종점은 표준화된 H-score 방법론을 사용하여 정량화합니다. 세포 파종 밀도, 유도 일정, 분석 조건, 정규화 전략(단백질 정규화 ALP 활성, 세포 정규화 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 생존율 및 면역형광 H-score 포함) 및 데이터 분석 접근 방식을 포함한 핵심 실험 파라미터와 기술적 가변성을 최소화하기 위한 문제 해결 가이드가 상세히 기술되어 있습니다. 이 방법론은 여러 스캐폴드 기반 실험 연구에서 표준화된 프레임워크로 적용되어 견고함과 재현성을 입증하였습니다. 본 논문은 종합적으로 검증된 프레임워크를 제공함으로써 줄기세포-스캐폴드 상호작용의 표준화된 평가를 용이하게 하고 전임상 재생 연구 간의 비교 가능성을 높이는 것을 목표로 합니다.
서론
재생 근관치료학은 줄기세포, 성장 인자 및 지지체의 사용을 통해 치수 활성도를 회복시키는 데 중점을 두는 치의학의 패러다임 전환을 의미합니다1,2. 치수 활성도를 유지하는 것은 감각 기능과 면역 반응에 필수적이며, 특히 괴사된 치수를 가진 미성숙 치아의 지속적인 치근 발육을 가능하게 하는 관리에 있어 매우 중요합니다2.
인간 치수 줄기세포(DPSCs)와 치근단 유두 줄기세포(SCAPs)는 높은 증식 잠재력, 자기 복제 능력, 면역 억제 특성 및 적절한 미세환경 조건 하에서 상아질 형성 세포 유사 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있어 이러한 시술의 주요 후보군이며, 이는 재생 의학 및 세포 기반 치료 중재의 향후 적용에 매우 유망한 후보가 되게 합니다3,4,5.
규산칼슘 기반 시멘트와 같이 전통적으로 제형화된 재료들에 대한 연구가 이루어져 왔으나, 최근의 증거들은 나노입자 변형이 생체재료와 세포 간의 상호작용에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다6. 나노구조 생체재료는 더 생체 모방적인 미세환경을 제공하여, 잠재적으로 줄기세포의 부착과 계통 특이적 분화를 촉진할 수 있습니다7. 하지만 나노입자 형태의 NeoMTA2와 같은 신소재의 생물학적 거동은 나노하이드록시아파타이트와 같은 기존 재료들에 비해 여전히 충분히 이해되지 않은 상태입니다8. 본 프로토콜은 이러한 상호작용을 정확하고 재현 가능하게 평가하기 위한 표준화된 방법론적 틀의 필요성을 다룹니다.
이 표준화된 프레임워크는 연구 간 비교 가능성이 매우 중요한, 동일한 생물학적 조건 하에서 새로운 생체 재료나 나노 재료 스캐폴드를 평가하는 연구에 특히 적합합니다. 이 방식은 단일 분석법 기반의 접근 방식과 달리, 하나의 워크플로우 내에 생존능 스크리닝(MTT), 초기 골분화 결정(ALP 활성), 단백질 수준의 분화(면역형광 H-score)를 통합함으로써 이점을 제공합니다. 기존의 알리자린 레드 염색이나 단일 시점 분석법을 사용하는 연구자들은 이 다중 파라미터 프레임워크를 도입하여 관찰자 편향을 줄이고 정량적 해상도를 높일 수 있습니다. 다만, 본 프로토콜은 적절한 수정 없이는 3차원 오가노이드 배양, 공동 배양 시스템 또는 동물 유래 줄기세포 모델에 적용하도록 설계되지 않았습니다. 유전자 발현 프로파일링(예: RUNX2, OCN 또는 DSPP에 대한 RT-qPCR)이 필요한 연구자는 현재의 프로토콜이 단백질 및 효소적 종점에만 집중하고 있으므로, 분자 분석법을 통해 이 워크플로우를 보완해야 합니다.
치아 줄기세포의 이중 기능적 분화 능력을 종합적으로 포착하기 위해, 본 프로토콜은 서로 다른 생물학적 종말점을 반영하는 두 가지 상보적인 면역형광 마커를 사용합니다. RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)은 골 형성 계열 결정의 마커로 사용됩니다. 조골세포 유사 세포에서의 RANKL 발현은 칼슘 이온에 의해 유도되는 광화 신호 전달 및 골 형성 세포의 활성화를 반영하며, 이는 SCAPs를 평가한 여러 연구의 사용 사례와 일치합니다4,8,9. 이와 병행하여 DMP-1 (dentin matrix protein-1)은 상아질 형성/상아질 분화의 특이적 마커로 사용됩니다. 상아질모세포 유사 세포에서 DMP-1의 상향 조절은 상아질 기질 형성 및 치수 특이적 경조직 재생의 유도를 반영하며, 특히 표적 세포 집단이 DPSCs인 경우에 매우 유의미합니다10. H-score 방법론을 사용하여 동일한 실험 프레임워크 내에서 RANKL과 DMP-1을 모두 정량화함으로써, 본 프로토콜은 별도의 실험 설계 없이도 줄기세포-지지체 상호작용의 두 가지 중첩되지만 기전적으로는 구별되는 결과인 골 형성 결정과 상아질 형성 결정을 구분할 수 있게 해줍니다.
프로토콜
본 프로토콜은 Ain Shams University 치과대학 윤리위원회의 승인을 받았으며, 승인 번호는 FDASU-Rec IM112105입니다. 인간 조직과 관련된 모든 절차는 헬싱키 선언을 준수하여 수행되었습니다. 치아 추출 및 줄기세포 채취 이전에 모든 참여자로부터 서면 동의서를 받았습니다.
1. 나노재료의 준비 및 특성 분석
- 특정 요구 사항에 따라 나노물질을 합성한다10,11. Nano-NeoMTA2의 경우, 유성 볼 밀(planetary ball mill, 재료 표 참조)을 사용하여 350 rpm에서 3분 온/오프 간격으로 10시간 동안 분쇄한다. 지르코니아 분쇄 용기에 지르코니아 밀링 볼(직경 5 mm)을 사용하여 볼 대 분말의 무게비를 10:1로 설정한다. 다음 단계로 넘어가기 전, 투과전자현미경(TEM)을 통해 최종 입자 크기를 확인한다(목표: <200 nm).
주의: NeoMTA2 분말을 흡입할 경우 호흡기 자극을 유발할 수 있다. 모든 건식 밀링 단계는 N95 호흡기, 보안경 및 니트릴 장갑을 착용하고 인증된 흄후드 내에서 수행한다. - 습식 화학 침전법을 사용하여 나노하이드록시아파타이트를 준비한다8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. 탈이온수만을 사용하여 0.5 M 질산칼슘 용액 1 L와 0.3 M 인산암모늄 용액 0.6 L를 준비한다. 400 rpm으로 지속적으로 교반하면서 질산칼슘 용액을 인산암모늄 용액에 약 2–3 mL/min 속도로 떨어뜨리고, 온도를 70 °C로 가열하며 수산화암모늄을 적하하여 pH 10–12를 유지한다8.
주의: 수산화암모늄은 부식성 물질이며 독성 암모니아 증기를 방출한다. 반드시 화학 흄후드 내에서만 취급한다. 내산성 장갑, 보안경 및 실험복을 착용한다. 피부에 접촉되었을 경우 즉시 물로 15분 이상 씻어낸다. - 결과물인 아파타이트 침전물을 오토클레이브를 사용하여 140 °C, 0.3 MPa에서 2–3시간 동안 수열 처리한다10. 정제된 침전물을 ≤0.05 mbar의 진공 상태에서 -50 °C로 48시간 동안 동결 건조한다8.
- 다음과 같이 졸-겔(sol-gel)법을 사용하여 생체 활성 유리 45S5 나노입자를 준비한다.
- 실온에서 300 rpm으로 지속적으로 교반하며 폴리프로필렌 비커에 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS) 40 mL와 산 촉매인 2 M 질산(HNO₃) 10 mL를 혼합하여 전구체 용액을 준비한다.
- 30분 후, 목표 몰 농도(45 mol% SiO₂, 24.5 mol% CaO, 24.5 mol% Na₂O, 6 mol% P₂O₅)를 맞추기 위해 질산칼슘 사수화물(Ca(NO₃)₂·4H₂O)과 질산나트륨(NaNO₃)을 첨가한다. 인 전구체로 트리에틸 포스페이트(TEP)를 첨가한다.
- 실온에서 24시간 동안 교반한다. 밀폐 용기에서 60 °C로 24시간 동안 겔을 숙성시킨다. 120 °C에서 24시간 동안 건조한다. 머플로(muffle furnace)에서 650 °C로 3시간 동안 소성한다(승온 속도: 2 °C/min). 분쇄 후 TEM 및 X선 회절(XRD)을 통해 상 조성을 확인한다4,9.
주의: TEOS와 에탄올은 가연성 물질이다. HNO₃는 부식성 물질이다. 모든 절차는 점화원으로부터 떨어진 흄후드 내에서 수행한다.
- 준비된 모든 나노입자를 고해상도 TEM 및 XRD로 분석하여 입자 크기와 결정성을 확인한다8. 동적 광산란법(DLS)을 사용하여 평균 입자 크기, 다분산 지수(PDI) 및 제타 전위를 측정하여 콜로이드 안정성을 확인한다. 평균 입자 크기가 <200 nm이고 제타 전위가 <−15 mV 또는 >+15 mV인 배치(batch)만 사용한다.
2. 줄기세포 수확 및 배양
- 서면 동의를 얻은 후10, 갓 발치한 매복 하악 제3대구치에서 DPSC 또는 SCAP를 수집합니다. 발치된 치아는 발치 후 2시간 이내에 처리하고, 4 °C의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 담아 운송합니다.
참고: 공여자 적격성 기준은 18~35세의 전신적으로 건강한 성인, 비흡연자, 최근 3개월 이내에 항생제 사용 이력이 없는 자, 치주 질환이 없는 자, 방사선 사진상 근단 병변의 증거가 없는 자를 포함합니다. - 효소 소화법을 사용하여 세포를 분리합니다9. 치아 조직을 1~2 mm 크기로 잘게 다진 후, 무혈청 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 내 3 mg/mL 농도의 collagenase type I 용액으로 37 °C에서 1시간 동안 rocking platform 상에서 60 rpm으로 지속적으로 교반하며 소화시킵니다8. 완전 배양 배지로 중화한 후 70 µm 세포 스트레이너로 여과합니다.
주의: Collagenase type I에는 엔도톡신이 포함되어 있을 수 있습니다. 엔도톡신 테스트를 거친 조직 배양 등급의 collagenase만 사용하십시오. 장갑을 착용하고 흡입하지 않도록 주의하십시오. - DMEM, 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin으로 구성된 완전 배양 배지를 사용하여 단일 세포 현탁액을 75 cm2 플라스크에 1 × 104 cells/cm2의 초기 밀도로 분주합니다(재료 표)8.
- 플라스크를 37 °C, 5% CO₂ 분위기에서 배양합니다8. 도립 위상차 현미경을 사용하여 매일 성장 상태와 오염 여부를 모니터링합니다10. 배양 배지는 48~72시간마다 교체합니다. 오염 징후(혼탁도, 색상 변화, 비정상적인 세포 형태)가 보이는 플라스크는 폐기하십시오.
- 약 70~80%의 합쳐짐(confluency)에 도달한 3대 계대 후의 세포를 수집합니다8. 계대를 위해 배지를 흡입하여 제거하고, PBS로 세척한 후, 37 °C에서 0.25% trypsin-EDTA를 사용하여 3~5분 동안 세포를 탈착시킵니다. 완전 배양 배지로 중화하고 300 x g 에서 5분간 원심 분리한 후, 1 × 104 cells/cm2 밀도로 다시 분주합니다. 표현형 안정성을 유지하기 위해 계대 3회에서 6회 사이의 세포만 사용하십시오.
3. 줄기세포 특성 분석
- 유세포 분석법을 사용하여 분리된 세포의 면역 표현형을 평가하십시오8,10. 계대 배양 3대에서 세포의 특성을 분석합니다. 염색하지 않은 음성 대조군과 사용된 각 형광색소에 대한 단일 염색 보정 대조군을 포함하십시오.
- PBS 내 세포 수를 106/mL로 조정하십시오. 800 x g에서 10분 동안 원심분리하고 펠렛을 PBS로 두 번 세척하십시오8,10.
- 제조사 권장 희석 배율(일반적으로 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 PBS에서 1:100)로 중간엽 마커(CD44, CD73) 및 조혈 마커(CD45)에 대한 항-인체 항체로 세포를 염색하십시오(재료 표)8,10. 암소 상태로 4 °C에서 45분 동안 배양하십시오. PBS로 두 번 세척하고 분석을 위해 300 µL PBS에 재부유하십시오.
- 유세포 분석 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 면역 표현형(CD44 및 CD73의 발현, CD45를 조혈 제외 마커로 사용)을 분석하십시오. 다음과 같이 순차적 게이팅을 적용합니다: (a) 산란 게이팅(FSC-A vs. SSC-A); (b) 더블렛 제외(FSC-H vs. FSC-A); (c) 염색하지 않은 대조군 대비 설정된 형광색소 특이적 게이트. 게이팅 전략과 함께 각 마커에 대한 양성 세포의 백분율을 기록하십시오.
4. 안전한 물질 농도 결정 (반최대 효과 농도, EC₅₀)
- 통계 분석 소프트웨어(GraphPad Prism 9)를 사용하여 EC₅₀를 결정한다. 용량-반응 데이터를 비선형 회귀 시그모이드 곡선(4-파라미터 로지스틱 모델: Y = Bottom + (Top − Bottom) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × HillSlope)))에 맞춘다. EC₅₀ 값을 95% 신뢰 구간과 함께 µg/mL 단위로 보고한다8.
- 나노물질의 연속 희석액(50, 25, 12.5, 6.25, 3.12 및 1.56 µg/mL)을 1 mL PBS에 준비한다. 스톡 현탁액을 30 s 동안 볼텍싱한 후, 균질한 현탁액을 보장하기 위해 초음파 처리(프로브 초음파 분쇄기, 40 W, 4 °C에서 30 s 작동/10 s 정지를 3회 반복)한다. 생물안전작업대 내에서 UV 램프를 이용해 30 min 동안 UV 멸균한다.
- 줄기세포를 96-well 플레이트에 1 × 104 cells/well 밀도로 분주하고, 다양한 농도의 처리액과 함께 72 h 동안 배양한 후, Trypan blue를 사용하여 생존 세포 수를 측정하여 단계 4.1에서 설명한 4-파라미터 로지스틱 모델을 통해 EC₅₀를 계산한다.
- 최소 3회의 생물학적 반복 실험과 함께, 농도당 3개의 독립적인 well을 사용하여 3반복으로 실험을 수행한다. EC₅₀ 값을 평균 ± SD로 보고하고, 반복 실험 간의 변동 계수(CV%)를 계산한다(허용 CV <15%).
5. 골 형성 및 치아 형성 분화 평가
참고: 이 섹션에서는 동일한 세포 준비물로부터 병렬 면역형광 분석법을 사용하여 두 가지 상호 보완적인 분화 경로를 평가합니다. RANKL(단계 5.5)은 조골세포성 마커로, DMP-1(단계 5.6)은 치아세포성 마커로 사용됩니다. 두 마커 모두 동일한 H-score 방법론(단계 5.8)으로 정량화합니다. 동시에 준비된 별도의 커버슬립에서 두 분석을 모두 수행하십시오.
- 6-웰 플레이트에 줄기세포를 4.5의 밀도로 파종합니다. × 105 웰당 세포 수. 분화를 시작하기 전, 완전 배양 배지에서 24시간 동안 세포를 부착시킨다.
- 시료를 다음 네 가지 그룹으로 나누십시오: 음성 대조군(DMEM 단독), 양성 대조군(골/치성 분화 배지) 및 실험군(EC의 나노물질 처리군)₅₀-유도 안전 농도).
- DMEM에 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 10 mM을 첨가하여 골분화 유도 배지를 준비합니다. β-글리세로인산, 50 µg/mL 아스코르브산(L-ascorbate-2-phosphate) 및 100 nM 덱사메타손(dexamethasone). 48시간마다 배지를 교체한다. 다음 조건에서 72시간 동안 배양한다. 37 °C 및 5% CO2₂.
- ALP 활성 측정
- 24-웰 배양 플레이트에 세포를 1... 농도로 분주합니다. × 104 웰당 세포 수로 분주하고 다음 조건에서 배양하십시오. 37 °C 5% CO2가 포함된 가습 분위기에서₂ 72시간 동안.
- 배양액을 흡입하여 제거하고, PBS로 웰을 세척한 후, 다음을 첨가하여 세포를 용해합니다. 200 µL 웰당 용해 버퍼(PBS 내 0.1% Triton X-100)를 넣고 다음 온도에서 배양하며 4 °C 완만하게 흔들어주며 10분 동안 반응시킵니다.
- 용해물을 수집하고 500 x g에서 원심분리하십시오. g 5분 동안 다음 조건에서 4 °C; 이후의 모든 ALP 측정에는 상층액을 사용하십시오. 옮깁니다. 50 µL 각 테스트 샘플의 및 100 µL p-니트로페놀 표준물을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 분주합니다. AMP 기질 버퍼를 첨가합니다(재료 목록) 촉매 반응을 개시합니다.
- 다음으로 30분 동안 2차 배양을 수행한 후 37 °C, 다음을 첨가하여 반응을 중단시킨다 50 µL 웰당 0.5 M NaOH를 첨가한다. 흡광 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 405 nm에서 즉시 흡광도를 측정한다.재료 표).
- 흡광도 대 p-니트로페놀 농도의 표준 곡선을 생성하고, ALP 활성을 U/L 단위로 계산하십시오.
- Bradford 또는 BCA 단백질 분석법을 사용하여 동일한 세포 용해물의 총 단백질 함량을 측정하십시오. ALP 활성을 총 단백질 함량으로 표준화하고, 최종 결과를 U/mg protein으로 보고하십시오.
- 골형성 마커 (RANKL)
- 면역형광법을 이용하여 RANKL 단백질 발현을 평가합니다. 먼저, 이소타입 대조군과 2차 항체 단독 대조군을 준비합니다. (a) 1차 항체 대신 동일한 농도의 이소타입 일치 토끼 IgG를 처리하고, (b) 별도의 웰에서는 1차 항체를 완전히 생략합니다.
- 실온에서 PBS로 신선하게 제조한 4% 포름알데히드로 15분 동안 세포를 고정합니다. PBS로 3회 세척합니다(각 5분).
- PBS에 희석된 0.1% Triton X-100으로 10분 동안 투과화한 후, 비특이적 결합을 줄이기 위해 PBS에 희석된 5% 정상 염소 혈청으로 상온에서 1시간 동안 블로킹합니다. 세척 과정 없이 블로킹 버퍼에서 1:200으로 희석한 Rabbit Anti-RANKL 1차 항체를 직접 첨가합니다.재료 목록) 및 다음 온도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 4 °C.
- PBS로 3회 세척한 후, 블로킹 버퍼에 1:500 비율로 희석한 염소 항-토끼 IgG 형광체 결합 2차 항체와 함께 배양한다(재료 목록) 실온의 암소에서 1시간 동안 처리하십시오.82차 항체 배양 후, PBS로 3회 세척(각 5분)하고 마운팅을 위해 단계 5.7로 바로 진행하십시오.
주의: 포름알데히드(4% 용액)는 독성 고정제이며 발암 가능성이 있는 물질입니다. 반드시 인증된 화학 흄 후드 내에서만 조제하고 사용하십시오. 니트릴 장갑, 보안경 및 실험복을 착용하십시오. 폐기물은 기관 지침에 따라 처리하십시오.
참고. 세포 정체성은 면역형광 점수 산정 전, 위상차 현미경 관찰 및 형태학적 기준을 통해 확인합니다(단계 5.10 참조).
- 치성 마커 (DMP-1)
참고: 치아 형성 분화 여부를 평가하기 위해, 단계 5.5와 병행하여 면역형광법을 통해 DMP-1(dentin matrix protein-1) 단백질 발현을 분석하십시오.- 동일한 세포 준비물에서 얻은 별도의 커버슬립 세트를 사용하여, 아이소타입 및 2차 항체 단독 대조군을 포함하여 단계 5.5에 설명된 모든 고정, 투과화 및 블로킹 단계를 반복합니다.
- 블로킹 후 세척 과정 없이, anti-DMP-1 1차 항체를 직접 첨가합니다 (참조 재료 목록)를 블로킹 버퍼로 1:200으로 희석하여 처리한 후, 다음 온도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 4 °CPBS로 3회 세척한 후, 적절한 형광체 결합 2차 항체와 함께 배양합니다(RANKL에 사용한 것과 스펙트럼이 다른 형광색소를 사용하십시오. 다음을 참조하십시오. 재료 표)를 블로킹 버퍼에 1:500으로 희석하여 실온의 암실에서 1시간 동안 반응시킵니다.
- 상아질모세포 유사 분화의 지표로서 DMP-1 발현을 평가하기 위해 10배 배율로 형광 이미지를 획득하십시오.102차 항체 배양 후, PBS로 3회 세척(각 5분씩)하고 마운팅을 위해 단계 5.7로 즉시 진행하십시오.
- 항퇴색 마운팅 매질(antifade mounting medium)을 사용하여 슬라이드를 마운팅합니다(참조 재료 표) 및 실온에서 하룻밤 동안 방치한다. RANKL 및 DMP-1 염색 슬라이드를 각각 마운팅하고 명확하게 라벨을 부착한다(예: "RANKL 그룹 1" 및 "DMP-1 그룹 1") 촬영 전.
- 형광 현미경으로 슬라이드를 즉시 관찰하거나 다음 조건으로 보관하십시오. 4 °C 빛으로부터 차단하여 보관하십시오. 표준화된 4단계 점수 체계인 0(염색 없음), 1+(약함), 2+(중간), 3+(강함)를 사용하여 염색 강도를 평가함으로써 단백질 발현량을 정량화하십시오.
- 모든 실험군에 대해 동일한 현미경 설정(노출 시간, 레이저 출력 및 게인)을 사용하여 이미지를 획득하십시오. 각 마커(RANKL 및 DMP-1)별로 동일한 설정을 독립적으로 적용하여 군 간 마커 내 일관성을 확보하십시오.
- 웰당 무작위로 선택한 최소 5개의 고배율 시야(20배 대물렌즈)를 측정하십시오. 두 명의 독립적인 눈가림 관찰자가 측정을 수행하고 Cohen's kappa 계수를 보고하십시오(허용 가능한 kappa 값 ≥ 0.7).
- 다음 공식을 사용하여 H-score를 계산하십시오: H-score = Σ(i × Pi), 여기서 i = 염색 강도(1, 2 또는 3)이며 Pi = 각 강도 수준에서의 세포 백분율(0–100%).
참고: H-score의 범위는 0에서 300까지임10. - 웰 간의 세포 밀도 차이를 보정하기 위해, 면역형광 이미징 전 위상차 현미경 하에서 각 시야의 모든 가시 세포를 수동으로 계수하여 결정한 시야당 총 세포 수로 H-score 데이터를 표준화하십시오.
- 두 분화 경로를 직접 비교할 수 있도록 RANKL(골 형성 종점)과 DMP-1(치아 형성 종점)에 대해 H-score를 각각 계산하여 보고하십시오.
6. 증식 및 생존능 평가
- 헤모사이토미터를 이용해 세포 수를 측정하고, Trypan blue 염색을 통해 생존 세포와 비생존 세포를 구분하십시오. 배양액 1mL당 총 생존 세포 수를 계산하십시오. 통계적 신뢰도를 위해 샘플당 최소 100개의 세포를 측정하십시오.
- 미토콘드리아 대사 활성을 측정하기 위한 MTT 분석법 수행8,10.
- 최종 농도가 0.5 mg/mL가 되도록 MTT 용액을 첨가한다(재료 표)을 세포에 첨가하고 4시간 동안 다음 온도에서 배양합니다. 37 °C용액을 제거하고 가용화제(예: SDS-HCl; 참조 재료 목록), 그리고 분광광도계를 사용하여 570 nm에서 광학 밀도를 측정합니다 (참조 파장: 630–650 nm).
- 세포 생존율을 다음과 같이 계산합니다: 생존율 (%) = (처리군 세포의 흡광도 / 미처리 대조군 세포의 흡광도) × 100. 값 >100%는 음성 대조군 대비 증식 자극을 나타냅니다. 배경 보정을 위해 공백 웰(blank well)을 포함하십시오.
- 병행하여 실시한 트립판 블루(Trypan blue) 세포 수 측정값을 이용하여 결과를 세포 수로 표준화하십시오. 모든 분석은 3회 반복(그룹당 3개 웰, 3회 이상의 생물학적 반복 실험)으로 수행하십시오.
주의: SDS-HCl 가용화 완충액은 부식성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 착용하고 취급하십시오. 포르마잔(formazan)이 포함된 폐기물은 기관 규정에 따라 처리하십시오.
결과
여기에 제시된 모든 결과는 동일한 연구 그룹이 통합 기관 윤리 승인(FDASU-Rec IM112105) 하에 수행한 동반 연구4,8,9,10에서 인용되었습니다.
나노물질 특성 분석 및 줄기세포 분리
표준화된 워크플로우를 통해 우선적으로 스캐폴드 특성과 줄기세포 표현형에 대한 정량적 확인을 수행합니다. 합성 후, 준비된 나노물질은 고해상도 TEM 및 XRD를 사용하여 입자 크기와 결정성을 확인합니다(그림 1A,B). 동시에, 효소 소화를 통해 분리된 DPSCs 또는 SCAPs는 완전 배양 배지에서 강력한 부착 및 증식 능력을 보입니다. 유세포 분석을 통해 계대 배양 3세대(passage 3)에서 수확한 세포의 면역 표현형을 검증하며, 중간엽 마커(CD44, CD43)의 높은 발현을 확인하고 CD45의 부재를 통해 비조혈성 기원을 확인합니다(그림 1C).
안전한 물질 농도 및 증식 확립
나노물질의 연속 희석액(50–1.56 µg/mL72시간 동안 진행한 후, 생존 세포 수의 4-매개변수 로지스틱 회귀 분석을 통해 신뢰할 수 있는 EC₅₀ 값을 얻습니다(단계 4.1에 설명된 비선형 시그모이드 용량-반응 모델). MTT 생존율 값이 100%를 초과하는 것은 처리하지 않은 대조군에 비해 증식 자극이 일어났음을 나타내며, 이는 음성 대조군(처리하지 않은 세포를 100%로 설정)을 기준으로 값을 정규화했기 때문입니다. 예를 들어, Nano-NeoMTA2의 값이 약 196%로 나타난 것은 단순한 생존이 아니라 미토콘드리아 활성의 생물학적 자극이 반영된 것입니다. >100% 절대 세포 생존율9.
이 표준화된 프로토콜을 적용한 여러 연구에서 4-매개변수 로지스틱 모델(단계 4.1)을 사용하여 EC₅₀ 값을 7.9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 및 9.92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10로 설정하였으며, 이를 통해 본 프로토콜에 기술된 분화 분석에 사용할 수 있는 안전한 작동 농도를 확인하였습니다. 이 값들은 대표적인 검증 지표로서 표 1에 포함되었습니다.
골 형성 및 치성 분화의 정량화 (이중 마커 평가)
이중 면역형광법 접근 방식은 동일한 세포 준비물로부터 두 가지의 뚜렷하고 상호 보완적인 결과 측정값을 제공합니다. 골 형성 평가에서 RANKL H-score는 네 그룹 모두를 통계적으로 유의미하게 구분했습니다. Nano-NeoMTA2와 함께 배양된 세포는 음성 대조군보다 RANKL 발현이 상당히 높게 나타났으며, 이는 상향 조절된 조골세포 유사 활성화와 일치합니다 (그림 2A, 표 1)8,9. 치성 평가에서 DMP-1 H-score는 Nano-NeoMTA2와 함께 배양된 DPSCs에서 강력한 상아질세포 유사 분화가 일어났음을 보여주었으며, H-score가 나노하이드록시아파타이트 및 음성 대조군 그룹보다 유의하게 높아 우선적인 상아질 형성 분화가 확인되었습니다 (그림 3A, 표 1)10. 세포 정체성은 점수 측정 전 위상차 현미경과 특징적인 형태학적 기준(방추형 또는 다각형 형태)을 통해 확인되었습니다.
모든 그룹에서 ALP 활성을 405 nm에서 분광광도법으로 측정하여 구분하였으며, 이는 골 형성 및 치성 분화 모두의 조기 효소 표지자로 활용되었습니다(표 1). 분광광도법을 이용한 MTT 분석 결과, EC₅₀에서 도출된 안전한 농도의 모든 나노물질이 음성 대조군 대비 높은 세포 생존능을 유지하였으며, 이는 제시된 대표 값들과 일치하였습니다(표 1).
최적이 아니거나 실패한 실험 결과
최적이 아닌 결과는 표 2에 요약되어 있습니다. MTT 분석에서 세포 생존율이 낮게 나타나는 것은 일반적으로 나노물질 농도가 EC₅₀ 임계값을 초과했거나 UV 멸균이 불충분했음을 나타냅니다. ALP 흡광도의 불일치(CV > 20%)는 대체로 불균일한 세포 파종 밀도 또는 용해 버퍼의 불완전한 균질화를 의미합니다. RANKL 또는 DMP-1의 면역형광 신호가 약하거나 없는 경우는 주로 항체 불활성화, 투과화 부족 또는 과고정으로 인해 발생하며, 이는 신선한 4% formaldehyde와 일회용 항체 분주액을 사용하여 해결할 수 있습니다. RANKL과 DMP-1 채널 간의 교차 반응성은 점수 산정 전 2차 항체 전용 대조군 이미지를 검토하여 배제해야 합니다.
그림 1: 나노물질의 표준 특성 분석 및 줄기세포 표현형 검증. (A) 나노입자의 결정상과 구조적 무결성을 확인하는 XRD 스펙트럼. (B) 합성된 생체재료의 나노 규모 입자 크기, 형태 및 균질한 분산을 보여주는 대표 TEM 이미지; NeoMTA2와 hydroxyapatite를 비교함. (a) NeoMTA2와 (b) hydroxyapatite의 저배율 뷰가 표시되어 있으며, (c) NeoMTA2와 (d) hydroxyapatite의 고배율 뷰가 상세히 나타나 있음. 스케일 바는 왼쪽 하단 모서리에 표시됨. (C) 줄기세포 특성 분석을 위한 유세포 분석 게이팅 프로토콜. CD44, CD73(원본 도표에서는 CD43 PE로 표시됨) 및 CD45로 염색된 세포를 보여주는 대표 다변량 점도표. CD44+ 및 CD73+ 하위 집단은 CD45 발현에 대응하여 게이팅됨. 패널 A와 C는 Zaki et al.8 (CC BY-NC-SA)에서, 패널 B는 Habib et al.10 (CC BY-NC)에서 인용 및 수정됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2RANKL 면역형광 염색을 통한 골분화의 정량 및 반정량적 평가. (A) 2D 스캐폴드 미세환경 내 핵심 골 형성 단백질 마커인 RANKL의 발현을 포착한 대표적인 고해상도 면역형광 현미경 사진. (a) 음성 대조군 세포는 희미한 막성 RANKL 발현을 보이며 작은 군집을 형성하는 반면, (b) 양성 대조군 세포는 조골세포 유사 군집의 수가 증가하고 조밀하며 균일한 발현을 보인다. (c) NHAP, (d) NHAP/키토산 및 (e) 생체활성 유리 나노입자로 처리된 줄기세포는 진전된 분화 양상을 보이며, 이는 막과 핵 모두에서 강렬하고 균일한 RANKL 국소화가 나타나는 크고 융합된 조골세포 유사 군집을 특징으로 한다; 출처: Elshahat et al.에서 수정.4. (B) 다양한 연구 전반의 RANKL 발현에 대한 H-score 정량화를 나타내는 막대 그래프. 면역형광 데이터를 정규화하기 위한 H-score 방법론의 적용. 시각적 염색 강도(0-3등급)를 양성 염색 세포의 백분율과 수학적으로 통합함으로써, H-score는 정성적 현미경 관찰 결과를 강건한 반정량적 지표로 변환하여 관찰자의 주관적 편향을 유의미하게 감소시킨다. (a) Nano-NeoMTA2(7.9 µg/mL) 및 생체활성 유리 나노입자 (NBG; 500 µg/mL)를 골형성 유도 배지 양성 대조군(OM-PC) 및 DMEM 음성 대조군(DMEM-NC)과 비교하였다. NBG가 가장 높은 발현 프로파일을 유도하였다(p < 0.001). Abdelaziz 등 9의 연구(CC BY-NC-ND 4.0)를 수정하여 인용함. (b) 나노하이드록시아파타이트(NHAP; 10µg/mL), NHAP/키토산 복합체 (10 µg/mL), 그리고 NBG (500 µg/mL대조군과 비교하여 NHAP/Chitosan이 가장 높은 H-score를 나타냈다. Elshahat 등의 연구에서 수정됨.4 (CC BY 4.0). (c) Nano- NeoMTA2의 평가 (7.9 µg/mL) 대 NHAP (10 µg/mL) 및 대조군에서, Zaki 등이 발표한 내용을 응용한 Nano-NeoMT에서 RANKL 발현이 유의미하게 증가했음을 보여주었다.8. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대표 면역형광 이미지 및 H-score 분석. (A) 실험군 전반에 걸친 Dentin Matrix Protein (DMP-1) 발현의 면역형광 현미경 평가; 녹색 형광은 다클론성 anti-DMP-1 항체에 대한 양성 염색을 나타냄. (a) 음성 대조군: 미분화 배지(UM) 내의 인간 치수 줄기세포(hDPSCs)는 희미하고 균일한 DMP-1 발현(+)을 보이는 소규모 세포 응집체를 나타냄. (b) 양성 대조군: 치성 분화 배지(OM) 내의 hDPSCs는 밀도가 높고 균일한 DMP-1 신호(++)로 표시되는 콜로니의 확장을 보여줌. (c) Nanohydroxyapatite (10 μg/mL) 및 (d) Nano-NeoMTA2 (9.92 μg/mL): 분화된 hDPSCs는 막과 핵에 국한된 강력하고 균일한 DMP-1 발현을 보이는 상아질세포 유사 세포의 크고 융합된 콜로니를 형성함. 배율: ×10. 노란색 원은 상아질세포 유사 콜로니를 나타내며, 노란색 화살표는 강한 DMP-1 발현을 나타냄. (B) 연구군 전반의 Dentin Matrix Protein 발현에 대한 H-score 정량화를 나타내는 막대 그래프. 평가군 간에 매우 유의미한 차이가 관찰되었으며, Nano-NeoMTA2 군에서 가장 높은 H-score (169.33 ± 4.04)가 관찰되었고, nanohydroxyapatite (140.33 ± 2.52)와 음성 대조군 (15.33 ± 1.53)이 그 뒤를 이음. 패널 A와 B는 Habib et al.10 (CC BY-NC)에서 수정됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
| 분석 / 매개변수 | 나노물질 / 세포 유형 | 대표값 (평균 ± 표준편차) | 정규화 | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 제공해 주시기 바랍니다. |
| 세포 생존율 (MTT 분석) | ||||
| MTT 생존능력 분석 | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | ~196% (OD = 1.56 ± 0.24) | 미처리 대조군 대비 정규화됨 (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz 등⁹ |
| MTT 생존능력 분석 | 키토산-nHA (10 µg/mL) / SCAPs (세포질 내 항원 제시 단백질) | ~99.97% | 미처리 대조군으로 정규화함 (DMEM-NC = 100%) | Elshahat 등⁴ |
| MTT 세포 생존율 — 양성 대조군 | OM-PC / SCAPs | 113.46% (OD = 0.93 ± 0.03) | 미처리 대조군으로 정규화함 (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz 등⁹ |
| MTT 생존율 — 음성 대조군 | DMEM-NC / SCAPs | 100% (OD = 0.82 ± 0.02) — 기준선 참조 | DMEM-NC를 100%로 정의함 모든 군에 대한 대조군 | Abdelaziz 등⁹ |
| 알칼리성 인산분해효소(ALP) 활성 | ||||
| ALP 활성 | 생체활성 유리 나노입자 (500 µg/mL) / SCAPs | 69.86 ± 0.98 U/L | 총 단백질 함량으로 표준화됨 (U/mg 단백질, Bradford/BCA 분석) | Abdelaziz 외.⁹ |
| ALP 활성 — 양성 대조군 | OM-PC / SCAPs | 77.68 ± 1.28 U/L | 총 단백질 함량으로 정규화됨 (U/mg 단백질, Bradford/BCA 분석법) | Abdelaziz 등⁹ |
| ALP 활성 — 음성 대조군 | DMEM-NC / SCAPs | 55.81 ± 1.6 U/L | 총 단백질 함량으로 표준화함 (U/mg 단백질, Bradford/BCA 분석) | Abdelaziz 등⁹ |
| 안전 물질 농도 (EC₅₀) | ||||
| EC₅₀ (SCAP) | Nano-NeoMTA2 / 상아질 줄기세포(SCAPs) | 7.9 µg/mL | 4-매개변수 로지스틱 모델 (비선형 시그모이드 용량-반응, GraphPad Prism 9) | Zaki 등⁸ |
| EC₅₀ (치수유래줄기세포) | Nano-NeoMTA2 / 치성치수줄기세포(DPSCs) | 9.92 µg/mL | 4-매개변수 로지스틱 모델 (비선형 시그모이드 농도-반응, GraphPad Prism 9) | Habib 외 연구진10 |
| H-Score — RANKL 단백질 발현 (골형성 마커) | ||||
| H-Score (RANKL) 골 형성 마커 | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (척도 0–300) | 시야당 총 가시 세포 수 (위상차 현미경법) | Zaki 등⁸ |
| H-Score (RANKL) 골 형성 마커 | nHA (나노-하이드록시아파타이트)10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 (척도 0–300) | 시야당 총 가시 세포 수 (위상차 현미경 검사) | Zaki 등⁸ |
| H-Score (RANKL) 양성 대조군 | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (척도 0–300) | 시야당 총 가시 세포 수 (위상차 현미경법) | Zaki 등⁸ |
| H-Score (RANKL) 음성 대조군 | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (척도 0–300) | 시야당 총 가시 세포 수 (위상차 현미경법) | Zaki 등⁸ |
| H-Score — DMP-1 단백질 발현 (치성 마커) | ||||
| H-Score (DMP-1) 치성 표지자 | Nano-NeoMTA2 (9.92 µg/mL) / 치아 유래 줄기세포(DPSCs) | 169.33 ± 4.04 (척도 0–300) | 시야당 총 가시 세포 수 (위상차 현미경법) | Habib 등10 |
| H-스코어 (DMP-1) 치성 마커 | 나노 하이드록시아파타이트(nHA) (10 µg/mL) / 염료 감응형 태양전지(DPSCs) | 140.33 ± 2.52 (척도 0–300) | 시야당 총 가시 세포 수 (위상차 현미경법) | Habib 등10 |
| H-점수 (DMP-1) 음성 대조군 | DMEM-NC / 치아유래줄기세포(DPSCs) | 15.33 ± 1.53 (척도 0–300) | 시야당 총 가시 세포 수 (위상차 현미경법) | Habib 등10 |
| H-점수 (DMP-1) 치성 마커 [양성 대조군 -OM-PC] | 유기분자 태양전지 / 염료감응 태양전지 | ~103 H-점수 (척도 0–300) | 시야당 총 세포 수 (위상차 현미경법) | Habib 등 Eur Endod J, 202610 |
| H-score = Σ(i × Pi): i = 염색 강도 (1, 2 또는 3); Pi = 각 강도 수준에서의 세포 백분율 (0–100%); 범위 0–300. MTT 생존율은 DMEM-NC를 100% 기준점으로 하여 상대적으로 표시함. ALP 활성은 p-니트로페닐 인산의 효소적 탈인산화로부터 도출된 U/L로 표시하며, 총 단백질 함량으로 추가 표준화함 (U/mg protein). OM-PC = 골/치아 형성 유도 배지 (양성 대조군). DMEM-NC = Dulbecco’s Modified Eagle Medium (음성 대조군). | ||||
표 1: 표준화된 인비트로(in vitro) 평가 워크플로의 대표적 결과. 표준화된 프로토콜을 사용하여 수행한 세포 증식, 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase) 활성 및 면역형광 분석을 보여주는 기출판 연구의 대표적인 정량적 결과.
| 관찰된 문제점 | 잠재적 원인 | 권장 용액 |
| MTT 분석에서의 낮은 세포 생존율 (OD < 미처리 대조군) | 나노물질 농도가 EC₅₀를 초과함, 또는 UV 멸균이 불충분함, 또는 나노입자 분산이 부적절함. | EC₅₀ 결정(섹션 4)을 재실행하십시오. UV 멸균 시간을 30분으로 연장하십시오. 프로브 초음파 처리(40W, 30초 온/오프, 3회 사이클)를 통해 나노입자 현탁액이 균질한지 확인하십시오. 4 °C) 사용 직전에 즉시. |
| MTT 생존능력 CV >반복 실험 간 15% 차이 | 피펫팅 오류, 불균일한 세포 파종 또는 MTT 배양 시간/온도의 가변성. | 모든 첨가 단계에서 교정된 멀티채널 피펫을 사용하십시오. 플레이팅 전 헤모사이토미터를 사용하여 세포 파종 밀도를 확인하십시오. 4시간 동안 엄격하게 배양을 유지하며 다음 온도를 준수하십시오. 37 °C 습윤화된 CO₂ 배양기에서 배양하십시오. 배경 보정을 위해 공백 웰(blank well)을 포함하십시오. |
| 일관되지 않은 ALP 흡광도 측정값 (CV >(웰 간 편차 20% 이내) | 불균일한 세포 파종 밀도, 불완전한 세포 용해 또는 기질 첨가 중의 피펫팅 불일치. | 24-웰 플레이트에 웰당 1 × 10⁴ cells가 되도록 엄격히 준수하여 분주하십시오. 사용 전 용해 버퍼를 충분히 볼텍싱하십시오. 일정한 용해 배양 시간(10분, 4 °C, 부드럽게 흔들어 줌). 셀이 없는 블랭크 웰(blank well)을 사용하여 배경 흡광도를 확인한다. |
| 약하거나 나타나지 않는 RANKL 면역형광 신호 (단계 5.4a) | 부적절한 보관으로 인한 항체 비활성화, 에피토프 접근성을 감소시키는 과도한 고정, 또는 불충분한 투과화. | 사용 직전에 4% 포름알데히드를 신선하게 준비하십시오. 블로킹 전에 0.1% Triton X-100으로 투과화(10분, 상온)를 수행하십시오. 1차 항체 희석 배율을 적정하십시오(1:200부터 시작). 양성 대조군 조직 절편을 포함하십시오. 반복적인 동결-해동 사이클을 방지하기 위해 항체 스톡을 소분하십시오. |
| DMP-1 면역형광 염색의 약화 또는 소실 신호 (단계 5.4b) | 동결-해동 반복으로 인한 항체 비활성화, 부적절한 1차 항체 희석 배수, 또는 호환되지 않는 2차 항체 숙주 종. | 동결-해동 반복을 방지하기 위해 anti-DMP-1 항체를 소분하십시오. 1:200 비율부터 시작하여 희석 배수를 적정하십시오. 1차 항체(DMP-1)와 2차 항체 간의 숙주 종 호환성을 확인하십시오. DMP-1의 양성 대조군으로 상아질 조직 절편을 포함하십시오. |
| RANKL과 DMP-1 간의 교차 반응성 형광 채널 | 두 이차 항체에 동일한 형광색소가 사용된 경우의 방출 스펙트럼 내 스펙트럼 중첩, 또는 형광 현미경의 불충분한 채널 분리. | RANKL과 DMP-1에 대해 스펙트럼상으로 구별되는 2차 항체 형광색소(예: 한 마커에는 Alexa Fluor 488, 다른 마커에는 Alexa Fluor 594)를 사용하십시오. 점수 산정 전, 각 채널에 대해 2차 항체만 처리한 대조군 이미지를 개별적으로 검토하십시오. 순차 획득 모드(sequential acquisition mode)를 사용하여 RANKL과 DMP-1 이미지를 각각 별도로 획득하십시오. |
| ~ 내의 높은 비특이적 배경 신호 면역형광 염색 | 단백질 블로킹 부족, 2차 항체 농도가 너무 높음, 또는 배양 단계 사이의 세척 과정 미흡. | 블로킹 배양 시간을 실온에서 2시간으로 연장하십시오. 2차 항체의 희석 배수를 1:1000으로 높이십시오. 2차 항체 단독 대조군(1차 항체 미처리)을 통해 특이성을 확인하십시오. 모든 PBS 세척 단계가 완전히 수행되었는지 확인하십시오(각 5분씩 3회). |
| H-score 관찰자 간 변동성 (코헨의 카파(Cohen’s kappa) <0.7, 단계 5.6) | 관찰자 간 4단계 염색 강도 척도(0, 1+, 2+, 3+) 적용의 불일치 또는 판독 세션 전의 불충분한 보정. | 정식 평가에 앞서 대표 훈련 이미지를 사용하여 공동 보정 세션을 실시하십시오. 모든 관찰자에게 동일한 이미지 표시 설정(밝기, 대비)을 적용하십시오. 웰당 최소 5개의 고배율 시야를 평가하고, 편향(drift)을 모니터링하기 위해 매 10개 시야마다 카파(kappa) 값을 계산하십시오. |
| EC₅₀ 곡선이 수렴하지 않음 또는 적합도가 낮은 경우(단계 4.1) | 데이터 포인트 부족, 좁은 농도 범위, 또는 세포 파종 전 균질한 현탁액 형성 실패. | 50-를 포함하여 최소 6가지 농도가 포함되도록 연속 희석 범위를 확장하십시오.1.56 µg/mL각 희석 단계 직전에 프로브 초음파 처리를 수행하십시오. 최소 3회 이상의 독립적인 생물학적 반복 실험으로 반복하십시오. 변동 계수(CV)를 확인하십시오. <반복 실험 간 15% 내외. |
표 2: 주요 파라미터 및 문제 해결 가이드. 프로토콜 진행 중 발생하는 일반적인 기술적 문제, 잠재적 원인 및 실험 재현성과 데이터 품질을 향상시키기 위한 권장 해결 방법. 약어: CV = 변동 계수; RT = 상온.
토론
본 프로토콜의 핵심 단계는 정확한 EC₅₀ 결정, 균질한 나노물질 현탁액 제조, 그리고 생물학적 분석 결과의 표준화입니다. 비선형 회귀 분석(4-파라미터 로지스틱 모델)을 통한 EC₅₀ 계산은 선형 보간법보다 더 엄격한 용량-반응 추정치를 제공하며, 충분한 데이터 포인트가 확보된 경우 이 방법을 우선적으로 사용해야 합니다13,14. 세포 노출 직전에 프로브 초음파 처리를 통해 균질한 나노입자 현탁액을 보장하는 것이 매우 중요합니다. 분산이 제대로 되지 않은 현탁액은 신뢰할 수 없는 용량-반응 곡선을 생성하며 EC₅₀ 추정치를 왜곡합니다. NeoMTA2와 같은 신소재의 경우, 벌크 입자 크기가 표면 반응성과 이후의 생물학적 활성을 크게 변화시키므로 나노 규모로 밀링하는 것이 필수적인 첫 단계입니다13,14. 안전할 것으로 예상되는 농도에서 낮은 세포 생존율이 관찰되면, 연구자는 EC₅₀ 분석을 반복하기 전에 UV 멸균 프로토콜을 확인하고 밀링 및 분산 절차를 재검토해야 합니다10.
이 프로토콜의 핵심은 서로 구별되지만 중첩되는 분화 경로를 반영하는 두 가지 상보적 면역형광 마커를 사용하는 것입니다. 조골세포 유사 세포에서의 RANKL 상향 조절은 칼슘 이온 기반의 골 형성 신호를 반영하며 골 형성 세포의 수에 비례하는 반면8,9, DMP-1 발현은 상아질세포 유사 분화 및 상아질 형성 활성의 특이적 지표로 작용하며, 특히 표적 세포군이 DPSCs일 때 매우 유용합니다10. H-score 방법론을 사용하여 두 마커를 모두 정량화함으로써, 본 프로토콜은 연구자가 단일 표준 분석 시스템 내에서 골 형성 계보와 상아질 형성 계보의 결정 여부를 구분할 수 있게 하며, 이는 뼈 형성 및 상아질 형성 결정 과정을 구분할 수 없는 단일 마커 접근 방식보다 진보된 방법입니다. 연구 간 비교 가능성을 유지하기 위해 이 프로토콜을 사용하는 모든 논문에는 RANKL과 DMP-1의 H-score를 모두 기재해야 합니다. 연구자는 채널 중첩을 방지하기 위해 두 가지 2차 항체에 대해 스펙트럼이 서로 다른 형광색소를 사용해야 하며, 점수 산정 전에 2차 항체만 처리한 대조군 이미지를 검토해야 합니다.
이 프로토콜을 다른 생체 재료나 세포 모델에 적용할 때는 몇 가지 방법론적 수정이 필요할 수 있습니다. 불투명도가 높거나 색이 있는 스캐폴드의 경우, 570 nm에서의 MTT 흡광도 간섭이 발생할 수 있으므로 스캐폴드 재료의 광학적 간섭에 덜 민감한 CellTiter-Glo(발광) 또는 PrestoBlue(resazurin 환원)와 같은 대체 생존능 분석법을 사용해야 할 수 있습니다. DPSC 대신 SCAP를 사용하는 연구자는 SCAP가 더 강한 골 형성 분화 능력을 반영하여 RANKL 발현이 더 강한 경향이 있는 반면, DPSC는 더 뚜렷한 치아/상아질 형성 계통 편향을 반영하여 DMP-1 발현이 더 두드러진다는 점에 유의해야 합니다. 계대 배양 횟수는 중요한 변수입니다. 계대 6회를 초과한 세포는 분화 능력이 감소하고 표면 마커 발현이 변할 수 있으므로 사용을 피해야 합니다.
이 방법론적 프레임워크의 한계로는 72 h의 짧은 평가 기간이 있으며, 이는 일반적으로 14–21일이 소요되는 후기 단계의 무기질화 현상을 포착하지 못할 수 있습니다. in vivo 검증의 부재는 중대한 중개 연구상의 간극을 나타냅니다. H-score의 사용은 관찰자 간 변동성을 유발할 수 있으므로, 섹션 5.10에 보고된 관찰자 간 신뢰도(Cohen's kappa)를 모든 발표 결과에 포함해야 합니다.
이 프레임워크는 기존의 단일 엔드포인트 접근 방식에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 전통적인 골분화 분석은 흔히 알리자린 레드 염색이나 단일 시점의 ALP 활성 측정에만 의존합니다. 단일 워크플로우 내에 MTT 생존율 스크리닝, ALP 활성 정량화, 그리고 RANKL + DMP-1 이중 면역형광 H-스코어링을 통합함으로써, 동일한 실험 조건 하에서 서로 다른 스캐폴드 유형 간의 직접적인 통계적 비교가 가능한 다변량 결과값을 제공합니다. 설명된 정규화 전략, 즉 단백질 mg당 ALP 활성, 미처리 대조군 대비 백분율로 표시된 MTT 결과, 그리고 시야당 총 세포 수로 정규화된 H-스코어는 웰 간 변동성으로 인한 혼란 변수를 제거합니다4,8.
향후 연구에서는 이 방법론을 적용하여 염증성 마커, 혈관 형성 반응 또는 대안적인 줄기세포 모델에 미치는 생체 재료의 영향을 평가할 수 있습니다. 또한, 해당 분석 순서는 3D 스캐폴드 형식에도 적용 가능합니다. 궁극적으로, 여러 독립적인 연구실에서 이 표준화된 프레임워크를 채택한다면 전임상 재생 치의학 연구에서 스캐폴드 성능에 대한 의미 있는 메타 분석적 비교가 가능해질 것입니다15.
공개 사항
저자들은 이해관계의 충돌이 없음을 선언합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 24-웰 배양 플레이트 | Corning | 3527 | ALP 분석에 사용됨 |
| 96-웰 플레이트 | Corning | 3596 | ALP 흡광도 측정 및 MTT 분석에 사용됨 |
| ALP 분석 키트 | Abcam | ab83369 (또는 이에 상응하는 제품) | 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase) 활성 측정에 사용됨 |
| ALP 기질 버퍼 (2-아미노-2-메틸-1-프로판올) | Sigma-Aldrich | 해당 사항 없음 | ALP 촉매 반응을 개시하는 데 사용됨 |
| 수산화암모늄 (NH4OH)4OH) | 해당 사항 없음 | 해당 사항 없음 | 나노하이드록시아파타이트 합성 중 pH 조절에 사용됨. 부식성 |
| Anti-DMP-1 1차 항체 | 입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주세요. | 해당 사항 없음 | 치성 마커; 블로킹 버퍼로 1:200 희석; 하룻밤 동안 다음 온도에서 4 °C |
| 항인간 CD44 항체 (CD44-FITC) | Beckman Coulter | 해당 사항 없음 | 유세포 분석에 사용됨; 중간엽 줄기세포 양성 표지자 |
| 항인간 CD45 항체 (CD45-PC5) | Beckman Coulter | 입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주십시오. | 유세포 분석에 사용; 조혈 계통 음성 마커 |
| 항인간 CD73 항체 (CD73-PE) | Beckman Coulter | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 유세포 분석에 사용됨; 중간엽 줄기세포 양성 마커 |
| 오토클레이브 (수열 합성 반응기) | Tuttnauer | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 나노하이드록시아파타이트의 수열 처리에 사용됨 140 °C, 0.3 MPa |
| BCA 단백질 정량 분석 키트 | Thermo Fisher Scientific | 23225 (또는 이에 상응하는 제품) | ALP 활성의 정규화를 위한 총 단백질 농도를 결정하는 데 사용됨 |
| 일산화탄소2 배양기 | Thermo Fisher Scientific | 입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주십시오. | ~로 설정하십시오. 37 °C 및 5% CO22 모든 세포 배양 단계에서 |
| 콜라게나제 타입 I | Sigma-Aldrich | C0130 | 줄기세포 분리 과정 중 치과 조직의 효소 소화에 사용됨 |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | 기저 배양 배지; 음성 대조군으로도 사용됨 |
| 소태아혈청 (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | 완전 배양 배지를 위한 보충제; 분화 배지에 사용된 MSC 인증 FBS |
| 유세포 분석기 (Navios) | Beckman Coulter | Navios | 줄기세포 면역표형 분석에 사용됨 |
| 유세포 분석 소프트웨어 (Navios) | Beckman Coulter | 제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 유세포 분석 패널의 게이팅 및 데이터 분석에 사용됨 |
| 형광 현미경 | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | 면역형광 이미지 분석 및 H-score 산출에 사용됨 |
| 동결 건조기 (lyophilizer) | Labconco | 해당 사항 없음 | 나노물질 침전물을 다음 조건에서 건조하는 데 사용됨 −50 °C |
| 염소 항-토끼 IgG 2차 항체 (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | 형광 2차 항체; 1:500 희석; 실온에서 1시간 |
| 염소 항-토끼 IgG 2차 항체 (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (또는 동등 제품) | A-11012 (또는 그와 동등한 제품) | 다중 염색 수행 시 DMP-1 면역형광법에 사용되는 스펙트럼상 구분 가능한 2차 항체 |
| GraphPad Prism 소프트웨어 | GraphPad 소프트웨어 | 버전 9 | EC에 사용됨50 계산 및 통계 분석 |
| 혈구계수기 | 노이바우어 | 제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주시기 바랍니다. | 수동 세포 계수 및 H-score 정규화를 위한 총 세포 수 산출에 사용됨 |
| 도립 위상차 현미경 | Olympus | 제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 세포 성장 및 형태의 일일 모니터링에 사용됨 |
| 마운팅 용액, 항퇴색제 (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | 면역형광 염색 후 슬라이드 마운팅에 사용됨 |
| MTT 시약 | Invitrogen | M6494 | 세포 대사 활성 측정에 사용; 0.5 mg/mL, 4시간 동안 37 °C |
| 나노하이드록시아파타이트 (NHAP) | Nanogate, 이집트 카이로 | 제시된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 습식 침전법으로 합성하거나 상업적으로 구입하여, 다음의 농도로 사용함 10 µg/mL |
| NeoMTA2 분말 | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | 입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주시기 바랍니다. | 유성 볼 밀을 이용한 Nano-NeoMTA2 제조를 위한 출발 물질 |
| 정상 염소 혈청 | 입력된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 제공해 주시기 바랍니다. | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 1차 항체 처리 전 블로킹(PBS 내 5%)에 사용됨 |
| 골분화/치분화 유도 배지 | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 해당 사항 없음 | 양성 대조군 배지; DMEM, FBS, 아스코르브산, 베타-글리세로인산, 덱사메타손 함유 |
| 파라포름알데히드 (4%) | Sigma-Aldrich | P6148 | 면역형광 염색 전 세포 고정에 사용됨. 독성 물질 — 흄 후드 내에서 사용하십시오 |
| PBS (인산완충생리식염수, pH 7.4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | 세포 세척, 항체 희석 및 나노물질 현탁에 사용됨 |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | 항생제 보충제; 완전 배양 배지에서 1% 농도로 사용 |
| 유성 볼 밀 | Retsch (또는 동등 제품) | PM 400 | NeoMTA2 분말의 나노 크기 조절(nanosizing)에 사용; 350 rpm, 10시간 |
| p-니트로페놀 표준물질 | Sigma-Aldrich | 해당 사항 없음 | ALP 활성 표준 곡선 작성에 사용됨 |
| 토끼 anti-RANKL 1차 항체 | Abcam | ab9957 | 골 형성 표지자; 1:200 희석; 하룻밤 동안 4 °C |
| 토끼 IgG 동형 대조항체 | 해당 사항 없음 | 면역형광법을 위한 음성 대조군; 일치하는 농도의 1차 항체 | |
| SDS-HCl 가용화 용액 | Sigma-Aldrich | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | MTT 포르마잔 결정의 용해에 사용됨. 부식성 |
| 6-웰 조직 배양 플레이트 | Corning | 3516 | 분화 분석에 사용됨 |
| 수산화나트륨 (NaOH), 0.5 M | Sigma-Aldrich (또는 그에 상응하는 제품) | 해당 사항 없음 | 흡광도 측정 전 ALP 반응을 종결시키는 데 사용됨; 부식성 |
| 초음파 분쇄기 (프로브형 / 초음파 세척조형) | Branson Ultrasonics | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 생물학적 분석 전 나노입자 분산에 사용됨 |
| T-75 배양 플라스크 | Corning | 430641 | 줄기세포 증식에 사용됨 |
| TEOS (테트라에틸 오르토실리케이트) | 해당 사항 없음 | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 45S5 생체활성 유리 졸-겔 합성을 위한 실리카 전구체. 인화성 |
| 투과전자현미경 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | 나노물질의 크기 및 형태 분석에 사용됨 |
| Triton X-100 (PBS 내 0.1%) | 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. | 면역형광법 전 세포 투과화에 사용됨 |
| 트리판 블루 용액 (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | 세포 생존율 평가에 사용됨 |
| X선 회절 분석기 (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | 나노입자의 결정 구조 분석에 사용됨 |
참고문헌
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