본 연구에서는 비소세포폐암 조직 및 세포주에서 miR-21-5p의 발현과 세포 접착 분자 1(cell adhesion molecule 1)과의 연관성, 그리고 이동, 증식, 염증 마커 발현 및 생존과의 관계를 평가합니다.
연구 논문
비소세포폐암의 진행 및 예후에 있어 miR-21-5p-Cell Adhesion Molecule 1 축의 역할
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2026년 9월 11일
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요약
초록
증거에 따르면 miR-21-5p는 비소세포폐암(NSCLC)의 중요한 분자 조절 인자입니다. 세포 접착 분자 1(CADM1)은 잠재적인 종양 억제제로 알려져 있으나, NSCLC 진행 과정에서 miR-21-5p와 CADM1 사이의 조절 관계는 아직 불분명합니다. 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)을 사용하여 NSCLC 조직 및 세포에서 miR-21-5p와 CADM1의 발현을 검출하였으며, dual luciferase 리포터 유전자 분석을 통해 miR-21-5p와 CADM1의 표적 결합을 검증하였습니다. 세포 이동 능력은 Transwell 분석으로 검출하였고, 임상 병리학적 데이터와 생존 분석을 결합하여 miR-21-5p의 임상적 유의성을 탐색하였으며, 생물 정보학을 통해 miR-21-5p 표적 유전자의 기능 풍부도를 분석하였습니다. NSCLC 조직 내 miR-21-5p의 발현은 인접 정상 조직보다 유의하게 높았으며, miR-21-5p 발현이 높은 환자들은 전체 생존 기간이 더 짧았습니다. miR-21-5p의 높은 발현은 NSCLC 환자의 생존에 대한 독립적인 위험 요인입니다. miR-21-5p의 과발현은 NSCLC 세포의 이동을 촉진하고 염증 인자의 발현을 상향 조절하였으며, dual luciferase 리포터 유전자 분석을 통해 miR-21-5p가 CADM1을 직접적으로 표적함이 확인되었습니다. CADM1의 과발현은 NSCLC 세포의 이동을 억제하고 염증 인자의 발현을 하향 조절하였습니다. 생물 정보학 분석 결과, miR-21-5p 표적 유전자는 종양의 발생 및 발전과 관련된 여러 신호 전달 경로에서 풍부하게 나타났습니다. miR-21-5p는 CADM1을 표적하여 억제함으로써 NSCLC의 진행을 촉진하며, 예후 바이오마커 및 치료 표적으로 활용될 수 있습니다.
서론
전 세계적으로 폐암은 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나이며, 그 발생률은 꾸준히 증가하고 있습니다1,2. 동아시아 인구의 경우, 폐암 발생률과 사망률은 남성 100,000명당 각각 222.1명과 155.5명이며, 여성은 각각 158.1명과 87.3명에 달합니다. 비소세포폐암(NSCLC)은 모든 폐암 악성 종양의 약 80%를 차지하며, 세 가지 주요 조직학적 하위 유형을 포함합니다3. 매우 공격적인 소세포폐암(SCLC)과 비교했을 때, NSCLC는 진행 및 전이 속도가 더 느립니다. 하지만 초기 임상 증상이 모호하여 환자의 75% 이상이 중기 또는 말기에 진단을 받게 되며, 이는 5년 전체 생존율이 지속적으로 낮게 나타나는 원인이 됩니다4. 폐 종양 발생은 온코진(oncogenic) 활성화와 종양 억제 유전자의 소실에 의해 유도되므로5, 새로운 치료법을 개발하기 위해 NSCLC의 분자적 기반을 분석하는 것이 시급합니다6.
마이크로RNA(miRNA, 길이 18~25 뉴클레오타이드)는 3' 말단에 결합함으로써 전사 후 유전자 억제를 매개합니다.′ 비번역 지역 (3' UTR)′표적 mRNA의 비번역 부위(non-translated region, UTR)에 결합하여 번역 억제 또는 mRNA 분해를 유도함7miRNA의 생합성은 RNA polymerase II 전사를 통해 primary miRNA 전사체를 생성하며 시작되며, 이후 RNase III 효소에 의해 절단되어 헤어핀 구조의 precursor miRNA(pre-miRNA)를 형성합니다.8대부분의 miRNA는 mRNA 3' 말단과의 부분적 또는 완전한 서열 상보성을 통해 유전자 발현을 억제하지만,′-UTR, 특정 miRNA는 특정 세포 주기 상황에서 mRNA 번역을 촉진할 수 있습니다9현재까지 수백 개의 인간 miRNA가 확인되었으며, 이는 세포 증식, 분화 및 세포 사멸을 포함한 핵심 생물학적 과정을 조절합니다.10이전에는 비정상적으로 발현된 miRNA의 검출이 기술적으로 어려웠으나, 고처리량 시퀀싱의 등장으로 질병 조직 내 조절 장애 miRNA에 대한 신속하고 편향 없는 프로파일링이 가능해졌습니다.11여기서는 RNA 폴리머라제 II에 의해 전사되는 가장 초기에 규명된 miRNA 중 하나로, 현재 그 발암성 조절 기능에 대해 집중적인 연구가 이루어지고 있는 miR-21-5p에 초점을 맞춥니다.12.
miR-21-5p는 다음의 인트론 내에 암호화되어 있습니다. TMEM49 유전자이며, 식도암, 대장암, 폐암을 포함한 여러 인간 악성 종양에서 일관되게 과발현됩니다.13기존의 비소세포폐암(NSCLC) 전임상 데이터는 이것의 종양 유발 활성을 확인시켜 줍니다. miR-21-5p의 수치 상승은 다음과 같은 항종양 표적을 억제함으로써 종양 증식, 상피-간엽 이행(EMT) 및 원격 전이를 가속화합니다. PTEN 및 PDCD414그럼에도 불구하고, 이전의 연구들은 주로 miR-21에 의해 유도되는 세포 사멸 및 증식 신호 전달에 집중해 왔으며, miR-21-5p/CADM1 비소세포폐암(NSCLC)의 조절 축15세포 접착 분자 1 (CADM1)는 상피성 암 전반에 걸쳐 잘 알려진 종양 억제제입니다.16이는 세포 간 접착을 유지하여 종양 세포의 분리와 전이성 확산을 차단하며, 이의 하향 조절은 비소세포폐암(NSCLC) 환자군에서 진전된 종양 단계 및 더 낮은 생존율과 상관관계가 있습니다. 기전적으로는, CADM1 또한 종양 촉진 nuclear factor kappa B (NF-κB) 전염증성 사이토카인 분비를 유도하고 종양 미세환경을 재구성함으로써 전이를 촉진하는 염증성 신호전달17miR-21-5p의 온코제닉 성향(oncogenicity)이 각각 입증되었음에도 불구하고 CADM1 종양 억제 효과에도 불구하고, miR-21-5p/와 관련하여 세 가지의 결정적인 지식 공백이 지속되고 있습니다.CADM1 NSCLC에서의 축: 첫째, 직접적인 결합 및 억제 CADM1 첫째, miR-21-5p 결핍에 의한 효과가 폐암 세포에서 실험적으로 검증되지 않았으며; 둘째, 이 축이 하위 염증 경로를 통해 악성 표현형을 유도하는지 여부가 정의되지 않았으며; 셋째, miR-21-5p의 복합적인 예후 예측 능력은CADM1 발현 시그니처가 임상 NSCLC 검체에서 평가되지 않았습니다.
이러한 미해결 질문들을 바탕으로, 우리는 다음과 같은 핵심 기전 가설을 제안합니다. NSCLC에서 상향 조절된 miR-21-5p가 CADM1 3′-UTR에 직접 결합하여 CADM1 발현을 억제하고, 이로 인해 CADM1에 의해 억제되었던 전이성 염증 신호 전달이 해제되어 NSCLC의 이동을 가속화하고 좋지 않은 임상 예후를 초래한다는 것입니다. 본 연구는 세 가지의 사전 정의된 연구 목표를 추구합니다: (1) miR-21-5p에 의한 CADM1의 직접적인 분자 표적화를 검증하고, A549 및 H1299 NSCLC 세포주에서 이동성을 평가합니다; (2) miR-21-5p/CADM1 폭포(cascade)가 염증 신호 전달을 통해 전이 가능성을 조절하는지 규명합니다; (3) miR-21-5p/CADM1 발현 패턴의 임상적 예후 가치를 평가하여 전이성 NSCLC를 위한 새로운 진단 바이오마커 및 치료 후보 물질을 발굴합니다.
프로토콜
본 후향적 연구는 Quzhou 중의병원의 윤리위원회(승인 번호 202402208)로부터 검토 및 승인을 받았습니다. 시료 수집 전, 등록된 모든 환자 또는 법정 대리인으로부터 서면 동의서를 받았습니다.
시료 수집
등록된 환자로부터 일차 NSCLC 종양 조직을 수술적으로 채취하였으며, 이에 대응하는 인접 정상 폐 조직은 National Engineering Research Center for Clinical Biopsy (중국 저장성 취저우시)에서 소급하여 수집하였다. 2019년 1월부터 2024년 12월 사이에 연속적으로 등록된 총 157개의 NSCLC 환자 표본이 본 코호트 연구에 포함되었다. 157개의 쌍 표본이라는 시료 크기는 이전에 발표된 NSCLC miRNA 예후 연구를 바탕으로 통계적으로 정당화되었다. 중간 정도의 효과 크기 0.5, α = 0.05, 통계적 검정력 80%를 가정했을 때, 필요한 최소 시료 크기는 122례로 계산되었다. 잠재적인 표본 손실, 심각한 조직 괴사 및 추적 관찰 실패 환자를 고려하여, 충분한 통계적 검정력을 보장하기 위해 2019년 1월부터 2024년 12월까지 157명의 적격 환자를 연속적으로 등록하였다. 모든 종양 조직과 대응하는 인접 정상 폐 조직은 수술적 절제 시 동일한 환자로부터 채취하여, 이후의 비교 분석을 위한 쌍 표본을 구성하였다.
포함 기준은 다음과 같았습니다: (1) 수술 후 생검을 통해 일차성 NSCLC로 병리학적 진단이 확정된 환자; (2) 완전한 임상 기초 자료, 조직병리학적 병기 및 장기 추적 관찰 생존 데이터 보유; (3) 조직 샘플링 전 방사선 치료, 화학요법 또는 표적 치료를 받은 적이 없는 경우; (4) 완전한 쌍을 이루는 종양 및 주변 정상 조직 표본 확보 가능.
제외 기준은 다음과 같았습니다: (1) 다른 장기의 복합 이차성 악성 종양; (2) 수술 후 3개월 이내에 추적 관찰이 중단된 환자; (3) 심한 괴사가 있거나 이후의 분자 검출을 위한 조직량이 불충분한 검체.
모든 신선 조직 샘플은 수술적 절제 후 15분 이내에 액체 질소에 넣은 후, 초저온 냉동고로 옮겨 RNA 및 단백질 추출을 위해 −80 °C에서 보관되었습니다. 정기적인 임상 추적 관찰을 수행하였으며, 전체 생존 기간은 병리학적 진단일부터 사망 또는 마지막 추적 관찰 종료일까지의 개월 수로 측정되었습니다.
miR-21-5p 발현 수준의 층화
전체 157명 환자의 miR-21-5p 상대적 발현 값을 오름차순으로 정렬하고, 중앙값 발현 컷오프를 기준으로 코호트를 층화하였다. 중앙값 부근에 중복된 값이 다수 존재함에 따라, 발현량이 중앙값 미만인 환자는 저발현군(n = 61)으로 배정하였으며, 중앙값과 동일하거나 그보다 높은 발현량을 보이는 환자(중앙값에서 중복된 모든 관찰값 포함)는 고발현군(n = 96)으로 분류하였다. 이러한 중복 값 할당 규칙은 중복된 중앙값 판독값을 해결하기 위해 그룹화 이전에 미리 지정되었으며, 그룹화 결과는 가공되지 않은 qRT-PCR 정량 데이터와 교차 검증되었다.
세포 배양
인간 NSCLC 세포주 A549 및 H1299를 상용 공급업체로부터 구입하였다(재료 표 참조). A549 세포는 RPMI-1640 배지에서 유지하였고, H1299 세포는 DMEM에서 배양하였다. 두 세포 배양 배지 모두 10% 열 불활성화 태아 송아지 혈청(FBS), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 µg/mL)을 첨가하여 농축하였다. 세포는 5% CO₂가 공급되는 습윤 인큐베이터 내 37 °C의 표준 조건에서 배양하였다.
모든 기능적 실험에 앞서 A549 및 H1299 세포주의 동일성을 확인하기 위해 단쇄 반복 서열(STR) 분석을 수행하였습니다. 마이코플라스마 오염 검사는 상용 PCR 기반 마이코플라스마 검출 키트를 사용하여 매월 실시하였으며, 마이코플라스마 음성 판정을 받은 세포만을 이후 분석에 사용하였습니다.
형태가 온전하고 대수 성장기에 있는 세포를 수확하여 일시적 transfection을 수행하였습니다. 지질 기반 transfection 시약(재료 표 참조)을 제조사의 지침에 따라 사용하였습니다. 이후의 세포 분석은 transfection 50 h 후에 실시하였습니다.
세포 형질전환
형질전환을 위해, 형태가 온전하고 대수 성장기에 있는 세포를 배양 플레이트에 24시간 전에 분주하여 60%–70%의 합류도(confluence)에 도달하게 하였다. 형질전환은 제조사의 지침에 따라 지질 기반 형질전환 시약(재료 표 참조)을 사용하여 수행하였다. mimic 음성 대조군(mimic-NC), miR-21-5p mimic, inhibitor 음성 대조군(inhibitor-NC), miR-21-5p inhibitor의 총 4개 실험군을 사용하였다. 뉴클레오타이드 서열은 보충 파일 1에 제공되어 있다.
전 transfection 50시간 후에 총 RNA를 추출하였으며, miR-21-5p의 상대적 발현량을 측정하고 transfection 효율을 검증하기 위해 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)을 수행하였습니다. 세포 이동성 분석은 transfection 50시간 후에 수행되었습니다. 일시적 transfection을 위해, 세포에 miR-21-5p mimic 또는 mimic 음성 대조군(mimic-NC)을 최종 농도 50 nM로 처리하였으며, miR-21-5p inhibitor 및 inhibitor 음성 대조군(inhibitor-NC)은 100 nM로 도입하였습니다. 핵산 투입량의 차이로 인한 혼란 변수를 방지하기 위해, transfection된 총 핵산의 양은 4가지 처리군 모두에서 동일하게 유지하였습니다.
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 분석을 통해 세포 증식도를 평가하였습니다. 안정적으로 형질전환된 세포를 96-well plate에 well당 3 × 103 cells로 분주하였으며, 각 그룹당 6개의 기술적 반복 시료를 설정하였습니다. 세포 분주 후 24, 48, 72시간에 각 well에 10 µL의 CCK-8 시약을 첨가하고 37 °C에서 2시간 동안 배양하였습니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 세포 증식도를 정량화하였습니다.
모든 일시적 형질전환, CCK-8 및 이동 실험은 최소 3회 이상의 독립적인 생물학적 반복 실험으로 수행되었으며, 각 생물학적 반복 실험에는 위에서 설명한 바와 같이 3~6회의 기술적 반복 실험이 포함되었습니다.
정량적 역전사 PCR
NSCLC 세포와 짝을 이룬 임상 종양 및 인접 정상 조직에서 페놀/구아니딘 기반 RNA 추출 시약( 재료 표 참조)을 사용하여 총 RNA를 분리하였습니다. RNA 순도와 농도는 자외선 분광 광도법으로 측정하였으며, 광학 밀도(OD) 260/280 및 OD 260/230 비율이 1.8–2.1인 샘플만 역전사를 진행하였습니다. 프라이머 서열은 보충 파일 1에 제공되어 있습니다. 역전사 시스템은 500 ng의 총 RNA, 2 µL의 역전사 버퍼, 1 µL의 dNTP 혼합물, 0.5 µL의 역전사 효소, miRNA용 특정 스템-루프 프라이머 또는 mRNA용 oligo(dT) 프라이머 1 µL, 그리고 총 부피 20 µL가 되도록 RNase-free water를 포함하였습니다. qRT-PCR 증폭 시스템(총 부피 20 µL)은 10 µL의 SYBR Green qPCR 마스터 믹스, 0.4 µL의 정방향 프라이머(10 µM), 0.4 µL의 역방향 프라이머(10 µM), 2 µL의 희석된 cDNA 템플릿, 그리고 7.2 µL의 RNase-free water로 구성되었습니다.
CADM1 및 GAPDH의 메신저 RNA는 역전사 키트를 사용하여 역전사하였으며, miR-21-5p는 stem-loop 프라이머와 외인성 cel-miR-39를 스파이크-인 컨트롤로 사용하여 역전사하였습니다. 외인성 cel-miR-39 스파이크-인은 총 RNA 분리 직후, 역전사 전에 각 RNA 샘플에 첨가하였습니다. 인간 전사체에 상동 서열이 없는 합성 C. elegans microRNA인 cel-miR-39는 서로 다른 임상 조직 샘플 간의 RNA 추출 효율 차이, RNA 분해 손실 및 역전사 효율 변동으로 인한 편차를 보정할 수 있어, miRNA 정량을 위한 외인성 범용 표준화 컨트롤로 사용됩니다. qRT-PCR은 형광 DNA 결합 염료 기반 마스터 믹스를 사용하여 실시간 PCR 시스템에서 수행하였습니다(재료 표 참조): 95 °C에서 3분간 가열한 후, 95 °C에서 10초, 60 °C에서 30초, 72 °C에서 20초로 40사이클을 반복하였으며, 특정 증폭을 확인하기 위해 멜팅 커브 분석을 실시하였습니다. 각 샘플은 3개의 생물학적 반복구와 각 반복구당 3개의 기술적 반복구를 두었으며, 상대적 발현량은 2⁻ΔΔCt 방법으로 계산하였습니다. CRP, TNF-α, IL-6 mRNA 증폭을 위한 전체 프라이머 서열은 CADM1, GAPDH 및 miR-21-5p 프라이머 서열과 함께 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.
렌티바이러스 매개 miR-21-5p 안정적 발현 체계 구축
상용 렌티바이러스 벡터인 LV-miR-21-5p와 공벡터 대조군인 LV-NC를 293T 세포에서 패키징하였다. miR-21-5p 전구체 서열을 puromycin 내성 및 GFP 리포터 유전자가 포함된 렌티바이러스 백본에 삽입하였다. 트랜스펙션 후 48 h 및 72 h에 렌티바이러스 상층액을 수집하여 농축 및 정제한 후 세포 감염에 사용하였다.
A549 및 H1299 세포를 감염 24시간 전에 분주하여 50–60%의 합류도(confluence)에 도달하게 하였다. 형질전환 효율을 높이기 위해 5 µg/mL polybrene을 첨가하여 A549 세포는 MOI = 10, H1299 세포는 MOI = 15로 감염시켰다. 감염 24시간 후에 배지를 교체하였으며, puromycin 스크리닝 전까지 48시간 동안 더 배양하였다.
5 µg/mL puromycin을 사용하여 10일 연속으로 안정적 세포 선택을 수행하였으며, 감염되지 않은 공백 세포를 사용하여 7일 이내에 비형질전환 세포가 완전히 제거되었음을 확인하였습니다. GFP 양성 단일 클론을 분리 및 확장하여 안정적인 단클론 세포주 LV-21 및 LV-NC를 생성하였습니다.
CADM1 구조 분석(rescue assay)을 위해, 상용 LV-CADM1 과발현 및 sh-CADM1 넉다운 렌티바이러스를 준비하였다. LV-NC, LV-miR-21-5p, LV-CADM1, 그리고 LV-miR-21-5p + LV-CADM1 구조 분석군의 네 가지 실험군을 설정하였다. CADM1 렌티바이러스는 miR-21-5p 벡터와 동일한 MOI 및 puromycin 스크리닝 조건에서 감염시켰다. 모든 구조 분석 증식 및 이동 실험은 세 번의 독립적인 생물학적 반복 실험을 통해 수행되었다.
miR-21-5p의 안정적 과발현 검증
수확된 LV-21 및 LV-NC 안정적 세포 클론에서 총 RNA를 추출하였다. cel-miR-39를 외인성 참조 물질로 사용하여 hsa-miR-21-5p의 상대적 발현 수준을 검출하기 위해 qRT-PCR을 수행하였다. LV-NC 그룹 대비 miR-21-5p가 8배 이상 상향 조절된 세포 클론을 이후의 모든 기능 분석에 사용하였으며, 이를 통해 miR-21-5p가 안정적으로 과발현된 세포주가 성공적으로 구축되었음을 확인하였다.
이중 루시페레이스 리포터 분석
예측된 miR-21-5p 결합 서열을 포함하는 야생형 CADM1 3'-UTR 리포터 플라스미드(WT-CADM1)와 결합 시드 영역이 돌연변이된 돌연변이 CADM1 3'-UTR 리포터 플라스미드(MUT-CADM1)를 제작하였다. transfection 24시간 전에 A549 세포를 24-well 플레이트에 분주하여 60%–70%의 합류도(confluence)에 도달하게 하였다. 각 웰에 500 ng의 WT/MUT 리포터 플라스미드, 50 nM miR-21-5p mimic 또는 mimic-NC, 그리고 Renilla 루시페레이스 내부 대조군 플라스미드를 정해진 질량 비율로 공동 transfection하였다. transfection 후 48시간 동안 배양한 뒤, 세포를 완전히 용해시키고 이중 루시페레이스 검출 키트를 사용하여 반딧불이 루시페레이스(firefly luciferase)와 Renilla 루시페레이스의 발광 신호를 순차적으로 검출하였다. 상대적 루시페레이스 활성은 반딧불이 루시페레이스 발광 값과 Renilla 루시페레이스 발광 값의 비율로 계산하였다. 각 실험군은 3개의 독립적인 생물학적 반복 실험을 수행하였으며, 각 생물학적 반복당 3개의 기술적 반복을 포함하였다. mimic-NC 그룹과 miR-21-5p mimic 그룹 간의 상대적 루시페레이스 활성을 통계적으로 비교하기 위해 이표본 독립 표본 t-검정을 사용하였다.
Transwell 이동 분석법
Transwell 이동 분석(migration assay)을 위해, 안정적으로 형질전환된 세포를 무혈청 배지에 현탁하여 상단 인서트에 4 × 104 웰당 세포 수. 화학 유인 구배를 형성하기 위해 하단 챔버를 10% FBS가 첨가된 완전 배양 배지로 채웠다. 다음으로 48시간 동안 다음 조건에서 배양하였다. 37 °C 5% CO₂를 포함하는 습윤 환경에서₂멤브레인의 윗면에 남아 있는 세포들을 조심스럽게 제거하였다. 멤브레인 아래쪽으로 이동한 세포들은 메탄올로 고정하고 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 인서트당 무작위로 선택한 5개의 현미경 시야에서 세포 수를 세어 이동 정도를 정량화하였다. 각 실험은 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험으로 수행되었으며, 각 생물학적 반복 실험마다 3회의 기술적 반복 실험을 포함하였다.
통계 분석
모든 in vitro 실험은 최소 3회의 독립적인 생물학적 반복 실험을 수행하였으며, 각각에 상응하는 기술적 반복 실험을 병행하였다. 데이터 분포는 통계 분석의 방향을 정하기 위해 Shapiro-Wilk 정규성 검사로 먼저 평가하였다. 종양 조직과 인접 정상 조직 간의 대응 표본 비교에는 데이터 분포에 따라 대응 표본 t-검정(paired t-test) 또는 대응 표본 Wilcoxon 부호 순위 검정을 적용하였다. 두 독립 집단 간의 비교는 독립 표본 t-검정 또는 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 분석하였다. 구조 실험(rescue experiments)을 포함한 다중 집단 간의 차이는 일원분산분석(one-way ANOVA) 후 Bonferroni 사후 교정으로 평가하였으며, CCK-8 증식 및 상처 치유 분석과 같은 종단적 데이터셋 분석에는 반복측정 분산분석(repeated-measures ANOVA)을 사용하였다. 범주형 임상 변수 간의 연관성은 χ2 검정으로 조사하였고, miR-21-5p와 CADM1 발현 사이의 관계는 Pearson 상관 분석으로 평가하였다. 환자 생존율은 Kaplan-Meier 곡선을 사용하여 분석하였으며, 비교는 log-rank 검정으로 수행하였다. 독립적인 예후 인자는 단변량 및 다변량 Cox 비례 위험 회귀 분석을 통해 식별하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 정의하였다. 다변량 Cox 회귀 분석에서는 연령, 성별, 조직학적 유형, miR-21-5p 수준 및 림프절 상태를 보정하였다(참조: 연령 ≤ 60, 여성, 편평 세포 암종, low miR-21-5p, 림프절 음성). Schoenfeld 잔차를 통해 비례 위험 가정을 확인하였으며, 단변량 분석에서 P < 0.10인 변수들을 enter selection 방식으로 포함하였다.
결과
miR-21-5p 발현과 NSCLC 환자의 임상병리학적 특성 간의 상관관계
총 157개의 NSCLC 종양 샘플을 miR-21-5p의 중앙값 수준을 기준으로 miR-21-5p 저발현군(n = 61)과 고발현군(n = 96)으로 층화하였으며, 카이제곱 분석 결과 miR-21-5p 발현은 환자의 연령(χ2 = 1.36, P = 0.2435), 성별(χ2 = 1.06, P = 0.3032), 조직학적 유형(χ2 = 1.09, P = 0.2965) 또는 종양 크기(χ2 = 5.623, P = 0.0601)와 유의미한 상관관계가 없음을 확인하였다. 반면, miR-21-5p의 고발현은 높은 종양 등급(χ2 = 16.25, P = 0.00006), 양성 림프절 전이(χ2 = 12.17, P = 0.00049) 및 더 높은 T stage(χ2 = 4.30, P = 0.117)와 유의미하게 연관되어 있었으며, 이는 miR-21-5p가 NSCLC 진행을 촉진하는 종양 유발 효과를 나타냄을 시사한다(Table 1).
NSCLC의 독립적 예후 인자를 위한 다변량 Cox 비례 위험 회귀 분석
연령, 성별, 조직학적 유형, miR-21-5p 발현 및 림프절 전이를 포함한 다변량 Cox 회귀 분석 결과, miR-21-5p의 높은 발현(위험비 [HR] = 3.066; 95% 신뢰구간 [CI]: 1.412–6.659; P = 0.005)과 양성 림프절 전이(HR = 22.295; 95% CI: 3.039–163.588; P = 0.002)가 NSCLC 환자의 낮은 전체 생존율에 대한 독립적인 불리한 예후 위험 인자인 것으로 나타났으며, 환자의 연령, 성별 및 조직학적 아형은 유의미한 독립적 예후 영향을 미치지 않았다(모두 P > 0.05) (표 2).
miR-21-5p의 임상적 발현 특성 및 그 상관관계 CADM1 및 염증 인자
쌍을 이룬 비소세포폐암(NSCLC) 종양 및 인접 정상 조직의 qRT-PCR 검출 결과, 정상 대조군에 비해 암 조직에서 miR-21-5p의 상대적 수치가 유의하게 높게 나타났습니다 (그림 1A, P < 0.001). Kaplan-Meier 생존 곡선 분석 결과, miR-21-5p 발현량이 높은 환자군은 miR-21-5p 발현량이 낮은 환자군에 비해 전체 생존율이 유의하게 더 낮음을 보여주었다 (그림 1B, P = 0.0027). 염증 매개체인 C-반응성 단백질(CRP), 종양괴사인자 알파(TNF-α) 및 인터루킨-6(IL-6)의 mRNA 풍부도는 NSCLC 검체에서 모두 현저하게 상향 조절되었습니다.그림 1C, P < 0.01, P < 0.001). 피어슨 상관 분석 결과, miR-21-5p와 ... 사이에 매우 유의미한 음의 상관관계가 있음이 밝혀졌다. CADM1 임상 시료에서의 mRNA 발현 (r = -0.7773, 95% CI: -0.8325 ~ -0.7076, P < 0.0001, 그림 1D).
NSCLC 세포에서 miR-21-5p의 세포 기능 검증
qRT-PCR을 통해 A549 및 H1299 세포에서 miR-21-5p mimic의 형질도입 효율이 성공적임을 확인하였다(그림 2A). Transwell 분석 결과, miR-21-5p의 과발현은 두 세포주 모두에서 상대적 이동 능력과 세포 이동 수를 유의미하게 증가시켰다(그림 2B,C). 염증성 사이토카인의 qRT-PCR 검출 결과, miR-21-5p mimic 형질도입 후 CRP, TNF-α 및 IL-6의 mRNA 수준이 현저히 증가하였으며, miR-21-5p inhibitor 처리는 이러한 상향 조절을 역전시켰다(그림 2D). 구조 실험(Rescue experiments)을 통해 miR-21-5p mimic이 CADM1 전사를 급격히 억제하며, LV-CADM1 공동 형질도입이 A549 및 H1299 세포에서 CADM1 mRNA 발현을 완전히 회복시킴을 검증하였다(그림 2E,F). 종합적으로, 이러한 세포 데이터는 miR-21-5p가 CADM1을 억제함으로써 NSCLC 세포의 이동과 염증 반응을 촉진한다는 것을 입증하였다.
miR-21-5p가 NSCLC 세포 증식에 미치는 영향
24h, 48h 및 72h에서의 CCK-8 증식 곡선을 통해 miR-21-5p mimic 형질전환이 A549 및 H1299 세포 모두에서 450 nm의 OD 값을 현저히 증가시켰음을 확인하였으며, 반면 miR-21-5p inhibitor는 세포 생존율을 유의미하게 억제하였고, 72h에서 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되었습니다 (그림 3A,B; P < 0.001). 이러한 데이터는 miR-21-5p가 NSCLC 세포에 대해 증식 촉진 효과를 나타낸다는 것을 입증합니다.
생물정보학적 예측 및 이중 루시페라제 리포터 분석을 통한 miR-21-5p의 직접적인 표적으로서 CADM1의 검증
miR-21-5p의 하위 후보 유전자를 스크리닝하기 위해 세 가지 온라인 miRNA 표적 예측 데이터베이스(miRWalk, StarBase, TargetScan)의 교집합을 분석하였으며, 그 결과 95개의 중복 표적 유전자를 확보하였다(그림 4A). 유전자 온톨로지(GO) 풍부도 분석 결과, 이러한 후보 유전자들은 주로 세포 대사, 스트레스 반응 및 전사 조절과 관련된 생물학적 과정, 세포 구성 성분 및 분자 기능에 풍부하게 분포되어 있었다(그림 4B). Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 경로 풍부도 분석을 통해 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 및 Ras 경로를 포함한 종양 관련 신호 전달 폭포에서 뚜렷한 풍부도가 추가로 확인되었다(그림 4C). 이중 루시페라제 리포터 분석 결과, miR-21-5p mimic은 야생형 CADM1 3'-UTR 리포터의 상대적 루시페라제 활성을 유의하게 억제한 반면, 변이형 CADM1 3'-UTR 군에서는 억제 효과가 관찰되지 않아(그림 4D, P < 0.01, ns: 유의하지 않음), miR-21-5p와 CADM1 사이의 직접적인 결합이 확인되었다.
구조 실험을 통한 CADM1 억제에 의한 NSCLC 악성 표현형 촉진
qRT-PCR을 통해 A549 및 H1299 세포에서 miR-21-5p mimic과 inhibitor의 형질전환 효율을 확인하였다(그림 5A). CADM1 과발현(LV-CADM1)은 염증성 인자인 CRP, TNF-α 및 IL-6의 mRNA 수준을 감소시킨 반면, 소간섭 RNA(si-CADM1)를 이용한 CADM1 넉다운은 이들의 발현을 현저히 증가시켰다(그림 5B). Transwell 이동 분석 결과, LV-CADM1 형질전환은 두 NSCLC 세포주의 이동 능력을 유의하게 억제하였다(그림 5C,D). CCK-8 증식 분석 결과, LV-21에 의한 증식 촉진 효과는 LV-CADM1 공동 형질전환에 의해 완전히 상쇄되었으며, si-CADM1에 의해 유도된 세포 성장 가속화는 miR-21-5p inhibitor에 의해 회복될 수 있었다(그림 5E,F). 종합적으로, 이러한 구조 데이터는 CADM1이 NSCLC에서 miR-21-5p에 의해 유발되는 증식, 이동 및 염증 활성화를 담당하는 기능적 하위 매개체로 작용함을 입증하였다.
데이터 가용성:
본 연구의 결과물를 뒷받침하는 소스 데이터는 보충 파일 2에 제공되며, 발행된 논문과 함께 확인할 수 있습니다.
그림 1: 임상 NSCLC 샘플에서 miR-21-5p, 염증 인자의 발현 프로파일 및 이들의 CADM1과의 상관관계. (A) 정상 폐 조직과 NSCLC 종양 조직에서의 miR-21-5p의 상대적 발현량. (B) miR-21-5p 발현 수준에 따라 층화된 NSCLC 환자의 Kaplan-Meier 전체 생존 곡선. (C) 정상 조직과 NSCLC 조직에서 염증 인자 CRP, TNF-α, 및 IL-6의 상대적 mRNA 발현량. (D) miR-21-5p와 CADM1 mRNA 발현 사이의 음의 선형 상관관계를 보여주는 Pearson 상관관계 산점도. **P < 0.01, ***P < 0.001. 패널 C의 경우: CRP, TNF-α, IL-6에 대해 각각 쌍을 이룬 종양 조직과 인접 정상 조직 간의 통계적 비교를 수행하였으며, **P < 0.01, ***P < 0.001은 매칭된 정상 폐 조직 대비 유의미한 차이를 나타냄. 모든 패널은 3개 이상의 독립적인 생물학적 반복 실험을 포함함; qRT-PCR 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시함; 그룹 간 비교에는 paired t-test를 사용함; 산점도 상관관계 분석에는 Pearson 테스트를 사용함. 약어: CADM1 = cell adhesion molecule 1; CI = 신뢰 구간; CRP = C-반응성 단백질; IL-6 = 인터루킨-6; NSCLC = 비소세포폐암; TNF-α = 종양괴사인자 알파. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: A549 및 H1299 NSCLC 세포에서 miR-21-5p에 의해 조절되는 세포 표현형 및 CADM1 발현. (A) mimic transfection 후 miR-21-5p 발현의 qRT-PCR 검출. (B) Transwell 분석을 통한 상대적 세포 이동의 통계적 정량화. (C) 현미경 시야당 이동된 세포 수의 정량화. (D) miR-21-5p 과발현 또는 억제 하에서의 CRP, TNF-α 및 IL-6의 상대적 mRNA 발현. (E) A549 rescue 그룹(NC, miR-21-5p mimic, LV-CADM1, mimic+LV-CADM1)에서의 상대적 CADM1 mRNA 발현. (F) H1299 rescue 그룹에서의 상대적 CADM1 mRNA 발현. **P < 0.01, ***P < 0.001. 모든 세포 분석은 각각 3회의 기술적 반복을 포함하여 3회의 독립적인 생물학적 반복으로 수행되었으며, 오차 막대는 mean ± SD를 나타냄; 그룹 간 비교에는 Bonferroni 보정을 적용한 one-way ANOVA를 사용함; 그룹 레이블은 Method에 설명된 transfection 그룹과 정확히 일치함. 약어: CADM1 = cell adhesion molecule 1; CRP = C-reactive protein; IL-6 = interleukin-6; LV = lentiviral vector; NC = negative control; NSCLC = non-small cell lung cancer; qRT-PCR = quantitative reverse-transcription PCR; TNF-α = tumor necrosis factor alpha. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: miR-21-5p 과발현 또는 넉다운 후 세포 생존능을 반영하는 CCK-8 증식 곡선. (A) mimic-NC, miR-21-5p mimic, inhibitor-NC 또는 miR-21-5p inhibitor를 형질전환시킨 A549 세포의 시간 의존적 OD₄₅₀ 흡광도 곡선. (B) 네 가지 형질전환 그룹에 따른 H1299 세포의 시간 의존적 OD₄₅₀ 흡광도 곡선. ***P < 0.001. CCK-8 분석은 3회의 생물학적 반복 실험 동안 그룹당 6개의 기술적 반복 시료를 포함하였습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었으며, 시점 간 비교를 위해 반복측정 분산분석(repeated-measures ANOVA)을 사용하였습니다. 약어: CCK-8 = Cell Counting Kit-8; NC = 음성 대조군; OD = 광학 밀도. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 4: miR-21-5p 표적 유전자 CADM1에 대한 생물정보학 스크리닝 및 이중 루시퍼라제 분석. (A) miRWalk, StarBase 및 TargetScan 예측 데이터베이스를 통해 확인된 miR-21-5p의 공통 표적 유전자를 나타내는 벤 다이어그램. (B) 교차 표적 유전자에 대한 GO 기능 풍부도 분석의 버블 플롯. (C) 상위 풍부 KEGG 신호 전달 경로의 바 플롯. (D) miR-21-5p 과발현 후 야생형 및 돌연변이 CADM1 3'-UTR의 이중 루시퍼라제 리포터 활성. **P < 0.01; ns, 유의성 없음. 패널 D는 이중 루시퍼라제 검출을 위해 miR-21-5p mimic/mimic-NC와 함께 공동 형질전환된 WT-CADM1 3'-UTR 및 MUT-CADM1 3'-UTR만 채택하였으며, 초기 플로팅 초안에 표시된 Control/overexpression/interference 레이블은 최종 그림에서 표준 WT/MUT 그룹으로 조정되었습니다. 표적 예측 분석에는 3개의 온라인 데이터베이스가 사용되었으며, 풍부도 P 값은 Benjamini-Hochberg FDR 보정을 통해 조정되었습니다. 이중 루시퍼라제 실험은 3회의 생물학적 반복(각 3회의 기술적 반복)으로 수행되었으며, 오차 막대는 평균 ± SD를 나타냅니다. 통계적 비교에는 2그룹 t-test가 사용되었습니다. 약어: CADM1 = cell adhesion molecule 1; GO = Gene Ontology; KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MUT = 돌연변이; NC = 음성 대조군; ns = 유의하지 않음; UTR = 비번역 지역; WT = 야생형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5miR-21-5p/LATS2 축을 검증하는 기능적 회복 실험CADM1 A549 및 H1299 세포 내의 조절 축. (A) mimic 또는 inhibitor transfection 후의 miR-21-5p 상대적 발현량. (B) 의 상대적 mRNA 발현량 C-반응성 단백질(CRP), TNF-α및 IL-6 LV-에서CADM1 그리고 si-CADM1 그룹. (C) ~하에서의 상대적 이동 능력에 대한 통계적 정량화 CADM1 과발현. (D) LV- 내 현미경 시야당 이동 세포 수의 정량화CADM1 그룹. (E) A549 회복군(LV-NC, LV-21, LV-)의 CCK-8 OD₄₅₀ 값CADM1, LV-21+LV-CADM1, si-NC, si-CADM1, si-CADM1+miR-21 억제제). (F) 동일한 형질전환 처리를 거친 H1299 구조군(rescue groups)의 CCK-8 OD₄₅₀ 값. **P < 0.01, ***P < 0.001. 모든 구조 분석(rescue assay)은 세 번의 독립적인 생물학적 반복 실험을 포함하였습니다. 오차 막대는 평균 ± 표준편차(SD)를 나타내며, 다중 그룹 비교에는 Bonferroni 사후 검정을 동반한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하였습니다. 약어: CADM1 CAM = 세포 접착 분자 1; CRP = C-반응성 단백질; IL-6 = 인터루킨-6; LV = 렌티바이러스 벡터; NC = 음성 대조군; OD = 광학 밀도; qRT-PCR = 정량적 역전사 PCR; si = 짧은 간섭 RNA; TNF-α = 종양 괴사 인자 알파. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.
| miR-21-5p 발현 | 총계 | 제시된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.2 | p-값 | |||
| 낮음 | 높음 | |||||
| 연령(세) | ≤60 | 24 | 29 | 53 | 1.357 | 0.244 |
| ˃60 | 37 | 67 | 104 | |||
| 합계 | 61 | 96 | 157 | |||
| 성별 | 수컷 | 42 | 73 | 115 | 1.06 | 0.3032 |
| 여성 | 19 | 23 | 42 | |||
| 합계 | 61 | 96 | 157 | |||
| 조직학적 유형 | 편평세포암종 | 31 | 41 | 72 | 1.09 | 0.2965 |
| 선암종 | 30 | 55 | 85 | |||
| 총합 | 61 | 96 | 157 | |||
| 종양 등급 | Ⅰ-Ⅱ | 55 | 58 | 113 | 16.25 | 0.00006 |
| Ⅲ | 6 | 38 | 44 | |||
| 총계 | 61 | 96 | 157 | |||
| 림프절 전이 | 음성 | 41 | 37 | 78 | 12.17 | 0.00049 |
| 양성 | 20 | 59 | 79 | |||
| 총계 | 61 | 96 | 157 | |||
| 종양 크기(cm) | ≤3 | 20 | 23 | 43 | 5.623 | 0.0601 |
| 3-7 | 40 | 62 | 102 | |||
| ˃7 | 1 | 11 | 12 | |||
| 합계 | 61 | 96 | 157 | |||
| T 병기 | T1 | 15 | 17 | 32 | 4.295 | 0.117 |
| T2 | 36 | 52 | 88 | |||
| T3 | 10 | 27 | 37 | |||
| 총계 | 61 | 96 | 157 | |||
표 1: 비소세포폐암 환자의 miR-21-5p 발현과 임상병리학적 특성 간의 연관성. 수치는 환자 수입니다. 연관성은 χ2 검정으로 평가되었습니다. 약어: NSCLC = 비소세포폐암. 범주형 임상병리학적 변수에 대해 각각 χ2 검정을 수행하였으며, 모든 분석에는 157명의 환자 샘플 전체를 적용하였습니다.
| n | P 값 | 상대 위험도 | 95% 신뢰 구간 | |||
| 낮춤 | 상단 | |||||
| 연령 (세) | ≤60 | 53 | 0.503 | 1.282 | 0.62 | 2.652 |
| ˃60 | 104 | |||||
| 성별 | 수컷 | 115 | 0.339 | 1.418 | 0.693 | 2.901 |
| 여성 | 42 | |||||
| 조직학적 유형 | 편평세포암종 | 72 | 0.515 | 1.261 | 0.627 | 2.537 |
| 선암종 | 85 | |||||
| miR-21-5p 발현 | 높음 | 96 | 0.005 | 3.066 | 1.412 | 6.659 |
| 낮음 | 61 | |||||
| 림프절 전이 | 음성 | 78 | 0.002 | 22.295 | 3.039 | 163.588 |
| 양성 | 79 | |||||
표 2: 비소세포폐암 환자의 전체 생존율에 대한 다변량 Cox 비례위험도 분석. 값은 95% 신뢰구간을 포함한 위험비입니다. 약어: CI = 신뢰구간; NSCLC = 비소세포폐암. 전체 임상 코호트 데이터를 대상으로 다변량 Cox 회귀 분석을 수행하였으며, 독립적인 예후 스크리닝을 위해 HR 및 95% CI를 산출하였습니다.
보충 파일 1: 형질전환 및 정량적 역전사 PCR에 사용된 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머 서열. 이 파일에는 miR-21-5p mimic 및 inhibitor와 각각의 음성 대조군, 그리고 CADM1, GAPDH, hsa-miR-21-5p, cel-miR-39의 프라이머가 나열되어 있습니다. 모든 서열은 5′–3′ 방향으로 표시되었습니다. 약어: CADM1 = cell adhesion molecule 1; cel = Caenorhabditis elegans; GAPDH = glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; hsa = Homo sapiens; miR = microRNA; PCR = polymerase chain reaction. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2. 그림을 뒷받침하는 소스 데이터. 이 파일에는 임상적 특성, 발현 분석, 생존 데이터 및 관련 통계 결과를 포함하여 원고에 제시된 그림을 생성하는 데 사용된 기본 데이터 세트와 통계 분석이 포함되어 있습니다. 이러한 소스 데이터는 본문에 보고된 연구 결과를 뒷받침합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
본 연구에서는 NSCLC 임상 조직에서 miR-21-5p의 발현이 증가해 있음을 체계적으로 확인하였으며, 이는 염증 인자 전사의 강화, 세포 이동 및 증식 능력의 증대와 상관관계가 있음을 밝혀냈습니다. 또한 dual-luciferase, qRT-PCR 및 rescue 실험을 통해 CADM1이 miR-21-5p의 직접적인 기능적 표적임을 확인하였습니다. 생물정보학적 예측 결과 miR-21-5p의 하위 표적들이 MAPK 및 Ras 발암 캐스케이드에 농축되어 있음을 나타냈으며, 이는 miR-21-5p/CADM1 축이 종양의 악성 진행 관련 신호 전달 경로에 관여할 수 있다는 예비 근거를 제공합니다.
임상 코호트 분석 결과, miR-21-5p의 높은 발현은 높은 종양 등급, 림프절 전이 및 짧은 전체 생존 기간과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났습니다. 다변량 Cox 회귀 분석을 통해 miR-21-5p가 독립적인 불량 예후 인자임이 확인되었으며, 이는 miR-21-5p가 NSCLC 환자의 진행 위험 및 생존 결과를 평가하는 잠재적 바이오마커로 활용될 수 있음을 시사합니다.
In vitro 기능 분석 결과, miR-21-5p의 과발현은 NSCLC 세포의 증식, 이동 및 염증 반응을 촉진한 반면, CADM1의 상향 조절은 이러한 모든 종양 형성 표현형을 역전시켰습니다. 환자 샘플에서 miR-21-5p와 CADM1 사이의 음의 발현 상관관계와 세포 구조 데이터는 miR-21-5p가 CADM1을 직접적으로 억제함으로써 NSCLC의 악성 행동을 유도한다는 조절 기전을 충분히 규명하였습니다.
폐암에서 miR-21-5p의 발암 역할에 대해 보고한 이전 연구들과 일관되게, 본 연구는 이를 뒷받침하는 임상 상관관계 데이터와 완전한 구조(rescue) 검증을 추가하여 종양 촉진 기능을 공고히 하였습니다. 단일 전이 표현형에만 집중했던 기존 연구들과 달리, 본 연구는 CADM1 표적을 통해 miR-21-5p를 세포 증식 및 종양 염증 미세환경과 동시에 연결함으로써, 비소세포폐암(NSCLC) 내 miR-21-5p의 조절 네트워크를 확장하였습니다.
위의 예비 증거를 바탕으로, 조직 내 miR-21-5p 발현 검출은 NSCLC 위험 층화 및 예후 평가에 보조적인 가치가 있을 가능성이 있으며, miR-21-5p/CADM1 축은 NSCLC의 진행 억제 중재 전략 개발을 위한 새로운 후보 분자 표적을 제공할 수 있으나, 임상적 치료 효능은 아직 검증되어야 한다.
본 연구에는 몇 가지 제한점이 있습니다. in vivo 이종이식 실험이나 독립적인 외부 코호트 검증 없이 in vitro 세포 분석과 단일 후향적 임상 코호트만을 사용하였습니다. 추가적인 증식 분석(예: EdU 및 콜로니 형성 분석), 침습, 세포 사멸 및 세포 주기 분석은 수행되지 않았습니다. 비침습적 진단 가능성을 위한 말초 혈액 검사, CADM1 단백질 수준의 검증, 전체 중첩 표적 유전자 목록 및 체계적인 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석 또한 이루어지지 않았습니다. 향후 연구에서는 이러한 제한점을 보완하고 miR-21-5p의 상위 조절 인자와 하위 CADM1 신호 전달 체계를 추가로 조사해야 합니다.
종합적으로, 본 연구는 miR-21-5p가 CADM1을 직접적으로 표적함으로써 NSCLC의 증식, 이동 및 염증을 가속화하는 온코제닉 마이크로RNA(oncogenic microRNA)로 작용하며, 이의 높은 발현이 환자의 불량한 생존율을 예측한다는 예비 증거를 제공합니다.
공개 사항
저자들은 공개해야 할 관련 재정적 또는 비재정적 이해관계가 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| A549 세포주 | ATCC (또는 상하이 리소스 센터) | CCL-185 | 인간 비소세포폐암(NSCLC) 세포주(선암) |
| CCK-8 분석 키트 | Dojindo | CK04 | 증식 검출 |
| 세포 배양 배지 (미지정) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 다양함 (예: RPMI-1640: 11875093, F-12K: 21127022) | NSCLC 세포주용 기초 배지; 정확한 조성은 사용되는 세포주에 따라 다름 |
| cel-miR-39 (외인성 스파이크-인 대조군) | GenePharma (중국 상하이) | 사용자 정의 (예: B010302) | RNA 분리 단계에서 추가된 miRNA 발현 정규화를 위한 외부 참조 표준물질 |
| 일산화탄소2 인큐베이터 (습윤) | Thermo Fisher Scientific (Heracell) | Heracell 150i (50116047) | 제공합니다 37°C, 5% CO22및 세포 배양을 위한 포화 습도 |
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| 소태아혈청 (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10437028 | 세포 성장을 돕기 위해 최종 농도 10%로 배지에 첨가한 보충제 |
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| GAPDH (내인성 대조군) | 다양한 공급업체 (예: Sangon Biotech, RiboBio; 맞춤형 프라이머) | 사용자 정의 | qRT-PCR에서 사용되는 mRNA 정규화를 위한 참조 유전자 |
| GO/KEGG (clusterProfiler 주석 분석) | Bioconductor | 2026 빌드 | |
| GraphPad Prism | GraphPad 소프트웨어 | v9.5.1 | 플로팅(Plotting) & 인비트로(in vitro) 통계 분석 |
| H1299 세포주 | ATCC (또는 상하이 자원 센터) | CRL-5803 | 림프절 전이에서 유래한 인간 비소세포폐암(NSCLC) 세포주 |
| 열불활성화 FBS | Gibco | 10099141 | 10% 최종 농도 |
| HEK-293T 세포주 | ATCC | CRL-3216 | RRID:CVCL_0063; 매월 STR 검사 실시, 마이코플라스마 검출 음성 |
| 렌티바이러스 패키징 믹스 | Genecopoeia (또는 Takara Bio) | HPK-LvT-100 (Genecopoeia) | 렌티바이러스 생산을 위한 패키징 플라스미드(gag/pol, rev, vsv-g)를 제공합니다. |
| Lentivirus-21 벡터 (LV-21) | GeneChem (중국 상하이) 또는 Genecopoeia | 사용자 정의 | 안정적 발현 세포주 구축을 위한 miR-21-5p 함유 렌티바이러스 벡터 |
| 렌티바이러스-NC 벡터 (LV-NC) | GeneChem (중국 상하이) 또는 Genecopoeia | 사용자 정의 | miR-21-5p 삽입물이 없는 음성 대조군 렌티바이러스 벡터 |
| 지질 전이 시약 | Thermo Fisher | L3000015 | 일시적 형질전환을 위해 |
| Lipofectamine 3000 transfection 시약 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L3000015 또는 L3000008 | 지질 기반 형질전환 시약; 이후 실험을 위해 형질전환 후 50시간 경과 시점 |
| 메탄올 | Sinopharm | 67-56-1 | 세포 고정 |
| 메탄올 (고정액/염색 희석제) | Sigma-Aldrich | 34860 | 크리스탈 바이올렛 염색을 위한 고정액 또는 희석제로 사용됨 |
| miR-21-5p 억제제/억제제-NC | GenePharma | 맞춤형 합성 | 보충 파일 1의 서열 |
| miR-21-5p mimic/mimic-NC | GenePharma | 맞춤형 합성 | 보충 파일 1의 서열들 |
| miRDB | 워싱턴 대학교 | v6.0 | |
| miRWalk | 하이델베르크 대학교 | v3.0 | |
| 국립 생검 공학 센터 | 국가 생검 공학 센터 (중국) | 해당 사항 없음 | 임상 데이터 및 조직병리학적 진단 기록이 포함된 폐암 조직 샘플의 기관 제공처 |
| NSCLC 조직 (일차 배양용) | Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co. | 맞춤 주문 | 조직 기원; 10% FBS 배지에서 배양함 37°C; transfection을 위해 대수 성장기 단계에서 형태학적으로 양호한 세포를 선별함 |
| PCR 기기 | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 7500 Fast (4406984) | qRT-PCR을 위한 증폭 산물 확보 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Solarbio | P1400 | 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 |
| 피펫 (싱글 채널) & 멀티채널) | Eppendorf | Research Plus 시리즈 | 모든 실험에서 정밀한 액체 핸들링을 위해 |
| 폴리브렌 | Sigma-Aldrich | H9268 | 최종 5 μg/mL 렌티바이러스 감염을 위해 |
| 퓨로마이신 | InvivoGen | 개미-pr-1 | 5 μg/mL 안정적 세포주 스크리닝을 위해 |
| 퓨로마이신 이염산염 | Thermo Fisher Scientific (InvivoGen) | ant-pr-1 (InvivoGen); P7255 (Sigma-Aldrich) | 선별 항생제, 사용 농도 5 μg/mL 안정적 형질전환 세포주를 구축하기 위해 |
| R | R 재단 | v4.2.1 | 패키지: clusterProfiler, ggplot2 |
| 역전사 키트 | Takara | RR047 | miRNA를 위한 Stem-loop RT, mRNA를 위한 oligo(dT) |
| RNase-free EP 튜브 | Axygen (Corning) | MCT-150-C | RNA 저장 및 처리를 위한 1.5 mL RNase-free 튜브 |
| RPMI-1640 배지 | Gibco | 11875093 | A549 배양을 위해 |
| si-CADM1 | GenePharma | 맞춤 합성 | 보충 파일 1의 서열들 |
| si-NC | GenePharma | 맞춤형 합성 | 보충 파일 1의 서열들 |
| SPSS | IBM | v26.0 | 임상/Cox 회귀 분석 |
| SYBR Green qPCR 마스터 믹스 | Roche | 4913914001 | qRT-PCR 증폭 |
| TargetScan | MIT | v8.2 | |
| 전체 RNA 추출 시약 | Takara | 9109 | 페놀/구아니딘 기반 용해 |
| 트랜스웰 챔버 | Corning (Costar) | 3422 (24-웰, 8.0 µm) | 실온의 배지 내 세포 형질전환을 위해 화학적 프라이머를 첨가하고 48시간 동안 배양함 |
| Transwell 이동 챔버 | Corning | 3422 | 8 μm 공극 크기 |
| TRIzol 시약 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | 조직 샘플로부터의 총 RNA 추출; OD260/280 및 OD260/230 비율을 통한 RNA 품질 평가 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 25200072 | 24-웰 플레이트에 분주하기 전, 배양 용기에서 세포를 분리하기 위해 |
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