저융 아가로스 하이드로겔에서의 단백질 안정화 및 단백질—RNA 응축액 정량 생물물리학적 측정

요약

여기서는 다공성 저융 아가로스 하이드로겔 매트릭스 내에서 액체-액체 상 분리 응축액을 내부 액체 역학을 방해하지 않고 물리적으로 고정하는 견고한 방법을 제시합니다. 이 접근법은 방울 침전, 응집, 표면 습윤 유물을 최소화하여 수 시간 동안 반복 가능한 영상 촬영과 정량적 생물물리학적 분석을 가능하게 합니다.

초록

액체-액체 상 분리로 형성된 생체분자 응축액은 RNA 처리부터 응력 과립 조립에 이르기까지 다양한 역할을 수행하는 세포의 기본 조직 단위로 점점 더 인식되고 있습니다. 정제된 단백질과 RNA를 이용한 시험 관 내 응축액 재구성은 모델 시스템을 제공하지만, 액체 방울은 시간이 지남에 따라 거칠어지고 퇴적되며 표면에 퍼져 실험 시간 동안 정량적 측정에 상당한 변동성을 초래합니다. 이 응축액을 희박하고 광학 투명하며 화학적으로 불활성인 하이드로겔(여기서는 0.3–1.0% w/v 용해도의 저용도 아가로스(LMA)에서 제조하여 3차원에서 방울을 안정화시켜 측정 시간이 긴 방법론이나 반복 측정이 가능한 실험 장치를 사용할 수 있게 합니다. 이 논문은 LMA 재고 준비, 방울 형성 및 삽입에 대한 상세한 단계별 프로토콜을 제시하고, 특정 하류 생물물리학적 측정값 예시를 제공합니다. 또한 LMA 삽입 후에도 분자 확산과 같은 특정 비말 특성이 대표적인 시스템에서 보존됨을 보여준다. 이 방법은 공초점, 광시야, 초해상도 현미경, 광표백 후 형광 회복, 핵자기공명 분광법 등과 호환되기 때문에, 건강과 질병에 관련된 생체분자 응축체의 정량적 특성 분석에 지원할 수 있습니다.

서론

액체-액체 상 분리(LLPS)는 세포 내에서 막이 없는 소기관과 생체분자 응축체의 형성을 촉진하며, 여기에는 응력 과립, P-몸체, 그리고 핵소체 1,2,3,4,5가 포함됩니다. 이 응축액은 특정 단백질과 핵산을 농축하면서 주변 세포질 또는 핵질과의 빠른 교환을 유지하는데, 이는 액체 같은 행동의 특징입니다 ^1,2,3,4,5. LLPS의 조절 장애는 신경퇴행성 질환 ^3,6,7과 같은 다양한 질병과 연관되어 있으며, SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12와 같은 여러 바이러스의 복제에도 관여하고 있습니다.

정제 단백질과 RNA를 이용한 정제 완충 조건 하에서의 시험관 내 응축액 재구성은 LLPS 기전 연구의 핵심 접근법이 되었습니다 ^3,4. 그러나 시험관 내나 유리 표면 위의 물방울은 세 가지 주요 인공에 취약합니다: (i) 중력 침전으로 인해 바닥에 물방울이 쌓이고; (ii) 시간이 지나면서 방울이 더 적고 큰 구조로 융합되는 결합; 그리고 (iii) 표면 습윤, 즉 물방울이 덮개에 퍼져 부분적으로 흡착되는 현상. 이러한 현상은 정량적 측정의 재현성을 저하시키고, 개별 비말을 생리학적으로 중요한 차원으로 추적하기 어렵게^{만듭니다.} 이러한 현상은 분에서 몇 시간까지 긴 측정 시간을 요구하는 방법(예: 핵자기공명[NMR] 분광법이나 STORM과 같은 초해상도 현미경 기법)의 사용을 더욱 제한하며, 장기간에 걸친 반복 측정을 금지합니다.

하이드로겔 네트워크 내의 물리적 고정은 세 가지 인공물을 동시에 다룹니다. 아가로스는 34–38°C 이하의 온도에서 물리적으로 가교결합된 겔을 형성합니다. 0.3–1.0% w/v의 농도에서 아가로스의 메시 크기는 완전한 마이크로미터 규모 방울을 캡슐화할 만큼 충분히 크면서도 방울 내 분자 역학을 방해하지 않을 만큼 다공성을 유지한다¹³. 또한, 아가로스 매트릭스의 다공성 덕분에 고분자와 소분자가 박힌 방울들 안팎으로 확산할 수 있습니다. 특히 접힌 도메인을 가진 단백질이나 상하 임계 용액 온도(UCST/LCST) 유형의 상 분리를 따르는 특히 온도에 민감한 시스템에는 26–30 °C의 겔링 점을 가진 저융 아가로스(LMA)를 사용할 수 있습니다. 표면 패시베이션과 같은 대체 반습윤 접근법은 응축수 부착과 습윤을 줄일 수 있지만, 종종 전문적인 준비가 필요하며 물방울 침전이나 응집을 막지는 못합니다. 반면, 아가로스 임베딩은 응축물을 공간적으로 고정하는 직관적이고 널리 접근 가능한 방법을 제공합니다. 중요하게도, 아가로스는 액상 형성 시 융합된 육종(FUS) 및 기타 RNA 결합 단백질의 구조 상태를 1.0% w/v¹³까지 방해하지 않는 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 관심 있는 여러 상분리 단백질 또는 단백질-RNA 시스템에 대한 일반적 사용에 한가로스 임베딩 방식을 표준화하며, 시약 준비 및 샘플 준비에 대한 단계별 지침을 제공합니다.

프로토콜

1. 아가로스 육즙 준비

중요: 상분리 샘플을 만드는 데 사용되는 동일한 버퍼(이하 '액상 버퍼'라 부름)에서 아가로스 스톡을 준비하여 버퍼 불일치를 방지하세요¹⁴. 예시: 핵캡시드 샘플은 버퍼 A(25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2)에서 준비되며, 이 버퍼는 아가로스 스톡 준비에도 사용되어야 합니다.
참고: 완충 조성, 단백질 농도, 첨가제 사용, 최종 샘플 부피 등 최종 실험 조건은 조사 중인 특정 생물학적 시스템과 특정 후속 적용에 크게 좌우됩니다. 마찬가지로 채취 매개변수, 기기 설정, 데이터 분석은 샘플과 특정 실험에 크게 의존합니다. 예를 들어, SARS-CoV-2 핵캡시드를 poly(A)로 준비하는 과정은 그림 1A (공초점 형광 현미경)에 설명되어 있습니다.

1. 적정량의 LMA 또는 일반 아가로스를 1.5mL 튜브에 액상 완충액을 들어 계량합니다. 예시: 2% w/v 스톡의 경우, 20mg의 아가로스를 1mL의 완충제 A에 녹입니다.
   참고: 최종 아가로스 스톡 농도는 샘플 내 원하는 최종 아가로스 농도에 따라 1–2% w/v여야 합니다. 2% 이상의 w/v는 피펫팅이 점점 어려워지기 때문에 권장되지 않습니다. 피펫 팁의 좁은 끝을 잘라서 피펫팅을 더 쉽게 하세요, 특히 아가로스 함량이 높은 경우에는 더욱 그렇습니다. 샘플에 LMA가 필요한지 일반 아가로스가 필요한지 확인하려면 토론 섹션을 참고하세요.
2. 아가로스 육수를 가열 블록이나 수욕에서 80–90 °C로 가열한 후, 소용돌이로 아가로스를 완전히 녹입니다(약 10분 소요).
   주의: 녹은 아가로스는 뜨겁습니다. 조심해서 다루세요.
3. 아가로스 스톡을 가열 블록이나 수욕에서 37 °C(LMA) 또는 55 °C(일반 아가로스)로 평형으로 만듭니다. 이 온도에서 용액이 투명하고 액체 상태인지 확인하세요. 필요하다면 온도계로 아가로스 육수 온도를 확인하세요.
   잠시 정지: 용융 아가로스 스톡은 30–60분 동안 따뜻하게 유지할 수 있습니다.
   아가로오스를 물욕에서 가열하는 것이 보다 균일한 가열을 보장하고 목표 온도를 충분히 정밀하게 유지하기 위해 강력히 권장됩니다. 특히 LMA 작업 시 매우 중요한데, 온도 차이가 조기 젤화를 유발할 수 있기 때문입니다.
4. 샘플 준비(섹션 2) 후, 남은 아가로스 재고를 +4 °C에서 보관합니다. 위 1.2, 1.3 단계를 따라 사용 전에 아가로스 육수를 다시 녹이고 평형으로 맞추세요.
   참고: 아가로스 재고는 최대 2주간 +4 °C에서 보관하고, 최대 2–3회 고화/녹는 사이클을 거치지 않는 것을 권장합니다. 오염을 방지하기 위해 좋은 제조 관행을 준수하세요. 재고가 재녹이거나 다시 굳지 않거나 눈에 띄는 오염이 발생하면 일찍 버리세요.

2. 샘플 준비

1. 아가로스와 직접 접촉하는 모든 물질(예: 피펫 팁, 튜브, 현미경 슬라이드)을 가열 블록 위나 인큐베이터에 2–3분간 넣어 약 37°C로 예열합니다.
2. 1절에 명시된 대로 아가로스 육수를 준비하세요.
3. 표준 프로토콜에 따라 드롭렛 버퍼, 상 분리 성분(예: 단백질 또는 RNA 스톡), 그리고 기타 첨가제(예: 크라우딩 에이전트, 염료)를 샘플에 준비합니다. 상온(RT)에 평형으로 맞추는 것. 예시: 버퍼 A(25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2), 뉴클레오캡시드 단백질 스톡(60 μM, 버퍼 A), 폴리(A) 스톡(30 μM, 버퍼 A에).
   참고: 광표백(FRAP), 공초점 형광 현미경 또는 확률적 광학 재구성 현미경(STORM) 후 형광 표지 단백질 또는 RNA를 각각 단백질 또는 RNA 스톡에 소량 첨가하세요(권장: 표지 분획 <%).
4. 드롭렛 완충제, 아가로스 스톡, 상 분리 성분(예: 관심 있는 단백질 또는 RNA), 그리고 샘플에 필요한 보조 첨가제(예: 크라우딩 에이전트)의 양을 계산합니다. 예시: 완충제 6 μL, 2% 아가로스 육즙 5 μL (최종 0.5%), 뉴클레오캡시드 단백질 5 μL (최종 15 μM), 폴리(A) 4 μL (최종 6 μM). 최종 용량 20 μL.
   참고: 실험에 사용되는 접시, 튜브, 판 또는 기타 용기에 크게 의존하지만, 일반적으로 사용되는 부피는 3mm NMR 튜브의 경우 150 μL, 6채널 현미경 슬라이드의 현미경 또는 FRAP 실험에 20 μL, 18웰 현미경 슬라이드의 STORM 실험에 대해 20–30 μL입니다(재료표 참조).
   1. 시작 값으로는 표준 생물물리학적 검사에는 최종 0.3–0.5% w/v 아가로스를, 장기 안정화(예: 노화 실험)에는 0.8–1.0% w/v를 사용한다.
      참고: 장기 안정화 및 샘플 저장을 위해서는 샘플 탈수를 방지하는 조치(예: 샘플 용기 밀봉, 가습 챔버 보관, 증발 차단 추가)와 장기간 배양 기간 동안 완충 조성과 pH가 안정적으로 유지되도록 해야 합니다.
   2. NMR 샘플의 경우, 최종 5% v/v D2O를 샘플에 추가하여 고정하세요.
      참고: 다른 모든 성분의 농도와 총 샘플 부피는 특정 적용 및 실험 환경에 크게 좌우됩니다.
5. 해당 부피의 완충제, 상 분리 성분, 아가로스 스톡, 첨가제를 미리 예열된 1.5mL 튜브에 추가합니다.
   참고: 먼저 완충제와 아가로스를 추가하고, 그 다음에 보조 첨가물을 넣을 것을 권장합니다. 또한 상분리 성분을 마지막에 추가하여 응축수 형성을 촉진할 것을 권장합니다. 하지만 최적의 혼합 순서는 시스템에 따라 다르며 사전에 결정해야 합니다. 이는 화학양론과 덧셈 차수가 방울 크기나 구획화에 큰 영향을 미치는 시스템에서 특히 중요합니다. 예시: 핵캡시드 샘플의 혼합 순서는 2.4단계에서 언급한 부피를 사용하여 첫 번째 완충 A, 두 번째는 아가로스 스톡, 세 번째는 뉴클레오캡시드 단백질, 마지막 폴리(A)입니다. 이 샘플에서 LLPS는 poly(A) 첨가에 의해 트리거됩니다. LLPS가 가시적 탁도를 생성하는 시스템의 경우, 탁도는 질적 품질 관리 지표로 작용할 수 있습니다; 하지만 시작 시간과 가시성은 시스템에 따라 다르며, 즉각적인 탁도가 없다고 해서 프로토콜 실패를 의미하지는 않습니다.
   1. 튜브를 가열 블록이나 수욕에 넣고 피펫팅을 몇 번 올리고 내리세요. 기포 유입을 피하세요.
      참고: 아가로스가 아직 액체일 때는 방울이 융합될 수 있습니다. 따라서 겔레이션을 시작하기 전에 가열 블록이나 수조에서 사전 인큐베이션 시간을 조절하는 것은 다양한 크기의 방울을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 아가로스가 없는 상태에서 인베이브 전 시간 간격을 선택하기 전에 방울 성장 동역학을 특성화하면, 연구자들은 특정 방울 크기 범위를 재현적으로 표적으로 표적할 수 있습니다.
6. 현미경 / FRAP 샘플의 경우:
   1. 일반 피펫을 사용해 샘플을 선택한 현미경 슬라이드(예: 커버슬립 하단이 있는 채널 현미경 슬라이드)로 빠르게 옮기세요.
   2. RT에서 5–10분 정도 겔레이션을 허용하세요(토론 섹션 참고).
      참고: 이 기간 동안 현미경 슬라이드를 움직이지 마십시오. 형광 샘플을 빛으로부터 보호하세요.
   3. 표준 프로토콜에 따라 샘플을 측정하세요. 예시: 회전 디스크 공초점 현미경, 100x 1.45 평면 apo 오일 대물렌즈, Cy3 염료 시 여기 파장 561 nm, 30% 레이저 출력(Cy3)에서 100 ms, 밝은 시야에서 50 ms 획득. FRAP의 경우: 방울 지^{름의 1} /10 부위에 표백 영역을 중앙에 배치하고, 표백 전 25프레임(지연 없이 획득), 표백 후 60프레임(1초 간격으로 촬영), 표백 후 15ms 레이저 펄스, 70% 레이저 출력. 오픈 액세스 소프트웨어에서 전면 정규화를 통한 FRAP 복구를 분석합니다; 피팅이 수행될 때만 운동 피팅 매개변수를 보고하세요.
7. STORM 샘플에 대해:
   1. 일반 피펫을 사용해 샘플을 선택한 STORM 슬라이드(예: 커버슬립 하단의 18웰 챔버 슬라이드)로 빠르게 옮기세요. 샘플을 한 방울씩 분배하세요.
   2. RT에서 5–10분 정도 겔레이션을 허용하세요(토론 섹션 참고).
      참고: 이 기간 동안 현미경 슬라이드를 움직이지 마십시오. 형광 샘플을 빛으로부터 보호하세요.
   3. STORM 버퍼로 유정 전체를 채우세요. 표준 절차에 따라 우물을 밀봉하세요.
   4. 측정 전 최소 1–2시간 동안 샘플을 평형으로 유지하여 STORM 버퍼가 아가로스 하이드로겔로 확산되도록 하세요.
      참고: STORM 버퍼의 성공적인 확산 여부는 STORM 채취 중 형광 염료가 깜빡이면 쉽게 확인할 수 있습니다. 시료 사양에 따라 더 긴 평형 시간이 필요할 수 있습니다.
   5. 표준 프로토콜에 따라 샘플을 측정하세요. 예시: Ti2 역현미경, SR 아포크로맷 TIRF 100x 1.49 오일 대물렌즈, 고경사 얇은 조명. 샘플당 20,000프레임 획득, 시야각 64 x 64 픽셀, Cy5 염료용 125 mW 647 nm 레이저로 10ms 노출, 그리고 장기 암흑 상태에서 바닥 상태로 전환을 돕기 위해 20 mW 405 nm 레이저를 사용했습니다. 이미지는 다중 방출기 적합을 이용한 최대우도 추정을 사용하여 처리되었습니다. 드리프트 보정이 적용되었으며, 최종 시각화에는 25 nm 이상의 위치 정밀도를 가진 데이터 포인트만 포함되었습니다. 최종 이미지는 평균 시프트 히스토그램 방법을 사용하여 20배 배율(최종 이미지에서 1픽셀 = 8 nm)으로 생성됩니다.
8. NMR 샘플의 경우:
   1. 길고 얇은 유리 피펫(예열된 것)을 사용해 샘플을 NMR 튜브로 빠르게 옮기세요. 샘플을 튜브 바닥에 분사하세요.
   2. RT에서 5–10분 정도 겔레이션을 허용하세요(토론 섹션 참고).
      참고: 이 기간 동안 NMR 튜브를 흔들지 마십시오.
   3. 표준 프로토콜에 따라 샘플을 측정하세요. 예시: PATXI 상온 프로브, 3mm 튜브, 25°C에서 획득, 확산(DOSY) 실험용 표준 펄스 시퀀스(stebpgp1s19)를 사용한 NMR 750 MHz 전장 세기, 매개변수: 4,096점, 32회 스캔, 경배 강도 2–95%, 확산 시간 0.08초, 구배 펄스 12 ms, 이완 지연(d1) 5초.

결과

이 프로토콜은 FUS N-말단 도메인(FUS NTD)이나 SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질에 의해 형성된 응축액에 적용되었으며, poly(A) 또는 s2m RNA가 단백질 단독 및 단백질-RNA 방울의 대표적인 예로 사용되었습니다. 시험 조건에서 아가로스가 응축수 형성에 영향을 미치는지 평가하기 위해, 0.5% w/v LMA의 존재 및 부재 상태에서 N 단백질과 poly(A)로 방울을 형성하였습니다. LMA는 RT에서 약 5분 후에 굳어지므로, 이 시점에 형광 현미경 이미지를 기록했고, 두 경우 모두 비방울 크기가 거의 동일하다는 것을 관찰했습니다(그림 1A,B). 아가로스가 방울의 습윤과 융합에 미치는 예방 효과를 입증하기 위해, 샘플 준비 60분 후 또 다른 이미지 세트를 기록했습니다. 아가로스 내재 방울의 크기는 변하지 않았으나, LMA가 없는 응축액은 융합과 표면 습윤으로 인해 크기가 급격히 증가했습니다(그림 1A,B). 핵생성 후 비교적 일찍 비방울을 삽입했지만, 임베딩 전 배양 시간을 조절하여 다양한 크기의 방울을 삽입할 수 있습니다. 방울을 아가로스 하이드로겔에 삽입했음에도 불구하고, 측정된 응축수 역학은 눈에 띄게 변화하지 않았습니다. FRAP 회수와 따라서 겉보기 액상 확산은 샘플 내 LMA가 있을 때와 없을 때 매우 유사했습니다(그림 1C). 더욱이, FUS NTD 응축액을 이용한 이전 확산 순서 NMR 분광법(DOSY) 실험에서는 확산 속도가 아가로스 농도에 의해 최소 0.25–1% w/v 범위 내에서 감지되지 않음이 나타났습니다(그림 1D)(Emmanouilidis et ^al.13에서 발췌). 이 결과들은 아가로스 하이드로겔이 상에 따라 분리된 응축액을 공간과 시간 내에서 포획하는 데 적합하며, 장기간에 걸쳐 반복 측정이 가능함을 보여줍니다.

현미경과 FRAP 측정 모두 기록이 비교적 빠르지만(몇 초에서 몇 분), 일부 실험은 획득하는 데 몇 분(예: STORM, 1D ¹H NMR) 또는 심지어 몇 시간(예: 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR)이 필요합니다. 이러한 실험에서는 방울이 획득 과정 내내 정지되어 있고 시간이 지나면서 침전되지 않는 것이 매우 중요합니다. 여기서는 LMA 내에서 N 단백질 + s2m RNA 방적을 충분히 안정화하여 STORM 이미지를 획득했음을 보여줍니다(그림 1E). 더불어, 아가로스가 존재하거나 없는 FUS NTD 방울의 NMR 스펙트럼은 선폭이 유사하여, 이러한 조건에서 아가로스 하이드로겔과 단백질 간에 검출 가능한 상호작용이 없음을 시사한다(그림 1F)(Emmanouilidis et ^al.13에서 각색). 반면, 아가로스 내재 응축액의 스펙트럼은 더 높은 신호 강도를 보였는데, 이는 획득 중 NMR 튜브에 안정화되지 않은 비방울이 침전되어 더 이상 측정이 불가능했기 때문일 가능성이 높다(그림 1F)(Emmanouilidis et ^al.13에서 발췌). 결론적으로, 아가로스 하이드로겔 내 응축액의 안정화는 시간 실험을 가능하게 할 뿐만 아니라, 측정된 방울 특성을 보존하면서도 획득 시간이 연장된 방법론을 사용할 수 있게 합니다.

그림 1: 아가로스 임베딩에 의한 응축수 안정화가 측정된 방울 특성을 감지하지 않고 안정화됨. (A) 15 μM 뉴클레오캡시드 단백질의 형광 현미경 검사로, 완충기 A(25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2)에서 6 μM Cy3-poly(표지 포함) 및 완충기 A(25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7.2)를 0.5% w/v LMA에서 수행하였다. 이미지는 혼합/아가로스 임베딩 후 5분 또는 60분 후에 촬영되었습니다. 이미지는 n=2개의 독립 실험에서 획득한 7장의 이미지를 대표합니다. 스케일 바 = 5 μm. (B) (A)에 표시된 응축액의 물방울 반경 정량화. 데이터는 박스플롯(box = 4분위 범위, 중심선 = 중앙값, whiskers = 남은 데이터의 범위, 점 = 이상치)로 표시됩니다. 각 조건에서 평균 반경± 표준편차(sd)와 분석된 방울 수가 그래프에 직접 표시됩니다. 데이터는 정규 분포를 따릅니다. 개별 비말은 통계적 추론을 위해 독립적인 생물학적 복제체로 취급하지 않았습니다. 통계적 검정은 수행되지 않았으며; 분포는 기술적으로 표시됩니다. (C) (A)에 표시된 5분 시점의 방울의 FRAP. 광표백은 561nm 레이저(Cy3)를 사용해 수행되었습니다. 데이터는 표백 신호를 표백 전 값, 동일 샘플의 표백되지 않은 영역, 배경 형광으로 정규화하여 얻은 표준화된 강도±(평균 SD = 3회 독립 복제)를 보여줍니다. (D) 완충 B(30 mM HEPES, 200 mM KCl, 600 mM 요소, pH 7.3) 내 감쇠되지 않은 DOSY 신호가 0.25, 0.5 또는 1.0% w/v 일반 아가로스 존재 상태에서 발생함. N = 1. (E) 15 μM Cy5-뉴클레오캡시드 단백질(표지 5%)과 6 μM 바이러스 s2m RNA를 0.5% w/v LMA를 포함한 완충 A에서 STORM 영상을 공초점 형광 현미경 및 STORM 이미지. n=3개의 독립적인 실험을 대표합니다. 두 이미지 모두에서 스케일 바 = 1 μm. (F) 1D ¹H NMR 스펙트럼(왼쪽) 및 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR 스펙트럼(오른쪽)은 완충 B 내 200 μM FUS NTD, 0.5% w/v 일반 아가로스의 존재 여부 하에 사용됨. N = 1. 패널 (D)와 (F)는 Emmanouilidis 등에서 재현한 것입니다. ¹³ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

생체분자 응축액의 아가로스 임베딩의 성공은 여러 요인에 의존합니다. 첫째, 아가로스는 조기 겔화를 방지할 수 있을 만큼 충분히 높은 온도를 유지해야 하며, 동시에 생체 분자 구조나 상호작용을 방해하지 않을 정도로 낮은 온도여야 합니다. 저융 아가로스는 겔링 포인트 26–30 °C, 녹는점 60–65 °C이며, 일반 아가로스는 겔링 포인트 34–38 °C, 녹는점 90–95 °C를 가집니다. 둘째, 빠른 혼합과 최종 반응 용기(예: NMR 튜브)로의 이동이 매우 중요한데, 타이밍이나 온도의 작은 차이가 임베딩을 불균일하게 하여 재현성을 저하시킬 수 있기 때문입니다.

이러한 중요한 점들에도 불구하고, 이 방법은 다양한 실험적 필요에 쉽게 적응할 수 있습니다. 본질적으로 무질서한 단백질을 가진 상 분리 시스템이나 열 변성에 취약하지 않은 시스템에서는 비용 절감을 위해 LMA 대신 일반 아가로스를 사용할 수 있습니다. 접힌 도메인을 가진 단백질이나 열 변성에 취약한 다른 온도에 민감한 (생체)분자를 만들 때는 변성을 방지하기 위해 LMA를 사용해야 합니다. 열만/무아가로스 대조 샘플을 준비하여 아가로스 임베딩의 영향과 일시적 샘플 가열의 효과를 분리할 수 있습니다. 이러한 온도 의존적 변성 효과를 줄이기 위해, 저융 아가로스는 특히 온도에 민감한 샘플에 적합하며, 아가로스 농도는 메쉬 크기와 기계적 가두리 정도를 조절할 수 있습니다. 최근 개발된 LLPS REDIFINE^15,16과 같은 고민도 확산 측정에서는 침전을 방지하는 가장 낮은 아가로스 농도가 일반적으로 권장되며, 보통 0.3–0.5% w/v가 권장됩니다. 몇 주에서 몇 달간의 안정성이 필요한 성숙 실험의 경우, 0.8–1% w/v가 바람직합니다. 이 매개변수들은 응축수 형태나 역학을 감지 없이 효과적으로 안정화하도록 최적화되어야 하며, 항상 특정 시스템에 맞게 조정되어야 합니다. 이 검증은 아가로스 임베딩이 있는 샘플과 없는 샘플(그리고 동일한 조건)을 비교하거나, 농도에 따른 메쉬 효과를 배제하기 위해 다양한 아가로스 농도를 비교하는 것을 요구합니다. 예를 들어, 현미경을 이용해 방울 형태를 평가하고, FRAP을 이용해 확산을 평가하며, 또는 연구자에게 중요한 방울 특성을 평가하는 다른 방법을 사용하는 방법이 있습니다.

겔화 시간도 중요한 고려사항입니다. 아가로스가 굳어지는 데 걸리는 시간은 완충 종류, pH, 최종 아가로스 농도, 시작 온도, 저융 아가로스 또는 일반 아가로스 사용 여부 등 여러 요인에 따라 달라집니다. 일반적으로 아가로스는 5분에서 10분 이내에 굳어집니다. 아가로스 스톡의 겔화 상태는 샘플의 젤화 상태를 나타내는 지표로 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 아가로스 임베딩(agarose embeding) 전 배큐 시간을 변화시키면 다양한 방울 크기의 재현 가능한 특성 분석을 가능하게 합니다. 완충 선택^{도 매우 중요합니다}. 아가로스 스톡은 샘플 준비에 사용된 버퍼에서 반드시 버퍼 불일치를 방지하는 데 필수적입니다. 버퍼는 시스템이 위상 분리되는 것으로 알려진 곳이어야 합니다.

각 시스템마다 온도 민감도를 고려해야 합니다. 많은 상 분리 시스템은 UCST/LCST 유형 LLPS로 알려진 열가역적 위상 거동을 보입니다. 따라서 아가로스 혼합 중 약간 높은 온도에 잠시 노출되어도 상의 동작이나 측정된 방울 특성에 영향을 주지 않도록 검증해야 합니다. 문제가 발생하면 보통 온도 조건을 정제하거나 취급 시간을 최소화하거나 아가로스 농도를 조정함으로써 해결할 수 있습니다. 예를 들어, LMA 비료는 이상적으로 37 °C로 가열되지만, LMA 비료는 33–35 °C에서도 액체 상태를 유지합니다.

문제 해결은 샘플과 실험 환경에 따라 다양한 고장 모드가 발생할 수 있기 때문에 중요합니다. 방울이 아가로스와 섞일 때 용해되는 경우, 이는 LMA가 너무 따뜻하거나 버퍼 불일치 때문일 수 있습니다. 이 경우 LMA 재고는 목표 온도보다 정확히 또는 몇 도 낮은 온도로 유지하고, 관심 단백질/RNA와 동일한 완충지에서 준비해야 합니다. 피펫 팁에서 조기 겔화가 발생하면, LMA가 너무 차갑거나 팁이 미리 예열되지 않아서 그런 경우가 많습니다. 이를 방지하기 위해 팁과 튜브는 37°C로 예열되어야 하며, 작업자는 신속하게 작업해야 하며, 가열 블록은 목표 온도에 유지되어야 합니다. 시간이 지남에 따라 습윤, 응집, 침전이 발생한다면, 젤이 너무 드물거나 젤화가 고르지 않기 때문일 수 있습니다. 이 경우 LMA 농도를 높일 수 있으며, 상온에서도 균일하게 겔화되어야 합니다. 아가로스 용액에 가시성 입자가 포함되어 있다면, 아가로스 용해가 불완전하기 때문일 수 있습니다. 이 경우 아가로스는 완전히 투명할 때까지 가열한 후 사용(예: 소용돌이 현상)하여 충분히 혼합해야 합니다. 혼합 또는 피펫팅 중에 기포가 발생하면 영상에 방해가 되고 응축수 분포가 고르지 않을 수 있습니다. 기포 형성을 최소화하기 위해 용액은 천천히 피펫팅으로 위아래로 부드럽게 섞어야 합니다. 이질적인 겔화나 고르지 않은 응축수 분포가 관찰된다면, 이는 젤화 과정에서 혼합 부족이나 국부적인 온도 구배 때문일 수 있습니다. 이 경우 샘플은 모든 성분을 첨가하고 즉시 부드럽게 혼합한 후 균일한 온도 조건에서 고체화될 때까지 가열 블록(또는 수욕)에 보관해야 합니다. 가파른 온도 구배는 피해야 하며; 상온에서 굳히는 것이 권장되며(냉장고 내 고체화는 피해야 합니다). 장기 실험에서 샘플 증발은 용질 농도와 응축수 특성을 변화시킬 수 있습니다. 증발을 최소화하기 위해 샘플은 적절히 밀봉하고 가능한 한 습도 조절 환경에서 보관해야 합니다.

파라포름알데히드 고정과 같은 방법과 달리, 아가로스 임베딩은 시료를 화학적으로 고정하지 않습니다. 따라서 응축수는 동적 상태를 유지하여 기능 연구에 유리하지만 장기 저장을 제한합니다. 장기간 실험 기간을 위해서는 증발과 pH 변화 등 완충 변화를 방지하기 위한 예방 조치가 필요합니다. 또한, 아가로스는 일반적으로 이 분석에서 상호작용이 적지만, 확산이나 국소 환경에 미치는 잠재적 간접 효과도 고려해야 합니다. 아가로스-생체분자 상호작용, 예를 들어 단백질이 아가로스에 비특이적으로 결합하는 것이 의심된다면, 메쉬 크기와 다공성을 맞는 광가교결합 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트(PEG-DA)와 같은 대체 하이드로겔 매트릭스를 고려할 수 있습니다. 상호작용의 부재는 매트릭스의 유무 여부에서 FRAP을 측정하여 검증해야 합니다.

화학적 고정 외에도, BSA, PEG, 계면활성제 코팅 표면과 지지 지질 이중층과 같은 표면 패시베이션 전략이 응축액 부착과 습윤을 줄이기 위해 일반적으로 사용됩니다. 이러한 접근법은 표면 상호작용을 효과적으로 최소화하지만, 응축수의 이동, 퇴적, 융합을 막지는 못합니다. 따라서 아가로스 임베딩은 응축수 역학을 유지하면서 물리적 고정성을 제공함으로써 이러한 방법을 보완하여, 장시간 실험, 3차원 영상 촬영, 안정적인 샘플 위치가 필요한 정량적 측정에 특히 유용합니다. 따라서 방법의 선택은 실험적 목적에 따라 결정되어야 합니다.

전반적으로 아가로스 하이드로겔은 3차원에서 응축수를 안정화하는 간단하면서도 효과적인 방법을 제공합니다. 이로 인해 액적 습윤과 융합이 발생하면서도 대표적인 시스템에서 측정된 내재적 특성을 탐지적으로 방해하지 않으며, NMR 분광법¹⁵와 같이 긴 획득 시간이 필요한 시간 실험과 기법을 가능하게 합니다. 이 방법은 여러 이유로 모든 상 분리 시스템에 적합하지 않을 수 있지만, 여기서 제시된 방법은 여러 생체분자 응축액 연구에 적용 가능하며 특히 신경퇴행성 질환 메커니즘과 관련된 성숙 과정을 조사하는 데 유용할 수^{있습니다.}

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 튜브	브랜드는 상관 없음	N/A
18웰 챔버 슬라이드	ibidi	81816	STORM용
아가로스, 저 젤링 온도	Sigma-Aldrich	A9414	분자 생물학 등급
아가로스, 초순수	Invitrogen	16500500
채널 슬라이드	ibidi	80606	현미경용
공초점 현미경	Nikon	N/A
Cy5-염료, NHS 화학	Jena Biosciences	FP-201-CY5	단백질 표지용
D2O (중수)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM 버퍼	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD 단백질	N/A	N/A	ref 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)에 설명된 대로 우리 연구실에서 재조합 발현됨
가열 블록 또는 수조	브랜드는 상관 없음	N/A	어떤 제조사나 모델이든 무방
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
이미지 분석 소프트웨어	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NMR 분광계	Bruker	N/A	750 MHz, PATXI 상온 프로브, 더 많은 세부 사항은 ref 13을 참조하세요 (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
NMR 튜브	Bruker	N/A	3 mm, 유리
P10, P20, P200 및 P1000 파이펫	브랜드는 상관 없음	N/A
pCp-Cy3-염료	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	RNA 표지용
poly(A) RNA	N/A	N/A	우리 연구실에서 자체 제작된 체외 전사, 길이 약 50 뉴클레오티드, Kathe et al. Mol Biol Cell 2024에 설명됨
s2m RNA	N/A	N/A	우리 연구실에서 자체 제작된 체외 전사, 길이 45 뉴클레오티드, 시퀀스: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', Kathe et al. Mol Biol Cell 2024에 설명됨
SARS-CoV-2 핵심 단백질	N/A	N/A	Kathe et al. Mol Biol Cell 2024에 설명된 대로 우리 연구실에서 재조합 발현됨
플로팅 소프트웨어(예: R)	R-Project	버전 4.2.1	https://www.r-project.org/
STORM 현미경	Nikon N-STORM	N/A
ThunderSTORM 플러그인	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
사용된 파이펫의 팁	브랜드는 상관 없음	N/A
TopSpin	Bruker	버전 3.2 및 4.1
우레아	Sigma-Aldrich	U5128

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