방법 논문

Aedes albopictus의 해부 및 해부 후 조직에서의 총 RNA 추출

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DOI:

10.3791/72811

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2026년 10월 30일

 ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 3National Health Commission Key Laboratory on Parasitic Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasites and Vector Control Technology, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 프로토콜에서는 모기 매개 바이러스 전파 연구에서 벡터 조직의 분자적 특성 분석을 위해 Aedes albopictus의 중장, 난소 및 타액선을 적출하고 총 RNA를 추출하는 방법을 제시합니다.

초록

2025년 7월, 중국 광둥성 포산시에서 뎅기열과 치쿤구니야 열의 발생이 보고되었습니다. Ae. albopictus는 이러한 바이러스의 주요 매개체입니다. 본 프로토콜은 Ae. albopictus의 중장, 타액선 및 난소를 해부하고 해부된 조직에서 총 RNA를 추출하는 간단하고 표준화된 방법을 설명합니다. 흡혈하지 않은 3일 된 암컷 모기를 −20 °C에서 2분 동안 냉동시켜 마취시킨 후, 표적 조직을 해부하였습니다. 총 RNA는 조직 RNA 추출 키트로 추출하고 마이크로볼륨 분광광도계로 정량하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석에 사용하였습니다. 결과에 따르면, 본 해부 방법은 조직을 신속하고 완전하게 분리하며, 분리된 조직에서 추출한 RNA는 상대적으로 높은 순도를 얻을 수 있음을 보여줍니다. RT-qPCR을 통해 세 가지 참조 유전자(GAPDH, β-actin, RPS6)의 발현 양상과 상대적 안정성을 입증하였습니다. 이 방법은 간단하고 검증되었으며, Ae. albopictus 관련 연구에 표준화된 기술적 지원을 제공합니다.

서론

Aedes albopictus (Ae. albopictus)는 뎅기 바이러스(DENV) 및 치쿤구니야 바이러스(CHIKV)를 포함한 여러 병원체의 매개체입니다1,2,3. 이 종은 광범위하게 분포하며 많은 지역에서 모기 매개 질환의 발생 원인이 되었습니다4,5. 매개체 역량이라 알려진 Ae. albopictus의 병원체 전파 능력은 개체군마다 다르며, 중장, 난소 및 타액선의 특정 유전자 발현과 연관되어 있습니다6. 이러한 조직의 구조를 이해하고 고품질의 RNA를 추출하는 것은 매개체 전파 바이러스의 복제, 확산 및 전파를 이해하는 데 매우 중요합니다7.

정량적 실시간 PCR(RT-qPCR)을 이용한 상대적 유전자 발현 검출은 Ae. albopictus 조직의 정밀한 해부와 고품질 RNA 추출에 달려 있습니다8,9. 현재까지 중장, 난소 및 타액선의 해부에 대해 발표된 비디오 프로토콜은 주로 Aedes aegypti에 집중되어 왔습니다10. 따라서 본 프로토콜에서는 Ae. albopictus의 중장, 난소 및 타액선 해부 방법을 시연하며, 이때 해부된 조직을 RNA 보존액이 들어 있는 분쇄 튜브에 직접 넣어 조직 전이 단계를 생략하고 전이 손실을 최소화합니다. 총 RNA는 컬럼 기반 방법을 사용하여 해부된 조직에서 추출하며, 이는 기존의 TRIzol 방법보다 조작 단계가 적고 시간이 덜 소요됩니다11. 이러한 추출법을 통해 일반적으로 Ae. albopictus 5마리의 타액선에서 0.1–0.3 µg의 총 RNA가 얻어지며, A260/A280 비율은 1.8–2.0으로 후속 RT-qPCR에 필요한 순도 요건을 충족합니다. RT-qPCR을 수행하여 Ae. albopictus 조직 전반에 걸친 세 가지 참조 유전자의 발현을 측정함으로써, 각 조직에서 추출된 RNA의 품질을 평가합니다.

본 프로토콜은 혈액을 섭취하지 않은 3일령 암컷 Ae. albopictus의 중장, 난소 및 타액선에 대해서만 검증되었으며, 지방체에서의 RNA 추출에는 적합하지 않음을 유의해야 합니다. 손상되지 않은 개별 조직을 얻는 것은 후속 분석의 기초가 됩니다. Ae. albopictus 조직의 체계적인 해부와 고순도 RNA 추출을 통해, 본 프로토콜은 향후 유전자 발현 검출, 집단 수준의 매개체 능력 평가 및 아르보바이러스 전파 제어를 위한 기술적 지원을 제공합니다.

프로토콜

본 연구에서는 실험실에서 사육한  Ae. albopictus 모기만을 사용하였습니다. 이에 따라 본 연구에 대한 기관의 윤리적 승인은 필요하지 않았습니다. 본 실험에 사용된  Ae. albopictus 계통은 중국 국가위생건강위원회 기생충 질환 통제 및 예방 핵심 실험실(Jiangsu)에서 제공받았습니다. 해당 콜로니는 원래 1980년대에 Wuxi 시에서 수집되었으며,  Jiangsu Institute of Parasitic Diseases 의 곤충 사육실에서 표준 조건하에 유지되었습니다. 모기 콜로니는 25 °C ± 1 °C의 온도, 75% ± 5%의 상대 습도, 10시간 명기 및 14시간 암기로 구성된 광주기 조건의 인공 기후실에서 사육되었습니다. 유충은 초순수에서 사육되었으며 돼지 간 분말과 효모 추출물(Shanghai Brewery)을 2:1 비율로 혼합하여 급이하였습니다. 성충 모기는 5% 포도당 용액으로 유지되었습니다. 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 기재되어 있습니다.

1. 재료 준비

  1. 용액 준비
    1. 1x PBS 버퍼 준비: NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4 0.24 g을 정량한다. 교반하며 800 mL의 초순수(ultrapure water)에 용해시킨다. pH를 7.4로 조정한다. 최종 부피를 1 L로 맞춘다. 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브 멸균한다.
    2. DEPC 용액 준비: 1 L의 초순수에 DEPC 스탁 용액 1 mL를 첨가한다. 마그네틱 스터러를 사용하여 12–16시간 동안 강하게 교반한다. 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브 멸균한다.
      주의: DEPC는 독성과 발암성이 매우 높다. 장갑과 보안경을 착용하고 흄 후드 내에서 취급한다.
      참고: 강하게 교반하는 동안 비커를 알루미늄 호일로 덮는다. DEPC 용액을 소분하여 -20 °C에서 최대 6개월 동안 보관한다.
  2. 소모품 준비
    1. 해부 도구 멸균: 1 mm 해부용 바늘과 미세 핀셋을 알루미늄 용기에 넣고 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브 멸균한다.
    2. 0.5–1.0 mm 실리카 비드가 들어있는 2 mL 분쇄 튜브를 준비한다. 알루미늄 용기에 넣고 121 °C에서 20분 동안 오토클레이브 멸균한다.
    3. 각 분쇄 튜브에 키트에 제공된 RNA 보존 용액 200 µL를 첨가한다.
      참고: 조직 내 RNA 품질은 생체에서 제거한 후 1분 이내에 급격히 저하된다. 보존 용액이 담긴 분쇄 튜브를 미리 준비해 둔다.

2. Ae. albopictus 수집

참고: 흰색 실험복과 장갑을 착용하십시오. 어두운 색상은 모기에게 유인될 수 있으므로 어두운 색의 옷은 착용하지 마십시오.

  1. Ae. albopictus의 탈출을 방지하기 위해 모기 케이지가 있는 방의 모든 문, 창문 및 환기 시스템을 닫습니다.
  2. 전기 흡입기를 켜고 모기 케이지 안에 넣습니다. 케이지 내벽에 앉아 있는 Ae. albopictus 쪽으로 흡입기를 향하게 하여 모기를 수집합니다.
  3. 흡입기를 작동시킨 상태에서 천천히 케이지 밖으로 꺼냅니다. 즉시 케이지를 밀봉하고 흡입기의 뚜껑을 닫습니다.
  4. 수집 챔버를 분리하여 -20 °C에서 2분 동안 보관함으로써 Ae. albopictus를 저온 마취시킵니다.
  5. 사전 냉각을 위해 10 cm 유리 접시를 얼음 위에 올려둡니다. 마취된 Ae. albopictus를 수집 챔버에서 유리 접시로 옮깁니다.
    참고: 조직 손상을 방지하기 위해 저온 마취 시간을 엄격히 조절하십시오.

3. 해부 전 암컷 Ae. albopictus의 식별

  1. 유리 접시에서 형태학적으로 온전하고 저온 마취된 Ae. albopictus를 선택하여 유리 슬라이드로 옮깁니다. 실체 현미경을 사용하여 80배 배율로 관찰합니다.
  2. 중흉배판(mesonotum)의 흰색 세로줄을 확인합니다.
  3. 부절(tarsal segments) 기부와 제2-6 복배판(abdominal tergites II-VI) 기부의 흰색 띠를 확인합니다12.
  4. 80배 배율로 촉각을 관찰합니다. 실모양 촉각(암컷)과 깃털모양 촉각(수컷)을 구분하여 암컷을 식별합니다.

4. Ae. albopictus의 복부 해부

  1. 멸균된 유리 슬라이드 위에 멸균된 1x PBS 세 방울을 왼쪽에서 오른쪽으로 떨어뜨립니다. 각 방울의 부피는 약 20 µL로 하며, 방울 간의 간격은 약 5 mm가 되도록 합니다.
    참고: PBS 방울은 Ae. albopictus 전체가 잠길 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다.
  2. 미세 핀셋을 사용하여 Ae. albopictus의 날개를 잡고, 모기를 가장 왼쪽의 PBS 방울 위에 놓습니다.
  3. Ae. albopictus의 복측(ventral side)이 위를 향하도록 배치합니다. 왼손으로 해부침을 잡고 두 번째 복부 마디를 눌러 Ae. albopictus를 고정합니다.
  4. 오른손을 사용하여 여섯 번째 복부 마디의 중앙 지점에 1 mm 해부침을 삽입합니다. 가로 방향으로 반원형 절개를 하여 복강을 엽니다.
  5. 오른손에 쥔 해부침을 후방으로 약 2 mm 이동시킨 후, 복부 마디 VI–VIII의 중앙 부위를 눌러 복부를 고정합니다.
    참고: 난소는 복부 마디 II-VI의 배측(dorsally)에 위치합니다. 난소의 온전한 형태가 손상되지 않도록 마디 VI-VIII를 누를 때 바늘을 무작위로 움직이지 마십시오.
  6. 왼손으로 해부침을 이용해 두 번째 복부 마디를 잡고, 바깥쪽으로 살짝 당겨 여섯 번째 마디에서 복부를 분리합니다. 분리 과정에서 전장, 중장 및 말피기관(Malpighian tubules)이 완전히 노출됩니다.
    참고: 말피기관은 흰색의 가느다란 형태이며, 중장은 반투명한 방추형입니다.
  7. 중장을 전장 및 후장에서 분리합니다. 중앙의 PBS 방울에서 중장을 두 번 헹굽니다.
  8. 상용 RNA 추출 키트에 제공된 RNA 보존 용액 200 µL가 들어 있는 분쇄 튜브로 중장을 옮깁니다.
  9. 해부침으로 여덟 번째 복부 마디의 중앙을 눌러 양측의 쌍을 이룬 난소를 노출시킵니다. 난소를 제거하여 중앙의 PBS 방울에서 두 번 헹군 후, RNA 보존 용액 200 µL가 들어 있는 분쇄 튜브로 옮깁니다.
    참고: 쌍을 이룬 난소는 대칭적인 쌀알 모양의 유백색입니다. 회수 과정에서 난소의 구조적 무결성이 유지되도록 주의해서 다루십시오.

5. Ae. albopictus의 침샘 해부

  1. 현미경 배율을 400배로 높이십시오. 복부가 절개된 샘플을 옮기십시오. *Ae. albopictus* 가장 오른쪽에 있는 PBS 방울로.
  2. 왼손의 해부용 바늘로 중가슴을 부드럽게 눌러 머리가 약간 들릴 때까지 압력을 가합니다.
  3. 오른손으로 박리침을 사용하여 경부 쪽의 머리를 들어 올린 후 천천히 바깥쪽으로 당깁니다. 머리와 함께 흉부에서 분리되는 침샘(삼엽 구조)을 관찰하십시오.
    참고: 침샘은 전흉부에 위치하며 머리와 연결되어 있다. ~을 통해 타액관입니다. 흉부에 일정한 압력을 가하면 타액관의 파열을 방지할 수 있으며, 타액선이 머리와 함께 흉부에서 손상 없이 분리되도록 할 수 있습니다. 이 단계에서 힘을 조절하기 위해서는 반복적인 연습이 필요합니다.
  4. 머리에서 타액선을 분리하십시오. 중앙의 PBS 방울에서 두 번 헹군 후, 준비된 분쇄 튜브로 옮기십시오.
    참고: 침샘의 크기는 약 1mm입니다. 이를 다음이 포함된 분쇄 튜브로 옮깁니다. 200 µL RNA 보존 용액에 넣고 백색광원에 비추어 용액 속에 떠다니는 작은 흰색 입자의 존재를 확인합니다.

6. Ae. albopictus 및 그 타액선, 난소, 중장의 RNA 추출

참고: 모든 RNA 추출 단계는 상용 조직 RNA 추출 키트 제조사의 지침에 따라 수정 없이 수행되었습니다.

  1. 조직 분쇄기를 4 °C로 사전 냉각합니다. 파라미터를 30 Hz, 분쇄 시간 30 s, 10 사이클, 일시 정지 시간 8 s로 설정합니다.
  2. 조직 샘플이 담긴 분쇄 튜브를 분쇄기에 넣고 프로그램을 실행합니다.
    참고: 분쇄 후, 조직이 RNA 보존 용액에 완전히 분산되었는지 확인합니다. 분쇄가 불완전한 경우, 5 사이클을 추가로 실행합니다.
  3. 균질액을 멸균된 1.5 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 4 °C에서 12,000 x g로 5분 동안 원심 분리합니다.
  4. 상층액을 새로운 멸균 1.5 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 클로로포름 30 µL를 추가합니다.
    주의: 클로로포름은 독성 및 발암성 물질입니다. 장갑과 보호 안경을 착용하고 흄 후드 내에서 취급하십시오.
  5. 20초 동안 강하게 볼텍싱합니다. 실온에서 15분 동안 배양한 후, 4 °C에서 12,000 x g 로 15분 동안 원심 분리합니다.
    참고: 단백질 오염을 방지하기 위해 중간의 흰색 층을 피하여 상층의 수성상을 조심스럽게 흡입합니다.
  6. 상층의 수성상을 새로운 멸균 1.5 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 이소프로판올 75 µL를 추가합니다.
  7. 인버전 믹싱으로 혼합한 후, 전체 혼합물을 실리카 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 12,000 x g로 1분 동안 원심 분리합니다.
  8. 컬럼에 세척 버퍼 600 µL를 추가합니다. 12,000 x g로 30초 동안 원심 분리합니다. 통과액은 버립니다.
  9. 컬럼에 80% 에탄올 600 µL를 추가합니다. 12,000 x g로 30초 동안 원심 분리합니다. 통과액은 버립니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복하여 총 두 번 세척합니다.
  10. 컬럼 막의 중앙에 DEPC 처리수 30 µL를 추가합니다. 실온에서 1분 동안 배양합니다.
  11. 컬럼을 멸균된 1.5 mL 원심 분리 튜브에 넣습니다. 12,000 x g로 1분 동안 원심 분리하여 RNA를 용출합니다.
  12. 용출된 RNA 1 µL를 취해 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 농도와 순도를 측정합니다.

7. RNA 역전사

  1. 반응 시스템 준비
    1. 4x 역전사 마스터 믹스, nuclease-free water 및 RNA 템플릿을 얼음 위에서 해동합니다.
    2. 200 µL PCR 튜브에 4x 역전사 마스터 믹스 5 µL, 전체 RNA 템플릿 10 µL, nuclease-free water 5 µL를 넣어 20 µL 반응 시스템을 준비합니다.
    3. 1,000 x g에서 1분 동안 짧게 원심분리하여 반응 혼합물을 튜브 바닥으로 모읍니다.
    4. PCR 튜브를 서멀 사이클러에 넣고 역전사 프로그램을 실행합니다: 50 °C에서 5분; 85 °C에서 5초.
      참고: RT-qPCR에 미칠 수 있는 잠재적 억제제의 영향을 줄이기 위해, 사용 전 역전사 생성물을 20배 희석하십시오.

8. 실시간 정량 PCR (RT-qPCR)

  1. RT-qPCR 반응 시스템 준비
    1. 2x SYBR Green qPCR 마스터 믹스, cDNA 템플릿, 10 µM 정방향 및 역방향 프라이머를 얼음 위에서 해동하며, 전 과정 동안 빛으로부터 보호한다.
    2. 96-웰 PCR 플레이트에 10 µL의 2x SYBR Green qPCR 마스터 믹스, 10 µM 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 0.8 µL씩(최종 농도 400 nM), 20배 희석한 cDNA 템플릿 2 µL, 그리고 nuclease-free water 6.4 µL를 첨가하여 웰당 20 µL의 반응 시스템을 준비한다.
    3. 모든 웰이 완전히 밀봉되었는지 확인하며 96-웰 플레이트를 광학 접착 필름으로 밀봉한다.
    4. 1,000 x g에서 1분 동안 원심 분리하여 반응 혼합물을 웰 바닥에 모은다.
    5. PCR 플레이트를 실시간 PCR 검출 시스템에 넣고 열 주기 프로그램을 실행한다.
      참고: 열 주기 프로그램: 95 °C에서 30초 동안 사전 변성(1 사이클); 증폭: 95 °C에서 30초, 60 °C에서 30초(40 사이클); 멜팅 커브 분석: 95 °C에서 15초, 60 °C에서 1분, 0.15 °C/s로 95 °C까지 램프. 각 조직 RNA 샘플은 4회의 기술적 반복으로 qPCR을 수행한다. 각 조직 샘플은 5마리의 Ae. albopictus에서 수집한 조직 풀로 구성된다. RT-qPCR에 사용된 프라이머 서열은 Table 1에 나열되어 있다.
  2. 데이터 분석
    1. 각 프라이머 쌍의 멜팅 커브를 검사하여 단일하고 명확한 해리 피크가 나타나는지 확인한다.
    2. 장비 소프트웨어에서 Ct 값을 내보낸다. 그래프 작성 및 데이터 분석은 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 수행한다.
프라이머 이름프라이머 서열 (5''-3')
*Ae. albopictus* β$\beta$-actin 정방향 프라이머 GGAGAAGATCTGGCATCACA
Ae. albopictus β-actin 역방향 프라이머TGTCATCTTCTCGCGGTTAG
*Ae. albopictus* GAPDH 정방향 프라이머CTGCCAAGGCTGTCGGTAA
*Ae. albopictus* GAPDH 역방향 프라이머TCATAGGAGGCAGGCTTGGA
*Ae. albopictus* RPS6 정방향 프라이머ACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA
Ae. albopictus RPS6 역방향 프라이머CTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT

표 1: RT-qPCR에 사용된 Ae. albopictus의 프라이머 서열.

결과

본 연구는 두 부분으로 구성됩니다: Ae. albopictus의 해부와 해부 후 조직에서의 RNA 추출입니다. 전체 워크플로우는 그림 1에 나타나 있으며, 그림 1A는 Ae. albopictus의 해부를, 그림 1B는 RNA 추출 및 이후의 참조 유전자 발현 수준 검출을 보여줍니다.

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그림 1: Ae. albopictus의 해부 및 해부 후 조직으로부터의 총 RNA 추출 모식도. (A) Ae. albopictus의 수집, 마취 및 해부. (B) 해부 후 조직으로부터의 RNA 추출, 순도 확인 및 참조 유전자 발현 수준 검출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

실험실에서 사육한 Ae. albopictus 5마리를 해부하여 중장, 타액선 및 난소를 분리하였다. 80× 배율에서 Ae. albopictus의 투명한 전장, 중장 및 후장이 뚜렷하게 보였으며, 알갱이 모양의 난소가 양옆에 위치하고 흰색 말피기관이 이를 덮고 있었다(그림 2A). 시야를 400×로 조정하자 Ae. albopictus의 반투명한 타액선이 명확하게 관찰되었다(그림 2B). 그림 2C,D는 분리된 중장 및 난소 조직을 보여준다 . 결과적으로, 이 해부 방법을 통해 분리된 조직들은 구조적 무결성이 유지되었으며, 이는 해부 후 시료로부터의 후속 총 RNA 추출에 필수적이다.

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그림 2: Ae. albopictus 조직의 해부 후 분석. (A) Ae. albopictus의 복부에서 조직을 분리한다. (B) Ae. albopictus의 반투명한 세엽성 타액선. (C) Ae. albopictus의 전장과 중장. (D) Ae. albopictus의 쌀알 모양으로 쌍을 이룬 난소. I: 전장; II: 중장; III: 후장; IV: 말피기관; V: 난소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분리된 Ae. albopictus 조직에서 총 RNA를 추출하였습니다. 추출 전 조직 샘플(침샘, 중장 및 난소)을 완전히 분쇄하였습니다. RNA 농도는 조직 유형에 따라 상이하였는데, 침샘은 7.8 ng/µL였으며, 암컷 Ae. albopictus의 중장, 난소 및 전신 균질액은 각각 55.3, 45.7, 42.7 ng/µL였습니다. 모든 샘플은 A260/A280 비율이 1.87–2.10, A260/A230 비율이 1.73–2.13으로 높은 순도를 나타냈습니다(표 2). 모든 조직에 대해 RT-qPCR로 세 가지 후보 참조 유전자(GAPDH, β-actin, RPS6)의 발현 수준을 평가하였습니다. RNA 농도에 따라 발현량이 어느 정도 차이를 보였으나, 세 유전자 모두 서로 다른 조직 유형 전반에서 비교적 안정적으로 유지되었습니다(그림 3). GAPDH, β-actin, 그리고 RPS6는 Ae. albopictus의 다양한 조직에서 유전자 발현을 정규화하기 위한 안정적인 참조 유전자로 적합합니다.

조직시료 수RNA 농도 (ng/μL)A260/A280A260/A230
타액선57.81.871.73
중장555.31.941.98
난소545.72.102.13
여성142.72.041.92

표 2: Ae. albopictus 조직에서 추출한 RNA의 농도 및 순도.

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그림 3: RT-qPCR로 검출한 참조 유전자(GAPDH, β-actin, 및 RPS6)의 Ct 값. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

토론

Ae. albopictus는 남극 대륙을 제외한 모든 대륙의 온대, 아열대 및 열대 지역에 널리 분포하고 있습니다13,14. 뎅기 바이러스(DENV), 지카 바이러스(ZIKV), 치쿤구니야 바이러스(CHIKV)와 같은 아르보바이러스의 중요한 매개체로서, 중국 광둥성에서 모기 매개 질병의 유행을 반복적으로 일으켰습니다15.

~에 관한 연구를 돕기 위해 *Ae. albopictus*- 관련 바이러스 및 그 전파를 규명하기 위해, 우리는 다음과 같은 간편한 분석 방법을 개발하였습니다. *Ae. albopictus* 조직. 전통적인 해부 프로토콜에서는 타액샘 해부 중 머리를 흉부에서 분리할 때, 가해지는 힘에 따라 타액샘이 흉부나 머리 중 어느 한쪽에 붙어 있을 수 있습니다. 타액샘의 크기가 약 1mm에 불과하기 때문에 흉부 내에서 이를 찾는 것이 어려워집니다.16본 방법은 표준 모기 장기 분리 프로토콜을 기반으로 하며, 전흉흉판(prosternal sternite)과 중흉흉판(mesosternal sternite) 아래에 위치한 침샘의 분리 과정을 최적화하였습니다. 이는 400배율 하에서 관찰해야 합니다.× 배율17해부를 위해 한 개의 바늘로 중가슴을 부드럽게 누르는 동시에 다른 바늘을 사용하여 머리를 분리하는 압력을 가함으로써 타액선이 온전하게 떨어져 나오게 합니다. 이러한 방법은 흉강 내에서 타액선을 찾을 필요가 없고, 타액선의 오염과 손상을 방지하며, 전체 해부 시간을 단축합니다. 난소는 복부 제6~8마디 근처에 위치하며, 복부 제6마디부터 해부를 시작하여 중장, 말피기관 및 난소를 복부에서 조심스럽게 추출함으로써 보존합니다.18이 방법은 손상되지 않은 침샘, 유착 없이 전형적인 형태를 유지한 난소, 그리고 끊어지지 않은 중장을 생성합니다.그림 2). 이 해부 기술은 다음 연구들에 귀중한 지침을 제공합니다. Ae. albopictus 그리고 매개체 전파 바이러스의 복제, 확산 및 전송.

Ae. albopictus 조직에서의 RNA 추출은 모기 매개 바이러스를 검출하는 데 매우 중요합니다. 전통적인 TRIzol 방법은 시간이 많이 소요되고 기술적으로 까다롭지만, 일반적으로 RNA 수율이 높으며 정확하게 수행될 경우 고품질의 RNA를 얻을 수 있습니다. 반면, 컬럼 기반 방법은 재현성이 더 좋고 수행하기 쉽지만, RNA 회수율이 낮을 수 있으며 지방체에 적용했을 때 효율이 떨어질 수 있습니다19,20. 본 연구에서는 적출한 조직을 핵산 안정제에 즉시 보존하고 충분히 분쇄한 후, 스핀 컬럼 방법을 사용하여 cDNA 합성을 위한 RNA를 추출하였습니다21. cDNA 품질의 편차 속에서 RT-qPCR 데이터의 정확한 정규화를 보장하기 위해서는 안정적인 참조 유전자가 필요합니다22. Ae. albopictus의 다양한 발달 단계에 대한 참조 유전자들은 확립되어 있으나, 조직 특이적 참조 유전자는 추가적인 검증이 필요합니다23,24. 모든 적출 조직에서 역전사된 RNA를 RT-qPCR로 분석한 결과, GAPDH, β-actin, 및 RPS6의 일관된 증폭이 확인되었으며, 이는 본 적출 프로토콜을 통해 얻은 RNA 품질이 Ae. albopictus의 하위 조직 특이적 유전자 발현 연구를 지원하기에 충분함을 입증합니다.

본 프로토콜에 따라 Ae. albopictus 조직을 해부할 때, 때때로 타액선이 머리와 함께 분리되지 않는 경우가 발생할 수 있습니다. 이는 대개 흉부에 가해진 압력이 불충분한 상태에서 머리를 너무 빠르게 분리했기 때문입니다. 이를 해결하려면 중흉부에 일정한 압력을 가하면서 머리를 천천히 바깥쪽으로 당겨, 타액선이 머리와 함께 손상 없이 분리되도록 하십시오. RNA 보존액이 들어 있는 분쇄 튜브로 타액선을 옮길 때, 광원 쪽으로 용액을 비추어 작은 흰색 입자가 떠 있는지 주의 깊게 확인하십시오. 튜브에서 타액선을 찾을 수 없는 경우, 즉시 해부용 바늘에 타액선이 붙어 있는지 확인하십시오. RNA 추출 시에는 키트 제조사의 프로토콜을 엄격히 따르십시오. 얻어진 RNA 농도가 낮으면, 용출 버퍼를 사용하여 2차 용출을 수행할 수 있습니다. RT-qPCR에서 멜트 커브(melt curve)에 다중 피크가 나타날 수 있는데, 이 경우 먼저 프라이머 특이성을 확인하십시오. Ct 값이 높으면 프라이머의 용융 온도에 맞추어 프로그램의 어닐링 온도를 조절하십시오. 일반적으로 프로그램의 어닐링 온도는 프라이머 용융 온도보다 1–2 °C 낮게 설정해야 합니다25.

본 연구에는 몇 가지 한계점이 있습니다. 샘플 범위가 상대적으로 좁아 중장, 타액선 및 난소 조직에만 집중하였으며, 말피기관이나 지방체와 같은 다른 조직은 조사하지 않았습니다26. 또한, 분석 대상이 3일 된 실험실 사육 암컷 모기로 제한되었으며, 흡혈했거나 바이러스에 감염된 개체는 제외되었습니다27. 향후 연구에서는 말피기관과 같은 조직으로 샘플 범위를 확장하고, 다양한 생리적 상태에 있는 Ae. albopictus 개체를 고려하는 등의 개선이 이루어져야 합니다.

요약하자면, Ae. albopictus의 중장, 난소 및 타액선을 적출하고 이어서 총 RNA를 추출하는 과정은 벡터 역량 평가 및 아르보바이러스 전파 연구를 위한 기술적 토대를 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3 mL 초장형 파스퇴르 피펫전혈(Whole Blood)WHB-S43 mL
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711-02500회 반응분
HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCR 키트VazymeR433-01100회 반응분
마이크로 총 RNA 추출 키트의료 기술MDT-CFR07100T/박스
마이크로피펫 0.5-10μLEppendorf4043444
현미경 슬라이드세포독성 시험 (CITOTEST)80302-210475 mm×25 mm
마이크로분광광도계KAIAOK5600C
핵산 추출 완충액의료기술MDT-TP01100 mL
PBS 인산염 완충 식염수 (멸균)ServicebioG4202500 ML
PCR 열 순환기EppendorfMastercycler X50s
QuantStudioTM 7 Pro 실시간 PCR 시스템Applied BiosystemsEN61326-1
Stemi 305 LAB 현미경 세트ZEISS435063-9010-000

참고문헌

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