자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에

요약

이 비디오에서는, 우리는 망간 염화와 인간의 배아 줄기 세포를 (hESC) (MnCl 라벨하는 방법을 보여주는데 ₂) 세포 생물학적으로 활성화된 경우 전압 - 문이 칼슘 채널을 통해 세포를 입력할 수있는. 또한, 우리는 MnCl의 사용을 보여 ₂ 셀룰러 MRI 대비 에이전트로 hESC의에서 체외의 생존을 결정합니다.

초록

인간 배아 줄기 세포는 (hESC) 부상 myocardium를 복원하는 능력을 증명하고있다. 자기 공명 영상 (MRI)는 부상 myocardium의 복원을 평가하는 주된 이미징 modalities 중 하나로 떠오르고있다. 또한, 이러한 철 - 산화 nanoparticles으로 전 생체내 라벨 에이전트는, 추적하기 위해 고용 및 이식 줄기 세포를 집중하고 있습니다. 그러나,이 방법은 이식 세포의 생존에 관한 근본적인 세포 생물학 속성을 모니터하지 않습니다. 그것은 망간 염화 (MnCl ₂₎ 전압 - 문이 칼슘 (칼슘 ^{2 +)} 세포 생물학적으로 활성화되어 채널을 통해 세포를 입력하고, T ¹ 단축 효과를 생성하는 intracellularly 축적되는 것으로 알려져있다. 따라서, 우리는 망간 - 안내 MRI는 myocardium에 hESC의 이식 후 세포 생존을 모니터하는 데 유용할 수 있습니다하는 것이 좋습니다.

이 비디오에서는, 우리는 MnCl ₂ 어떻게 이들 세포는 명확하게 체외에서 MRI를 사용하여 볼 수와 hESC 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 동시에, CA ² 생물 학적 활동 ⁺ - 채널 수반하는 신호 변경을 평가하기 위해 칼슘 ^{2 +} 채널 작용제 및 길항제를 모두 활용 변조된 것이다.

프로토콜

인간 배아 줄기 세포의 망간 라벨링

1. 피더없이 5 분 조건에서 양식되고있는 인간의 배아 줄기를 Trypsinize. 문화 미디어를 추가하여 트립신을 중화.
2. 20 5 분 800 rpm으로 centrifuging하여 세포를 스핀 다운 ° 섭씨. 다시 보류 세포 펠릿 후, trypan 파랑 얼룩에 의해 세포의 개수를 계산합니다. 얻은 세포 개수에 따라 원뿔 튜브에 3,000,000 세포 네 가지 aliquots으로 세포를 나눕니다. 원심 분리하여 다시 펠렛 세포.
3. 그냥 망간 상표를 시작하기 전에, 0.1mM 망간 염화 솔루션을 만들기 위해 0.9 %의 나트륨 염화물 솔루션 신선한 망간 염화을 풀다.
4. 칼슘 채널의 활동을 관찰하기 위해서는, 넷 샘플이 준비되었습니다. 첫 번째 예제는 혼자서 0.9 %의 나트륨 염화물에 incubated 세포를 포함 우리의 컨트롤입니다. 두 번째 예제 0.1 MM MnCl ₂ incubated 세포가 포함되어 있습니다. 샘플 3 4 칼슘 ^{2 +} 채널 작용제 5 μm의 하나와 0.1 MM MnCl ₂ incubated 세포 (S )-(-)- 베이 K8644, 또는 칼슘 ^{2 +} 채널 길항제, verapamil 250 μm의이....

토론

이러한 결과는 망간도 세포 생존을 보여줄 수 전압 - 게이 티드 칼슘 채널 및 망간은 MRI 대비 에이전트로 사용할 수를 통해 입력 않는다는 것을 나타냅니다. 따라서, 우리는 망간 - 안내 MRI는 myocardium로 인간 배아 줄기 세포의 이식 후 세포 생존을 모니터하는 데 유용할 수 있습니다하는 것이 좋습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화 망간 사수화물	시약	Sigma-Aldrich	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	시약	Sigma-Aldrich	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, 최소 99.0% titration	시약	Sigma-Aldrich	V4629
염화 나트륨 0.85-0.90% W/V	시약	VWR international	VW 3257-1
Feridex I.V.	시약	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides 주사 용액 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	시약	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (ES 세포용 혈청 대체제)	시약	GIBCO, by Life Technologies	10828
DMEM/F12 (1:1)	시약	GIBCO, by Life Technologies	11330
2- mercapt–thanol 98+%	시약	Sigma-Aldrich	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	시약	GIBCO, by Life Technologies	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	시약	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
MEM 비필수 아미노산 100x 용액	시약	GIBCO, by Life Technologies	11140
Signa HDx 3T MRI	장비	GE Healthcare
임상용 무릎 코일	장비	GE Healthcare
DPBS	시약	GIBCO, by Life Technologies	14190