이 동영상은 유전자 변형 동물을 만들 C. 엘레간스의 생식선에 microinjection의 기법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 변형 Caenorhabditis의 엘레간스는 즉시 생식선 하나에 DNA 플라스미드 솔루션의 microinjection을 통해 만들 수 있습니다. 플라스미드 DNA는 염색체 안정 실제이 같은 효율성과 함께하지만,하지 상속됩니다 extrachromosomal concatamers을 형성 다시 배열. 관심 유전자는 해부 현미경으로 유전자 변형 동물의 선택을 허용하는 등 rol - 6 GFP와 같은 명백한 phenotypic 마커와 공동 주입이다. 외인성 유전자는 세포의 현지화 연구에 대한 기본 발기인의 표현 수 있습니다. 또는, transgene은 그 특정 세포 또는 조직에있는 유전자 산물의 역할을 평가하는 다른 조직에 특정한 모터에 의해 구동 수 있습니다. 이 기술은 효율적으로 germline 또는 초기 배아 3 제외한 C. 엘레간스의 모든 조직에서 유전자 발현을시킵니다. 유전자 변형 동물의 창조는 광범위하게 실험 패러다임의 다양한 활용합니다. 이 동영상은 유전자 변형 벌레를 생성하는 microinjection 절차를 보여줍니다. 또한, 안정적인 형질 C. 엘레간스 라인의 선정 및 유지 보수가 설명되어 있습니다.
프로토콜
표현 플라스미드 건설
두 plasmids이 필요합니다 : 조직 특정 관심의 유전자의 표현과 선택 전환 표시로 두 번째 한.
실험 플라스미드
- 예를 들어 관심의 조직 / 세포 유형, 신경이나 근육 특정 발기인 표현하는 발기인을 선택합니다. 하나는 같은 조직 내에서 여러 개의 유전자를 표현하는 경우, 게이트웨이 시스템 (Invitrogen)에 플라스미드 발기인 카세트를 사용할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 recombinational 복제 4에 의해 모터의 관심 하류의 유전자의 삽입을 허용합니다. 일반적으로 상류 시퀀스의 2-5킬로바이트가 정확하고 정확한 표현을 가지고 충분하다.
- 관심 유전자의 cDNA는 두 가지 방법으로 복제하실 수 있습니다
- 제한 효소를 사용하여 기존 복제.
- 게이트웨이 복제의 경우, PCR은 게이트웨이 AT & T B recombinational 시퀀스를 포함하는 primers를 사용하여 증폭됩니다. 증폭된 cDNA 먼저 입력 벡터를 만들 수있는 기증자 벡터 pDONR201에 recombined 후 E.으로 변화됩니....
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토론
이 절차를 수행할 때, 그것은 기억하는 것이 중요합니다 :
- 생식선의 중심에 직접 주입
- 너무 많은 액체를 주입하지
- dessication을 방지하기 위해 신속하게 작동합니다.
당신이 너무 큰 고장 등 바늘과 문제에 실행하는 경우, 그것은 오히려 이상적인 바늘보다 적은 비용으로 주입하는 것보다, 신선한 바늘을 리메이크하는 것이 좋습니다.
유전자 변형 벌레의 생성과 같은 다양한 애플 리케이션을했습니다
- 돌연변이 유전자의 식별은 방법의 변형 구조라는
- 잘린 단백질의 표현을 통해 단백질 도메인 매핑
- 휴대폰과 질병 과정에서 유전자의 역할의 특성.
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감사의 글
우리 모두는 콜드 웰 연구소 회원의 협력 정신을 인정하고 싶습니다. 연구실에 운동 장애 연구는 바흐만 - 스트라우스 Dystonia & 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨 질병 협회, 앨라배마 파킨슨병 협회, 파킨슨병 연구에 대한 마이클 J. 폭스 재단과 대학 연구소에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 아가로스(Agarose) | 초순수(Ultrapure) | Invitrogen | 15510-027 | |
| 할로카본 오일(Halocarbon Oil), Voltalef | Hulle 10S | elfatochem, France | ||
| 커버글라스 18x18 mm | Fisher Scientific | 12-548-A | ||
| 커버글라스 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| 커버글라스 22x50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | ||
| 100 ul 모세관 | VWR international | 53432-921 | ||
| 바늘용 유리 모세관 | "Kwik-Fil" | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| 니들 풀러(Needle Puller) | 도구 | Narishige International | Model PP-830 | |
| microINJECTOR 시스템 | Tritech Research, Inc. | MINJ-1000 | 경위경, 스테이지, 매니퓰레이터 | |
| 형광 해부용 | 현미경 | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| 해부용 | 현미경 | Nikon Instruments | SMZ645 |
참고문헌
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans:....
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