루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

요약

여기, 우리는 Promega에서 듀얼 GloTM 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

초록

멤브레인 biogenesis 동안 다른 지질 합성 경로의 조정을 연구하기 위해 그것은 멤브레인 biogenesis 빠르게하고 inducible 방식에서 발생하는 실험 시스템을 작동하는 데 유용합니다. 우리는 세포가 빠르게 입자 engulfment 동안 자료를 배치로 손실 막 풀을 보충 막 lipids를 종합으로 라텍스 구슬의 phagocytosis가 이러한 목적을 위해 실용적인 것으로 나타났습니다. 여기, 우리는 Promega에서 듀얼 글로 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

프로토콜

세포 배양

1. 인간의 배아 신장 293 (HEK293) 세포의 재고 문화가 항생제의 칵테일 (페니실린의 ML 당 100 단위 및 100 μg와 보충 Dulbecco의 수정된 이글의 중간 (DMEM)으로 구성된 '매체'에 10 cm 문화 요리에 재배 당 스트렙토 마이신 황산의 ML)와 10 % 태아 소 혈청 (FBS).
2. 실험 세포를 설정하려면, 매체가 해제 빨려이며, 세포는 인산 5 ML로 두 번 씻어하는 것은 생리 (PBS) 솔루션을 버퍼.
3. PBS 그런 다음 제거하고 0.25 %의 트립신을 포함하는 솔루션 0.6 ML로 대체됩니다.
4. 세포 분리하기 시작했다 때까지 요리는 37 ˚ C 약 2 분 incubated입니다.
5. 매체의 5.5 ML은이 트립신을 중화에 추가되고 세포는 hemocytometer로 계산됩니다.
6. 전지는 ML 당 320,000 세포에 희석하고 polylysine - 코팅 96 - 웰 플레이트 문화에 잘 당 0.1 ML에 적절하고 있습니다.
7. 37 조직 문화의 인큐베이터로 접시를 놓고 ˚ C 8.8 %의 CO2를 포함하는 분위기와 24 시간을위한 성장.

Transfections

1. transfections 준비에서, 그것은 실험 조건에 따라 수행과 플라스미드의 양의 어떤 transfected 될 수 얼마나 많은 복제로 간주되어야합니다. 우리는 일상적으로 세중의 모든 조건을 수행하고 잘 따라 플라스미드 DNA의 50-100 NG 총 transfect. 플라스미드 믹스 적어도 기자 반딧불 루시페라제 및 제정 모터의 제어 플라스미드 표현 Renilla의 루시페라제 표현을 구성 포함해야합니다.
2. 플라스미드 솔루션은 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 pipetted 및 혈청 - 무료 항생제없는 DMEM의 샘플 당 10 μl로 보충하고 있습니다. 20 우물 각 50 μg의 DNA와 transfected 수있다면 예를 들어, 1 μg의 DNA 200 μl DMEM를 추가합니다.
3. DMEM / DNA 솔루션 μg의 DNA 당 3 μl '트랜짓 293 시약'(Mirus)을 추가할 수 있습니다. &을 아래로 pipetting으로 혼합하고 최소 10 분 상온에서 샘플 서 보자.
4. 이 기간 동안, 96 - 웰 문화 판에서 미디어를 제거하고 신선한 중간 A. 90 μl로 교체
5. 각 잘 DMEM / DNA / 운송 293 혼합 10 μl를 추가합니다.
6. 37 조직 문화의 인큐베이터로 접시를 놓고 ˚ C 8.8 %의 CO2를 포함하는 분위기와 24 시간을위한 성장.

Phagocytosis

1. 미디어 B를 플러스 (DMEM과 F12 햄의 중간 플러스 항생제와 10 % FBS의 1:1 혼합물) ML 당 제로 1 MG에서 0.75 - μm의 라텍스 구슬이 들어 suspensions를 준비합니다.
2. 96 - 웰 문화 판에서 미디어를 제거하고 중간 B.의 비드 suspensions의 0.1 ML로 교체
3. 1000 X G. 2 분 플레이트 스핀
4. 세포는 다음 37 ˚ C 6-16 시간에 대한 양식입니다. 조건 및 루시페라제 증가 리포터 유전자 발현이 1로 3 시간 후에 감지 수 있습니다 운전하는 데 사용되는 모터에 따라 다릅니다.
5. 같은 경우에는 그것이 30-60 분 구슬로 세포를 부화 필요할 수 있습니다 다음, 비법인 구슬을 제거하고, 시간의 추가 기간을 위해 세포를 잠복기 전에 새로운 미디어를 추가하는 PBS 2 세척 할.

듀얼 GloTM 루시페라제 어세이

1. 참고 :이 키트를 사용을위한 프로토콜은 제조 업체에서 권장하는 것과 몇 가지 측면에서 다릅니다. 이것은 샘플 당 필요한 시약의 양을 줄이기 위해 수정되었습니다.
2. -20 ˚ C. 여러 작은 aliquots 및 저장에 1 M DTT, 분할의 솔루션을 준비
3. 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.8), 10 % (V / V) 글리세롤, 그리고 0.5 % (V / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 용해 버퍼를 준비합니다. 사용하기 전에, 나누어지는 실험에 필요한 금액과 1X로 0.5의 최종 농도 1 M DTT 플러스 테아제 억제제 칵테일의 ML 당 1 μl를 추가합니다. 남은 DTT 솔루션을 재사용하지 마십시오.
4. 처음으로 듀얼 GloTM 키트를 사용할 경우, 듀얼 GloTM 루시페라제 기판 한 병 (제공하는 듀얼 GloTM 루시페라제 버퍼 한 병 (키트와 함께 제공)의 전체 내용을 전송하여 (반딧불) 루시페라제 시약 준비 키트와 함께). -20 ˚ C. 10 - ML aliquots 및 저장에 사용하지 않는 루시페라제 시약 디비드
5. 조직 문화의 인큐베이터에서 96 - 웰 플레이트를 제거하고 얼음에 놓으십시오. 흡인하여 미디어를 제거, 40 μl 당 우물의 용해 버퍼를 추가한 다음 30 분 얼음 접시를 두십시오.
6. 잘 루시페라제 시약의 다음 당 흰색, 불투명한에서 96 - 웰 플레이트 (OptiplateTM - 96, 퍼어킨 엘머 카탈로그 번호 6005290) 나누어지는 15 μl은 세포 lysate 15 μl를 추가합니다.
7. 10 분 실온에서 접시를 부화 후 microplate 리더의 발광을 읽어보십시오.
8. 즉시 사용하기 전에, 1 일부 듀얼 GloTM 스톱 & 글로을 추가하여 Renilla 루시페라제 기판 솔루션의 적절한 금액을 준비 ®; 시약 (키트와 함께 제공) 100 부품 듀얼 GloTM 스톱 & 글로 ® 버퍼 (키트와 함께 제공)합니다.
9. 각 물론 10 분에 대해 실온에서 품어 Renilla 루시페라제 기판 솔루션을 15 μl 당 우물을 추가 후 다시 발광을 측정합니다.