루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

세포 배양

1. 인간의 배아 신장 293 (HEK293) 세포의 재고 문화가 항생제의 칵테일 (페니실린의 ML 당 100 단위 및 100 μg와 보충 Dulbecco의 수정된 이글의 중간 (DMEM)으로 구성된 '매체'에 10 cm 문화 요리에 재배 당 스트렙토 마이신 황산의 ML)와 10 % 태아 소 혈청 (FBS).
2. 실험 세포를 설정하려면, 매체가 해제 빨려이며, 세포는 인산 5 ML로 두 번 씻어하는 것은 생리 (PBS) 솔루션을 버퍼.
3. PBS 그런 다음 제거하고 0.25 %의 트립신을 포함하는 솔루션 0.6 ML로 대체됩니다.
4. 세포 분리하기 시작했다 때까지 요리는 37 ˚ C 약 2 분 incubated입니다.
5. 매체의 5.5 ML은이 트립신을 중화에 추가되고 세포는 hemocytometer로 계산됩니다.
6. 전지는 ML 당 320,000 세포에 희석하고 polylysine - 코팅 96 - 웰 플레이트 문화에 잘 당 0.1 ML에 적절하고 있습니다.
7. 37 조직 문화의 인큐베이터로 접시를 놓고 ˚ C 8.8 %의 CO2를 포함하는 분위기와 24 시간을위한 성장.

Transfections

1. transfections 준비에서, 그것은 실험 조건에 따라 수행과 플라스미드의 양의 어떤 transfected 될 수 얼마나 많은 복제로 간주되어야합니다. 우리는 일상적으로 세중의 모든 조건을 수행하고 잘 따라 플라스미드 DNA의 50-100 NG 총 transfect. 플라스미드 믹스 적어도 기자 반딧불 루시페라제 및 제정 모터의 제어 플라스미드 표현 Renilla의 루시페라제 표현을 구성 포함해야합니다.
2. 플라스미드 솔루션은 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 pipetted 및 혈청 - 무료 항생제없는 DMEM의 샘플 당 10 μl로 보충하고 있습니다. 20 우물 각 50 μg의 DNA와 transfected 수있다면 예를 들어, 1 μg의 DNA 200 μl DMEM를 추가합니다.
3. DMEM / DNA 솔루션 μg의 DNA 당 3 μl '트랜짓 293 시약'(Mirus)을 추가할 수 있습니다. &을 아래로 pipetting으로 혼합하고 최소 10 분 상온에서 샘플 서 보자.
4. 이 기간 동안, 96 - 웰 문화 판에서 미디어를 제거하고 신선한 중간 A. 90 μl로 교체
5. 각 잘 DMEM / DNA / 운송 293 혼합 10 μl를 추가합니다.
6. 37 조직 문화의 인큐베이터로 접시를 놓고 ˚ C 8.8 %의 CO2를 포함하는 분위기와 24 시간을위한 성장.

Phagocytosis

1. 미디어 B를 플러스 (DMEM과 F12 햄의 중간 플러스 항생제와 10 % FBS의 1:1 혼합물) ML 당 제로 1 MG에서 0.75 - μm의 라텍스 구슬이 들어 suspensions를 준비합니다.
2. 96 - 웰 문화 판에서 미디어를 제거하고 중간 B.의 비드 suspensions의 0.1 ML로 교체
3. 1000 X G. 2 분 플레이트 스핀
4. 세포는 다음 37 ˚ C 6-16 시간에 대한 양식입니다. 조건 및 루시페라제 증가 리포터 유전자 발현이 1로 3 시간 후에 감지 수 있습니다 운전하는 데 사용되는 모터에 따라 다릅니다.
5. 같은 경우에는 그것이 30-60 분 구슬로 세포를 부화 필요할 수 있습니다 다음, 비법인 구슬을 제거하고, 시간의 추가 기간을 위해 세포를 잠복기 전에 새로운 미디어를 추가하는 PBS 2 세척 할.

듀얼 GloTM 루시페라제 어세이

1. 참고 :이 키트를 사용을위한 프로토콜은 제조 업체에서 권장하는 것과 몇 가지 측면에서 다릅니다. 이것은 샘플 당 필요한 시약의 양을 줄이기 위해 수정되었습니다.
2. -20 ˚ C. 여러 작은 aliquots 및 저장에 1 M DTT, 분할의 솔루션을 준비
3. 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.8), 10 % (V / V) 글리세롤, 그리고 0.5 % (V / V) 트리톤 X - 100을 포함하는 용해 버퍼를 준비합니다. 사용하기 전에, 나누어지는 실험에 필요한 금액과 1X로 0.5의 최종 농도 1 M DTT 플러스 테아제 억제제 칵테일의 ML 당 1 μl를 추가합니다. 남은 DTT 솔루션을 재사용하지 마십시오.
4. 처음으로 듀얼 GloTM 키트를 사용할 경우, 듀얼 GloTM 루시페라제 기판 한 병 (제공하는 듀얼 GloTM 루시페라제 버퍼 한 병 (키트와 함께 제공)의 전체 내용을 전송하여 (반딧불) 루시페라제 시약 준비 키트와 함께). -20 ˚ C. 10 - ML aliquots 및 저장에 사용하지 않는 루시페라제 시약 디비드
5. 조직 문화의 인큐베이터에서 96 - 웰 플레이트를 제거하고 얼음에 놓으십시오. 흡인하여 미디어를 제거, 40 μl 당 우물의 용해 버퍼를 추가한 다음 30 분 얼음 접시를 두십시오.
6. 잘 루시페라제 시약의 다음 당 흰색, 불투명한에서 96 - 웰 플레이트 (OptiplateTM - 96, 퍼어킨 엘머 카탈로그 번호 6005290) 나누어지는 15 μl은 세포 lysate 15 μl를 추가합니다.
7. 10 분 실온에서 접시를 부화 후 microplate 리더의 발광을 읽어보십시오.
8. 즉시 사용하기 전에, 1 일부 듀얼 GloTM 스톱 & 글로을 추가하여 Renilla 루시페라제 기판 솔루션의 적절한 금액을 준비 ®; 시약 (키트와 함께 제공) 100 부품 듀얼 GloTM 스톱 & 글로 ® 버퍼 (키트와 함께 제공)합니다.
9. 각 물론 10 분에 대해 실온에서 품어 Renilla 루시페라제 기판 솔루션을 15 μl 당 우물을 추가 후 다시 발광을 측정합니다.