이 동영상은 모든 마운트 immunohistochemistry, 항원의 공간 및 시간적 표현식 패턴이 젊은 여자는 태아의 시각 될 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 원래 제인 다드와 톰 Jessell에 의해 도입되었다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 뇌, 신경 튜브 및 체절 개발에 항체 표현을 공부를위한 이상적인 도구가합니다. 이 동영상은 HRP 복합 이차 항체를 사용하여 전체 마운트 항체 얼룩의 여러 단계를 보여주는, 첫째, 배아는 난자에서 해부하고 paraformaldehyde에서 해결되었습니다. 둘째, 내생 퍼옥시데이즈은 inactivated이며 배 (胚)는 다음 주 항체에 노출됩니다. 여러 세척 후, 배아는 HRP에 복합 보조 항체와 incubated입니다. 퍼옥시데이즈 활동 diaminobenzidine 기판과 반응을 사용하여 드러났습니다. 마지막으로, 배 (胚)는 고정하고 사진과 sectioning에 대한 처리됩니다. 형광 항체의 사용을 통해이 방법의 장점은 그 배아가 있으므로 단면의 항원 사이트의 연구를 지원, 왁스 sectioning에 대해 처리할 수 있습니다. 이 방법은 원래 제인 다드와 톰 Jessell에 의해 도입되었다
프로토콜
I. 도식 개요 :
이 비디오는 여자의 배아에서 전체 마운트 immunohistochemistry의 여러 단계를 보여줍니다. 첫째, 배아는 PFA에서 수정된 [IHC1]. 그런 다음, 내생 퍼옥시데이즈 활동은 침묵이다 [IHC2]. 배아는 다음 주 항체 [IHC3]에서 incubated입니다. 여러 세척 후 배아가 이차 항체에 incubated입니다 [IHC4]; 컬러 반응이 DAB [IHC5]를 사용하고 계시이며 항체 얼룩이 나타납니다 오렌지 [IHC6].
1 부 : 배아를 고정
- 여자의 배아에 대한 전체 마운트 immunohistochemistry를 수행하려면 먼저 집게로 껍질을 감청하고 껍질 조각을 제거하여 계란을 엽니다.
- 포셉와 두꺼운 알부민을 제거하고, 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉로 난황을 기울.
- 좋은 가위를 사용하여 배아 주위....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 동영상은 젊은 여자는 배아의 전체 마운트 항체 얼룩을 수행하는 다른 단계를 보여줍니다. 이 프로토콜은 기본적으로 여자가 2,3의 소설 항체의 공간 및 시간적 특성을 위해 사용뿐만 아니라 모욕 4 다음 배아 기형을 결정하는 것으로 알려진 antigenic 마커의 사용입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
감사의 글
(J. 다드, TM Jessell 및 A. 가와 카미)에 의해 개발된 단클론 항체는 (15.3B9, PAX7) 생물 과학학과, 아이오와 대학에서 NICHD 유지의 후원하에 개발된 발달 연구 브리 도마 은행에서 얻은되었습니다 아이오와. DP는 약물 남용에있는 국립 연구소에서 루스 Kirschstein 수상 1F32 - 01A1 DA021977의받는 사람입니다. 이 작품은 RHF에 마가렛 M. 알켁 재단에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 알 | Charles River Laboratories | Premium Fertile | 수정란, HH4 (16 hr) | |
| 실체현미경 | 현미경 | Leica Microsystems | MZ9.5 또는 유사 모델 | |
| Marsh 자동 배양기 | 기타 | Lyon | RX | |
| 곡선 핀셋 (1) | 도구 | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| 핀셋 (2) | 도구 | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| 미세 가위 | 도구 | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 플라스틱 접시 | 도구 | Falcon BD | 353001 | |
| 고무 벌브 | 도구 | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| 파스퇴르 모세관 피펫 | 도구 | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | 화염 위에서 끝을 둥글게 처리함 |
| 미세 해부용 칼 | 도구 | Fine Science Tools | 10056-12 | 고정 후 주변 막으로부터 배아를 절단하는 데 사용 |
| Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 경화제 및 베이스 | 시약 | Dow Corning | 0001986475 | 경화제 1부분과 베이스 9부분을 혼합; 37C에서 밤새(O/N) 굳힘 |
| 16% PFA | 시약 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | 시약 | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | 시약 | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | 시약 | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 1차 항체 | 시약 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | 이 항체들의 경우, 연구자들이 마우스 공여자를 사용함 |
| Peroxidase 접합 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | 시약 | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | 시약 | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | -20에서 보관; 사용 전 병을 상온(RT)으로 데울 것 |
| 삼나무유 | 시약 | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Fast green FCF | 시약 | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| 미뉴텐 핀 (지름 0.2mm) | Fine Science Tools | 26002-20 |
참고문헌
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
