이것은 유리 micropipettes의 모양을 수정하는 가이드입니다. 특히, 열 및 공기 압력을 사용하여 테이퍼가 낮은 피펫 저항을 선도 팁 오프닝을 증가하지 않고 확대됩니다. 이것은 작은 세포의 낮은 소음 녹음을 얻는 것이 중요합니다하지만 많은 응용 프로그램에서 유용합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
압력 연마는 패치 - 클램프 녹음 유리 pipettes을 형성하는 방법이다. 우리가 먼저 작은 (<3m)의 연결을 세포 기관에서 녹화에 적합한 pipettes를 fabricating이 방법을 개발했습니다. 기본 교장 유리 불어와 유사하며 일반 micropipette의 풀러 준비한 패치 pipettes의 모양을 수정하는 공기 압력과 열을 결합되어 있습니다. 이것은 소위 소프트 (소다 석회)와 하드 (borosilicate) 안경에 적용할 수 있습니다. 일반적으로 압력 연마는 팁 오프닝 (굿맨과 Lockery, 2000)의 직경을 감소하지 않고 25 % 피펫 저항을 줄일 수 있습니다. 이것은 유리의 거의 모든 유형에 적용 고압 밸브와 microforge에 맞는만을 추가 요구하실 수 있습니다. 이 기술은 ultrasmall 세포 (<5m)에서 녹음을 위해 필수적이며, 또한 피펫의 저항을 최소화하여 단일 채널 녹음을 향상시킬 수 있습니다. 무딘 모양이 천공 - 패치 클램프 녹음에도 유용합니다 천공에 사용할 수있는 큰 막 물집이 끝 모양 결과 때문이다.
프로토콜
풀링 pipettes
풀러와 같은 필라멘트를 사용하면 셔터는 P - 97 / 브라운 Microelectrode의 풀러 플라밍 약 10-20 pipettes 세트를 가져옵니다.
- 당신의 유리를 선택합니다. 우리는 borosilicate을 (BF150 - 86 - 10, OD = 1.5 mm, ID = 0.86 mm)을 사용합니다. 그것이 깨끗하고 먼지가 무료로 남아 있도록 신중하게 유리를 저장합니다.
- 당기는 프로그램을 디자인합니다. 기본 목표는 응용 프로그램에 따라 달라집니다 약 원하는 크기를 여는 팁입니다. 서터의 P - 97 피펫 요리책 2 훌륭한 참조입니다.
- 개방 직경과 매끄러운를 결정하는 현미경 아래 pipettes을 관찰. 거친 고르지 또는 불규칙 조언을 폐기하십시오. 표준 패치 클램프 녹음, 전반 2-4 μm의하는 팁 오프닝은 최고입니다. 무딘 팁은 선호하는 것과 동일한 오프닝 직경에 대한 저항을 낮은 발생합니다. 모양과 크기는 아래 연마하는 동안 수정할 수 있습니다.
압력 연마 pipettes
- 깨끗한 압축 공기 라인에 피펫 홀더를 연결합니다. 레귤레이터를 사용하여 ~ 40 PSI로 압축 공기 라인 압력을 설정합니다. 피펫 홀더 압력 및 해제할 수 수있는 4 방향 제어 밸브에 압축 공기 라인을 연결합니다. Tygon의 ⅛의 길이 ® 튜브와 제어 밸브에 피펫 홀더를 연결합니다.
- 고압 피펫 홀더, 피트 페달, 낮은 높은 배율, 오랜 실무 거리 (이상, 10X와 100x) 공기 목표 장착된 현미경에 의해 통제 연마 코일과 연마 장비 (microforge)를 사용하십시오. 이것은 프로토콜 동안 피펫 오픈을 관찰 수 있도록 중요합니다.
- 옵션 : 코트 용량을 감소하고 (이 기술에 대해 "풀링 pipettes"참조) 잡음 특성을 개선하기 위해 소수성 절연체로 피펫.
- 압력 밸브가 OFF 위치에 있는지 확인합니다. 피펫 홀더에 피펫을 놓고 손가락으로 꽉 맞는를 조입니다.
안전주의 : 피펫이 피펫 홀더에 단단히 개최하는 경우, 공기 압력은 피펫이 피펫 홀더에서 배출되는 원인이됩니다. - microforge의 피펫과 홀더를 놓으십시오. 현미경 단계에 위치 피펫 홀더 너무 팁 및 연마 코일 모두 microforge 부족 (10X) 전원에서 볼 수있다. ~ 75 미크론 필라멘트의 끝부분을 가져와. 가열하면 필라멘트가 확장됩니다 유의하십시오.
- 높은 전력 (100x) 목표로 전환합니다. 피펫 팁 및 연마 코일 모두 초점과 전망 분야에서해야합니다. 그렇지 않다면, 연마 코일의 높이를 조정합니다. (피펫의 위치를 조정할 수 없습니다.) 피펫 팁 및 연마 코일 볼 분야의 반대편에 가까운해야합니다. 그것은 가열로 확장하여 피펫 뛰어들고 있기 때문에 너무 피펫 팁 가까운 코일을 위치하지 마십시오.
- 피펫으로 압축 공기를 직접하기 위해 밸브를 돌려과 팁 뒤에 테이퍼가 바깥쪽을 풍선 시작 때까지 피펫 팁을 열.
- 끝 너무 광범위하게 풍선 전에 가열을 중지합니다. 실험은 원하는 형태에 해당하는 거리, 열, 시간을 결정하기 위해 필요합니다.
- 옵션 : 압력의 부재에있는 팁을 연마하여 팁 오프닝 직경을 절감할 수 있습니다. 단계 7과 8은 조정 피펫 팁의 형상과 크기 모두를 반복하실 수 있습니다.
- 압력을 끄고 안전한 방향으로 피펫 팁을 지적하면서, 피펫을 제거하고 그것 분진으로부터 보호됩니다 깨끗한 저장 상자에 넣습니다.
안전주의 : 공기 압력이 해제되지 않은 경우, 피펫가 제거하는 동안 피펫 홀더에서 꺼낼 수 있습니다.
microforge에 대한 참고 사항
우리는 재고품의 상용 부품의 조립 microforge을 사용합니다. (당신은 또한 몇몇 기업, 예를 들어, 에이러 과학, GlassWorx에서 압력 연마 키트를 구입할 수 있습니다.) 상관없이 microforge의 그것은 주로 직경 단지 몇 μm의입니다 팁 오프닝을 볼 승산이 충분 한가하는 광학을 가지고하는 것이 필수적입니다. 우리는이 목적을 위해 긴 작동 거리 100x 렌즈를 사용합니다. 또한, 코트 위해 높은 용해 온도 유리 연마 코일은 pipettes에서 증발 금속을 입금 최소화하기 위해.
파트 3 : 예상 결과
보통 압력 연마 직경을 열에 감지할 수있을 정도의 변화없이 피펫의 저항을 줄일 수 있습니다. 원하는 경우,이 프로토콜은 5 10MΩ 사이의 서브 마이크론 채용 및 resistances와 pipettes를 만들기 위해 사용할 수 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
우리는 원래 C로 2-3 μm의 뉴런에서 패치 - 클램프 녹음 pipettes 유용하게이 방법을 개발 엘레간스 1. 그것은 굿맨 실험실에서 일상 사용할 수 있습니다. 작은 C.에서뿐만 아니라, 레코딩을위한 우리 압력 폴란드어 pipettes 엘레간스의 뉴런뿐만 아니라 Xenopus oocytes의 표현 이온 채널의 macropatch 및 단일 채널 녹음을 얻는. 주어진 팁 - 오프닝 지름은 뭉툭한 형태는 낮은 저항 피펫을 생산하고 있습니다. 낮은 피펫 저항이 낮은 직렬 저항과 낮은 소음 녹음 발생합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
감사의 글
압력 연마 기법은 SR의 Lockery와 공동으로 개발되었습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| 유리 모세관 | 소모품 | Sutter Instrument Co. | BF150-85-10 (또는 유사 제품) | 이 방법은 석영으로 제작된 것을 제외한 모든 유형의 모세관에 적용 가능합니다. 다만, 필라멘트가 있는 모세관 사용을 권장합니다. |
| 倒立 현미경 | 현미경 | Leica Microsystems | DM IL (또는 유사 제품) | 일반적인 倒立 현미경이면 모두 가능합니다. 다만, 연마 중에 피펫을 확인할 수 있는 충분한 배율이 확보되어야 합니다. 이 목적으로 당사는 작동 거리가 긴 100x 금속 현미경 렌즈를 사용합니다. |
| 마이크로포지 키트 | 도구 | ALA Science | CPM-2 | 연마 코일, 컨트롤러 및 풋 페달이 제공됩니다. |
| 공기압 공급원 | 도구 | ALA Science | PR-60 | 고압 공급을 위한 액세서리로, 적절한 밸브가 포함되어 있습니다. 또는 필터/레귤레이터(40 PSI로 설정)와 4방향 밸브(아래 참조)를 사용하여 건물의 압축 공기를 사용할 수 있습니다. |
| 4방향 밸브 | 도구 | Cole-Parmer | A-98150-01 | 밸브를 튜브에 연결하기 위한 피팅이 필요합니다. |
| 루어 커넥터 포함 피펫 홀더 | 도구 | World Precision Instruments, Inc. | MPH-6S20 | 수루어-바브(male luer-to-barb) 피팅을 사용하여 피펫 홀더를 고압 튜브에 연결하십시오. |
| Tygon® 튜브 | 도구 | Cole-Parmer | 06408-62 | 이 튜브를 사용하여 피펫 홀더를 4방향 밸브에 연결하십시오. |
참고문헌
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
- Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
