2.2: 환경 과학의 무균 기술

1. 무균 작업 준비

1. 실험실 코트, 라텍스 또는 니트릴 장갑(눈물이나 구멍이 없는), 안전 고글(그림1)을획득하고 적용합니다. 화염을 사용하는 경우 안전을 위해 긴 머리를 다시 묶습니다.
   
   그림 1: PPE: 실험실 코트, 라텍스 장갑 및 안전 고글.
2. 무균 기술의 두 번째 중요한 측면은 실험실에서 사용되는 미디어 / 시약의 적절한 살균 및 저장입니다. 액체 국물매체(예:트립틱 콩 육수)와 한천계미디어(예:R2A)를 적절한 양의 건조염기 분말을 계량하여 준비하여 적절한 양의 이온화물에 첨가한다.
3. 국물 매체의 경우, 낮은 열이 적용된 핫 플레이트에 분말을 용해하고, 100mL 볼륨으로 유리 나사 상단 플라스크에 액체를 분배하거나 10mL 볼륨으로 유리 나사 탑 테스트 튜브에 분배합니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 파우더가 완전히 녹을 때까지 뜨거운 플레이트 교반기에서 아가로즈 배지를 저어줍니다.
4. 용기에 자동 클랩 테이프를 적용하고 제조업체의 지침에 따라 미디어를 자동 복제합니다(예 :121 °C에서 20 분)(그림 2 및 3). 오토클레이브 테이프의 줄무늬 색상은 흰색(자동 복제 전)에서 검은색(포스트 오토클레이브)으로 변경되어야 합니다. 색상 변화는 일반적으로 멸균이 성공했음을 나타내지만, 포자 스트립 키트를 사용하여 멸균 검사를 실시하여 오토클레이브 공정을 확인할 수 있습니다.
   
   그림 2: 재질에 적용중인 오토클레이브 테이프.
   
   그림 3: 자동 복제 테이프의 스트라이프 색상 변경내용은 흰색(자동 복제 전)에서 검은색(포스트 오토클레이브)으로 변경합니다.
5. 액체 국물을 실온으로 식힌 다음 실온에서 보관하거나 4 °C에서 냉장 보관하십시오.
6. 용기를 ~50°C로 설정하여 아가로즈 배지를 식힙니다. 식으면 미디어를 멸균 페트리 접시에 부을 수 있습니다. 매체가 냉각되고 고화되도록 한 다음 제조업체가 지정한 온도에서 저장을 통합합니다.
7. 고온이 중요한 성분을 저하시키면서 자동화할 수 없는 여러 종류의 문화 매체가 있습니다. 이러한 살균은 0.22 μm 필터를 사용하는 진공 여과 시스템을 사용하여 필터 살균이 필요하며 적절한 온도에서 보관해야 합니다.
8. 벤치탑에서 작업을 수행하기 전에 적절한용액(예:500ppm 표백제)을 사용하여 표면을 소독합니다. 이것은 작업 표면에서 문화 및 멸균 매체로 오염 물질을 전송의 위험을 낮춥다.
9. 멸균 필드를 설정하려면 분젠 버너를 켭니다. 금속 접종 루프를 살균하는 데 가장 적합한 화염 유형은 강렬한 푸른 불꽃이며 중간에 관찰된 파란색콘(그림 4)이있습니다.
   
   도 4: 한 페트리 플레이트로부터 박테리아의 이송이 배양된 분리물의 성장을 다른 무접종 페트리 플레이트로 표시하여 한천계 성장 배지를 함유하고 있다.
10. 불꽃의 가장 뜨거운 부분(파란색 원뿔 끝)을 천천히 전달합니다. 루프는 살균을 위해 빨간색 핫으로 바꿔야 합니다.

2. 세균 전달: 페트리 플레이트에서 페트리 플레이트까지

1. 박테리아를 옮기는 한 가지 시나리오는 배양된 분리의 성장을 다른 것으로 표시하는 페트리 플레이트에서, 한천 계 성장 배지를 함유한 멸균 페트리 플레이트이다.
2. 시작하려면 순수한 세균 배양을 포함하는 페트리 플레이트를 약간 열고 뜨거운 살균 된 접종 루프를 천 표면에 부드럽게 누릅니다.
3. 냉각된 접종 루프를 사용하여 플레이트 표면에서 분리된 콜로니 하나를 검색하고 페트리 플레이트를 닫습니다.
4. 배양 매체를 함유한 신선한 페트리 플레이트를 사용하여 뚜껑을 약간 아자르로 사용하여 절연을 위한 줄무늬를 수행합니다.
5. 격리 줄무늬의 각 부분(플레이트당 총 3개)에 대해 사용하기 직전에 염증 루프를 멸균합니다. 또한, 최종 줄무늬 직후루프를 살균하여 벤치 표면의 오염을 방지하고 나중에 사용하거나 접종 루프와 접촉할 수 있는 실험실내 다른 사람들에게 고려된다.
6. 줄무늬 접시를 하룻밤 동안 성장을 위한 인큐베이터에 넣습니다.

3. 세균 전달: 국물 문화에서 페트리 플레이트까지

1. 박테리아를 이송하는 두 번째 시나리오는 일반적으로 탁도에 의해 관찰되는 바와 같이 성장을 나타내는 국물 배양에서 성장 배지를 함유하는 멸균 페트리 플레이트로 나타낸다.
2. 순수한 세균 배양을 포함하는 시험관(또는 플라스크)에서 캡을 제거하고, 화염의 가장 뜨거운 부분을 통해 용기의 개구부를 2-3배 나통과한다. 오염을 방지하기 위해 캡을 벤치탑에 내려 놓지 마십시오.
3. 살균된 접종 루프를 튜브/플라스크로 조심스럽게 낮추고 용기 의 측면에 부드럽게 눌러 국물 배양물에 삽입하기 직전에 식힙니다.
4. 국물 배양(그림5)의루프를 제거하고 즉시 캡을 교체합니다.
   
   그림 5: 국물 문화의 한 루프.
5. 배양 매체를 함유한 신선한 페트리 플레이트를 사용하여 뚜껑을 약간 아자르로 사용하여 절연을 위한 줄무늬를 수행합니다.
6. 줄무늬의 각 부분(플레이트당 총 3개)에 대해 사용하기 직전에 염증 루프를 멸균합니다. 또한, 최종 줄무늬 직후루프를 살균하여 벤치 표면의 오염을 방지하고 나중에 접종 루프를 사용할 수 있는 실험실내 다른 사람들에게 고려된다.
7. 하룻밤 동안 성장을 위한 인큐베이터에 격리를 위해 줄무늬 판을 놓습니다.

4. 세균 전달: 성장이 있는 페트리 플레이트에서 멸균 액체 매체까지

1. 박테리아를 이송하는 세 번째 시나리오는 격리된 배양 줄무늬를 포함하는 페트리 플레이트에서 멸균 액체 성장 배지를 함유한 튜브/플라스크로 분리된 것입니다.
2. 순수한 세균 배양을 포함하는 페트리 플레이트를 약간 열고, 천 표면에 부드럽게 눌러 뜨거운 접종 루프를 냉각시.
3. 냉각된 접종 루프를 사용하여 플레이트 표면에서 분리된 콜로니 하나를 검색하고 페트리 플레이트를 닫습니다.
4. 멸균 액체 성장 배지를 함유한 시험관(또는 플라스크)에서 캡을 제거하고, 화염의 가장 뜨거운 부분을 통해 용기의 개구부를 2~3회 전달한다. 오염을 방지하기 위해 캡을 벤치탑에 내려 놓지마십시오.
5. 추출된 식민지를 액체 국물 배지로 조심스럽게 낮추고 박테리아를 방출하기 위해 루프를 부드럽게 교반합니다. 즉시 캡을 교체합니다.
6. 벤치 표면의 오염을 방지하고 나중에 접종 루프를 사용할 수 있는 실험실의 다른 사람들을 고려하여 접종 루프를 화염 멸균합니다.
7. 플라스크를 하룻밤 동안 성장을 위해 인큐베이터에 넣습니다.
8. 다음 날 인큐베이션에서 플라스크를 제거합니다. 문화를 열거하기 위해 희석 시리즈를 수행합니다.
9. 시리즈에서 희석을 아가로즈 문화 매체에 접시에 접시를 접시를 접시에 접시를 접시.
10. 다음날 플레이트를 제거하고 오염을 관찰하십시오.

5. 세균 전달: 국물 배양에서 멸균 액체 성장 매체에

1. 박테리아를 이송하는 네 번째 시나리오는 멸균 액체 성장 배지를 함유한 튜브/플라스크로 성장을 나타내는 국물 배양에서 이다.
2. 순수한 세균 배양을 포함하는 시험관(또는 플라스크)에서 캡을 제거하고, 불꽃의 가장 뜨거운 부분을 통해 용기의 개구부를 두 번 전달한다. 오염을 방지하기 위해 캡을 벤치탑에 내려 놓지 마십시오.
3. 튜브/플라스크에 접종 루프를 조심스럽게 내리고 용기 의 측면에 부드럽게 눌러 국물 배양에 삽입하기 직전에 식힙니다.
4. 국물 배양물 한 루프를 제거하고 즉시 캡을 교체합니다.
5. 멸균 액체 성장 배지를 함유한 시험관(또는 플라스크)에서 캡을 제거하고, 불꽃의 가장 뜨거운 부분을 통해 용기의 개구부를 두 번전달한다. 오염을 방지하기 위해 캡을 벤치탑에 내려 놓지 마십시오.
6. 추출된 루프를 멸균 액수 액수 배지로 조심스럽게 낮추고 박테리아를 방출하기 위해 루프를 부드럽게 교반합니다. 즉시 캡을 교체합니다.
7. 벤치 표면의 오염을 방지하고 나중에 접종 루프를 사용할 수 있는 실험실내 다른 사람들에게 고려하기 위해 접종루프(도 6)를화염멸균한다.
   
   그림 6: 분젠 버너로 살균되는 동안 빨간색 뜨겁게 변하는 반복 루프.
8. 플라스크를 하룻밤 동안 성장을 위해 인큐베이터에 넣습니다.
9. 다음 날 인큐베이션에서 플라스크를 제거합니다. 문화를 열거하기 위해 희석 시리즈를 수행합니다.
10. 시리즈에서 희석을 아가로즈 문화 매체에 접시에 접시를 접시를 접시에 접시를 접시.
11. 다음날 플레이트를 제거하고 오염을 관찰하십시오.

무균 기술은 미생물학의 기본 기술이며 환경 연구에서 중요한 응용 분야를 가지고 있습니다.

미생물 배양액이 오염되면 실험실에서 배양물, 특히 고유한 환경에서 드물게 분리된 배양물을 "청소"하거나 교체하는 데 필요한 시간, 노동력 및 재정적 비용이 매우 높고 엄두가 나지 않을 수 있으며 일부 샘플은 대체 불가능할 수 있습니다.

무균 기술을 적절하게 사용하면 시약, 배양 배지 및 환경 시료의 박테리아 및 곰팡이 오염 가능성을 줄이고 시료 간의 교차 오염을 방지할 수 있습니다. 또한 실험자에게 미생물이 전염될 가능성을 줄이는 안전 조치이기도 하며, 이는 병원체로 작업할 때 특히 중요합니다.

이 비디오는 무균 살균의 원리를 소개합니다. 멸균 시약 및 배양을 유지하기 위한 몇 가지 중요한 기술; 마지막으로 환경 과학에서의 일부 용도입니다.

무균 기술을 사용하는 목적은 생물학적 샘플의 오염을 최소화하기 위해 멸균 작업 환경, 장비 및 시약을 만들고 유지하는 것입니다. 일반적인 오염원에는 공기 중 미생물, 실험실 벤치 또는 장비에 존재하는 미생물, 연구원의 머리카락, 신체 및 의복에 있는 미생물이 포함됩니다.

실험실에서 오염을 제거하거나 예방하는 데 핵심적인 두 가지 유형의 작용제는 소독 화학 물질과 열입니다. 70% 에탄올 및 희석된 표백제와 같은 용액은 무균 작업에 참여하기 전에 장비, 작업 표면 및 실험자의 장갑을 소독하는 데 자주 사용됩니다.

동시에 도구, 유리 제품 및 액체 매체 위 또는 내부의 미생물은 고온 가압 증기에 노출되어 내용물을 살균하는 챔버인 오토클레이브에서 열을 죽일 수 있습니다. 또한 스프레드 도금에 사용되는 유리 막대 및 금속 접종 루프와 같은 도구는 분젠 버너와 같은 화염원을 사용하여 열 살균 할 수 있습니다.

화염원의 사용은 또한 무균 작업 환경을 구축하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 화염의 열은 공기 대류를 일으켜 버너 부근에서 공기 중 오염 물질을 들어 올리는 상승 기류를 생성하고 무균 실험 작업을 수행할 수 있는 "멸균 필드"를 생성합니다.

이제 무균 기술의 원리와 이것이 중요한 이유를 이해했으므로 무균 작업 환경을 조성하고, 멸균 성장 배지를 구성하고, 서로 다른 배양 조건 간에 박테리아를 무균으로 이동시키기 위한 프로토콜을 살펴보겠습니다.

무균 작업을 시작하기 전에 실험자가 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하는 것이 중요합니다. 이것의 목적은 실험자가 샘플과 실험실 배양을 오염시키는 것을 방지하고 잠재적으로 병원성 미생물이 연구자에게 전염되는 것을 방지하는 것입니다. PPE 품목에는 실험실 가운, 장갑 및 안전 고글이 포함됩니다.

다음 단계는 미생물 샘플을 배양하는 데 사용할 성장 배지를 적절하게 멸균하고 보관하는 것입니다. 먼저, 적절한 양의 고체 매체 성분의 무게를 측정하고 오토클레이브 용기에 탈이온수와 같이 제조업체가 지정한 적절한 양의 액체 용매에 추가합니다. 마그네틱 교반 막대를 추가하고 용기를 핫 플레이트 교반기에 놓고 약한 열과 교반으로 고체 매체 성분을 용해합니다.

매체 용기를 닫습니다. 나사식 캡이 있는 유리 용기를 사용하는 경우 고압증기멸균 중 가열로 인해 용기 내부의 공기가 팽창하여 빠져나가야 하므로 캡을 완전히 조이지 마십시오. 탈출하지 않으면 가스로 인해 혈관이 파열될 수 있습니다. 용기에 오토클레이브 테이프를 붙이고 제조업체의 지침에 따라 매체를 오토클레이브합니다(예: 20°C에서 121분). 오토클레이브 후 오토클레이브 테이프의 줄무늬가 검게 변하여 적절한 온도에 도달했음을 나타내는지 확인합니다.

액체 성장 매체의 경우 실온으로 식힌 후 실온 또는 적절하게 냉장 보관합니다. 한천 기반 고체 성장 매체의 경우 약 50으로 식히십시오. C, 그런 다음 멸균 페트리 접시에 붓습니다. 적절한 온도에서 보관하기 전에 한천을 식히고 응고시키십시오.

열에 민감한 구성 요소가 있어 고압증기멸균할 수 없는 매체의 경우 0.22μm 필터를 사용하여 필터를 살균합니다.

미생물 작업의 핵심 기술은 고체와 액체의 서로 다른 성장 매체 간에 박테리아 배양을 무균 방식으로 전달하는 것입니다. 시작하기 전에 소독제로 실험실 벤치 표면을 청소하십시오. 이는 배양 또는 멸균 매체의 오염 위험을 낮춥니다.

박테리아 배양을 옮기는 것은 일반적으로 접종 루프(inoculating loop)라고 하는 도구를 사용하는데, 이는 화염에서 가열하여 사용하기 전에 살균해야 합니다.

화염원을 켭니다. 불꽃의 끝을 통해 접종 루프를 천천히 통과시킵니다. 루프가 빨간색으로 뜨거워집니다. 단단한 한천 플레이트에서 박테리아 군집을 옮기려면 페트리 플레이트를 약간 열고 뜨거운 접종 루프를 한천 표면의 빈 부분에 부드럽게 두드려 박테리아가 열을 죽이는 것을 방지합니다. 접종 루프로 단일 콜로니를 긁어내고 플레이트를 닫습니다.

액체 성장 배지에서 박테리아를 옮기려면 배양 용기에서 캡을 제거하십시오. 오염을 방지하려면 캡을 벤치에 내려놓지 마십시오. 화염의 가장 뜨거운 부분을 통해 용기의 입구를 2-3회 통과시킵니다. 그런 다음 뜨겁고 살균된 접종 루프를 용기 내부에 조심스럽게 만지고 식힌 후 육수 배양액에 삽입합니다. 배양물의 고리 하나를 제거하고 즉시 뚜껑을 닫으십시오.

얻어진 박테리아를 멸균 성장 매체로 옮기려면 멸균 육수가 담긴 용기의 캡을 제거하고 용기의 입구를 화염에 2-3회 통과시킵니다. 그런 다음 접종 루프를 배지로 조심스럽게 내리고 부드럽게 저어 박테리아를 방출합니다. 즉시 캡을 닫으십시오. 사용 후에는 접종 루프를 소독하십시오.

멸균 한천 플레이트에 박테리아를 옮기는 경우 접종하지 않은 한천으로 새 페트리 플레이트의 뚜껑을 엽니다. 박테리아 배양액이 있는 접종 루프를 한천의 한 구역을 가로질러 앞뒤로 줄무늬를 만듭니다. 루프를 살균하고 한천의 빈 부분을 만져 식힌 다음 첫 번째 줄무늬에 둔각한 각도로 한천에 또 다른 줄무늬를 만들고 처음 1-2 스트로크에서 첫 번째 줄무늬를 교차하되 다음 스트로크에서 첫 번째 줄무늬를 건드리지 마십시오. 살균과 줄무늬를 2회 더 반복합니다. 페트리 플레이트를 닫고 접종 루프를 살균합니다.

접종이 완료되면 배지 또는 한천 플레이트를 주어진 미생물이 생존 가능한 배양을 얻을 수 있도록 이상적인 성장 온도에서 배양해야 합니다. 고체 매체에서는 처음 두 줄무늬로 덮인 한천에서 잔디밭 또는 연속적인 박테리아 가닥을 볼 수 있지만 개별 군집은 마지막 줄무늬에서 얻어야 합니다. 잘못된 무균 기술은 플레이트에 곰팡이 및 기타 오염 물질이 자랄 수 있습니다.

무균 기술은 환경의 미생물 샘플과 관련된 많은 실험에서 중요합니다. 이 연구에서 연구진은 박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지(bacteriophage)를 일반적인 토양 박테리아인 아트로박터(Arthrobacter)에서 분리했습니다. 절지박터 배양은 처음에는 무균 조건에서 성장했습니다. 그런 다음 토양 샘플을 세척하고 파지 완충액에서 여과하고, 파지 용액을 박테리아 배양액과 혼합하여 한천 플레이트에 도금했습니다. 접시 위에 박테리아 잔디가 형성되지만 바이러스가 박테리아를 감염시켜 죽인 지점에는 청소부 또는 "플라크"가 있습니다. 그런 다음 추가 연구를 위해 이러한 플라크에서 파지를 정제할 수 있습니다.

분젠 버너를 사용하는 것 외에도 무균 작업 환경은 제균 상태를 유지하기 위해 직접 공기 흐름과 필터를 사용하는 층류 후드로 알려진 특수 워크스테이션에서 유지할 수 있습니다. 여기에서 과학자들은 물 샘플에서 잠재적인 병원성 박테리아와 바이러스를 분리하기 위해 플로우 후드에서 작업했습니다. 이러한 분리물은 그런 다음 아메바와 함께 배양되었습니다. 아메바는 일반적으로 박테리아를 먹거나 "식세포(phagocytose)"하기 때문에 아메바 소화에 저항할 수 있고 이러한 유기체에 남아 있는 모든 박테리아는 잠재적으로 인간 세포에서 생존할 수 있으며 질병을 유발할 수 있습니다.

마지막으로, 무균 조건은 콩과 식물의 뿌리 결절 형성과 같은 생태 학적 메커니즘에 대한 상세한 연구를 가능하게합니다 - 대기 중 질소를 암모니아로 "고정"하여 식물이 성장을 위해 사용하는 박테리아로 채워진 기관. 이곳의 연구원들은 식물 성장 배지가 있는 노치가 있는 페트리 플레이트를 사용하여 결절 과정을 연구하기 위한 "소우주"를 만들고 묘목을 그 안에 넣고 묘목에 결절을 형성하는 뿌리 줄기 박테리아를 접종했습니다. 플로우 후드의 무균 환경은 배양물이 다른 박테리아 또는 곰팡이로 오염되는 것을 방지합니다.

환경 과학의 무균 기술에 대한 JoVE의 비디오를 시청하셨습니다. 이제 무균 작업 조건이 왜 중요한지 이해해야 합니다. 미생물 실험을 무균 적으로 수행하는 방법; 환경 연구에 대한 무균 기술의 일부 응용. 언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!