Name: Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: 배우세요 평행판 유동 챔버 분석을 통해 생리적 전단 응력 조건에서 백혈구의 E-셀렉틴 의존성 롤링을 연구하는 방법을. 이 기술은 염증 및 면역 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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건강 / 미 국립 암연 구소 (NCI) 그랜트 (찰스 J. Dimitroff에 RO1CA118124)의 국립 연구소,,이 프로젝트에 대해 자금은 미국 암 협회의 연구 학술 상, (찰스 J. Dimitroff에 06-024 - 01 - CSM)에 의해 제공되었으며 관절염과 Musculoskeletal 보건 / 국립 연구소 및 피부 질환 부여의 국립 연구소 (박사 토마스 S. Kupper에 P30 AR042689, 브리검 앤드 위민스 병원, 보스톤, MA).

1. 흐름 챔버에 대한 배양 접시에 hBMEC의 준비 (HBMEC - 60 세포) Monolayer <ol><li> 코트 35 37 4 박 20μg/ml의 fibronectin의 2ml (PBS)을 ° C로 3 시간 동안 X 10mm 조직 문화 요리 ° C. </li><li> 요리 fibronectin 솔루션을 기음과 1.5 X10 5 HBMEC - 60 세포를 추가 HEPES 및 글루타민과 함께 [매체 199 10% FBS 10 % 인간 세럼, 5 단위 / ML의 헤파린, 1ng/ml 재조합 인간 fibroblast의 성장 인자, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신] 요리와 그들이&gt; 90 % 합류로 성장할 수 있도록. (이 2 일이 소요) </li><li> 성장 미디어를 기음과, E - selectin 표현을 상향 조절, 4-6 시간에 대한 IL - 1β 50ng/mL 신선한 매체를 추가하십시오. 세포 monolayers 이제 분석을 압연에 대한 준비가되어 있습니다. 안티 - 인간의 E - selectin 모아브 (클론 BBIG - E4 (5D11)가) 37시 ~ 1 시간에 대한 20μg/ml에 추가할 수 있습니다 ° C.를 끄고, E - selectin 기능을 차단하려면 </li></ol> 2. 흐름 챔버에 대한 인간의 조혈 전구 KG1a 전지의 준비 <ol><li> 인간 조혈 전구 KG1a 세포는 글루타민과 함께 RPMI - 1640에 (1x10 6 셀 / ML) confluency로 성장와 10 % FBS / 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신과 흐름 챔버 분석에 사용하기 위해 술병에서 직접 pipetted입니다. </li><li> 휴대폰 번호는 hemacytometer 후 세포가 10mM HEPES (H / H 버퍼)와 2mM CaCl 2 HBSS 1 X 10 6 세포 / ML에서 다시 보류 아르를 사용하여 계산됩니다 </li><li> 세포 분석에 사용할 때까지 얼음에 저장됩니다. </li></ol> 3. 현미경, 병렬 플레이트 흐름 회의소와 주사기 펌프 (그림 1)의 준비 <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_7/1009_figure1.png" alt="그림 1" width="600" height="409" /> 그림 1. 병렬 플레이트 흐름 회의소 분석의 일러스트. 거꾸로 현미경, 하버드 주사기 펌프, 컴퓨터 / 카메라 및 병렬 플레이트 흐름 챔버는 효율적이고 재현성 세포 분석을위한 최적의 배열에 배치됩니다. <ol><li> 주사기 펌프로 거꾸로 현미경과 전원 전원 및 광원의 전원을 켜고 현미경에 10X 목표를 선택합니다. </li><li> 홀더에 50mL 원뿔 튜브를 삽입하고 H / H 및 2mM CaCl 2 입력합니다. </li><li> 50mL 원뿔 튜브 아래의 테스트 튜브 홀더에 넣어 5ml 플라스틱 테스트 튜브 </li><li> (주사기의 플런저과 몸 모두가 모두 확보되어 있는지 예정) 주사기 펌프에 60mL 주사기를 배치합니다. </li><li> 60mL 주사기 끝 3 방향 정류장 - 콕에 5mL 주사기를 연결 중지 - 수탉 3 방법을 첨부합니다. </li><li> 오른쪽에있는 입력 튜브, 뒤로 왼쪽과 진공관 출력 튜브와 함께 현미경 무대 플레이스 병렬 흐름 회의소 장치 (GlycoTech 주식 회사). </li><li> 병렬 플레이트 장치가 무대에 맞게 수 있도록 진공 야외 밸브에 진공 튜브를 연결합니다. (이 테스트 흐름 챔버에서 진공 스커트가 빵빵한 경우.) 공기 밸브를 끄십시오. </li><li> 출력 튜브 라인 (현미경의 가장 왼쪽에) 3 방향 중지 - 물건에 연결합니다. 장치는 현재 HBMEC - 60 monolayer 플레이트에 삽입하기위한 준비가되어 있습니다. </li><li> 현미경의 중심에 자리 HBMEC - 60 monolayer 판과 장소. </li><li> 진공 및 위치 monolayer 판은 중앙에있다 것과 같은 접시 위의 흐름 챔버 장치를 켭니다. </li><li> 부드럽게 HBMEC - 60 monolayer 판에 흐름 챔버 장치를 낮추고 흐름 챔버 장치가 다운 흡입 수 있습니다. (가 이스케이프 공기도 소리이어야하며이 시점에서 당신은 고무 가스켓을 압축 챔버에 압력을 적용해야 할 수도 있습니다.) </li><li> 일단 진공 곳에 입력 튜브 2mM CaCl 2와 H / H를 포함하는 50mL 원뿔 튜브로 (오른쪽)에 설립되었습니다. </li><li> 오픈 3 방향 정류장 - 콕에서 60mL 주사기와 장소 펌프로 흐름을 허용하는 &#39;펌프 모드. &quot; </li><li> 접시에있는 세포를 운반하지 않고 입력 / 출력 라인에서 공기를 제거하려면 액체가 장비에 도달 ML / 분 직전에 다음 신속하게 0.5으로 설정, 흡기 관을 채우기 위해 2mL/minute에서 설정 주사기 펌프를 사용합니다. 이 신중하게 설정하고 접시에서 monolayer 사하여 주실 공기 방울을 방지하기 위해 필수적인 주요 좋습니다. </li><li> 유체가 60ml 주사기, 흐름 챔버와 주사기 펌프로 이동을 볼되면 제일 먼저 처리 해달 흐름 챔버 사용할 준비가되었습니다. 이 설정은 최대 각 셀에 입력 실행 및 필요한 각 새 접시에 대해 반복됩니다. </li></ol> 4. NIS 요소를 사용하여 백혈구 롤링 이벤트 캡처 <ol><li> 바탕 화면에 열려 NIS 요소. </li><li> 보도 라이브 이미지에 대한 아이콘을 &quot;놀이&quot;. 자동 노출은 지금은 접시보다 쉽게​​ 볼 수 있도록하고 초점에 중요합니다. </li><li> 현미경은 세포 monolayer에 제대로 초점을 맞추고 있는지 확인합니다. </li><li> 현미경 1 프레임 / 초 및 조정 불빛에 일단 초점을 맞추고, 다시 설정 노출. 이미지가 컴퓨터에 표시하고 더 이상 낮은 조명 레벨로 인해 현미경 뷰파인더에서 확인할 수 없습니다. 라이트 히스토그램 그러면 광고 수배경 노출을 제거하거나 셀 선명도를 개선하기 justed. </li><li> 동영상 캡쳐에 이상적입니다 그림을 얻기 위해 2X2 빈 또는 라이브 빈 클릭하십시오 </li><li> 메뉴 표시줄에서 &quot;매크로&quot;을 클릭하고 &quot;포트에 쓰기&quot;를 선택, 선택 포트 &quot;com3,&quot;와 &quot;개방&quot;. (이것은 주사기 펌프와 협력하기 위해 포트를 엽니다. </li><li> 다음 피펫 입력 튜브 라인 근처 5ml 테스트 튜브에 KG1a의 세포 현탁액의 1mL 및 테스트 튜브의 맨 아래에 입력 튜브 라인을 넣으십시오. </li><li> 메뉴 표시줄로 이동은 &quot;캡처&quot;를 클릭, &quot;시간 저속 수집.&quot; </li><li> 새 메뉴가 나타납니다. 프로토콜 지속 2백10초을 선택하고,이 HBMEC - 60 세포 압연에 대한 프로그램의 길이입니다. (각 단계는 그림에게 펌프 프로토콜의 기간 동안 매초마다을하는 프로그램입니다. 또한 펌프를 시작합니다 com3 포트를 통해 명령을 보내도록 설정되어 있습니다.) 시간이 경과가 중단되면 펌프가 멈추지 않을거야 자체 및 재설정해야합니다. 이미지를 라이브로 돌아가려면 취소를 누릅니다. </li><li> 사용 설명서에 따라 &quot;프로그램 모드&quot;로 주사기 펌프를 설정합니다. (프로그램 모드가 특정 흐름 속도 (즉, 전단 응력 수준) 챔버 내에 이수하고 HBMEC - 60 세포 monolayer 이상 KG1a 세포 상호 작용을 지시하는 수동으로 프로그래밍 가능합니다.) hBMEC 세포에서 압연 KG1a 세포에 대한 설정했던 것은 같은 4.2 다인즈을 따릅니다 / 45 S에 대한 cm 2, 0.3 다인즈 / 60 s에 대한 cm 2, stepwise 증가 매 15의 4.2 다인즈 / cm 2 최대 </li><li> 챔버 벽의 전단 응력 (W 일)은 다음 등식에 따라 계산 : W ST / ML의 체적 유량입니다 Q μ는 매체의 예상 점도 (0.0076 P)입니다 = 6μQ / 2 B, S는이 cm에서 채널 높이 (가스켓 두께) (0.03 ㎝)이고, B는 cm (0.5 cm)의 채널 폭입니다. 유량은 주사기 펌프의 프로그램 모드를 사용하여 규제되었습니다. </li><li> 현미경과 컴퓨터는 이제 시간 저속도 촬영을 캡처하는 준비가되어 있습니다. 보도 자료를 획득 시작 컴퓨터에서 &quot;실행 시작&quot;. 프로그램을 실행하는 동안 (기포가가 없는지 확인) 매체의 입 / 출력 튜브가 가득 유지하기 위해 KG1a 세포가 들어있는 시험관에 미디어를 추가하십시오. </li></ol> 5. 터미널 Sialylation 및 E - selectin - 중재 KG1a 전지 5 표면 당단백질의 의존성. (; 5.1-5.5의 비디오 클립 그림 2) 롤링 <ol><li> 에 압연 KG1a 세포의 시금 비 자극 HBMEC - 60 세포. (대조군) KG1a 세포가 준비 이상 흐름 챔버에 주입되었다 라이브가 아닌 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 위에서 설명한. </li><li> HBMEC - 60 세포를 IL - 1β와 사전 처리의 롤링 KG1a 세포의 시금. (E - selectin - 의존도 제어) KG1a 세포가 이상 흐름 챔버로 준비하고 주입되었다 라이브 IL - 1β 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60. </li><li> IL - 1β 그리고 중화 방지 인간 E - selectin 모압. (E - selectin - 의존도 제어) KG1a 세포가 라이브를 통해 흐름 챔버로 준비하고 주입되었다 IL - 사전 처리 HBMEC - 60 세포에서 압연 KG1a 세포의 시금 위에서 설명한 안티 - 인간의 E - selectin 모압을 무효화와 1β 자극 HBMEC - 60 pretreated. </li><li> IL - 1β 자극 HBMEC - 60의 롤링 sialidase - 소화 KG1a 세포의 시금. 37 1 시간에 대한 neuraminidase 0.1U/ml 장염 Cholerae ° C와 pretreated KG1a 세포가 이상 흐름 챔버로 준비하고 주입했다 IL - 1β 라이브 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60. </li><li> IL - 1β 자극 HBMEC - 60의 롤링 프로 테아제 - 소화 KG1a 세포의 시금. 단백 분해 효소와 pretreated KG1a 세포는, 37에서 1 시간에 대한 0.2U/ml의 브로 멜 라인 ° C가 넘는 흐름 챔버로 준비하고 주입했다 IL - 1β 라이브 자극 위에서 설명한 HBMEC - 60. </li></ol> 6. NIS - 요소 - 캡처된 KG1a 세포의 KG1a 셀 및 그래프 롤링 데이터의 분석 <ol><li> 시간 순서가 취득 후 데이터를 저장합니다. </li><li> 메뉴 표시줄에서 &quot;측정&quot;탭으로 이동을 선택하십시오 &quot;임계값을 정의합니다.&quot; 원하는 세포가 붉은 색 있도록 막대를 이동합니다. &quot;모든 이미지&quot;다음 &quot;자&quot;를 선택하십시오. 전체 시간 경과 순서는 현재 보이는 붉은 구름 전지 수정해야합니다. </li><li> &quot;측정&quot;을 선택 이동 &quot;제한.&quot; (제한 사항은 사용자가 압연 세포를 대변하지 않습니다 thresholded 개체를 제외하실 수 있습니다. 이것은 주로 HBMEC - 60 monolayer 만든 배경입니다.) &quot;지역&quot;과 압연 세포에 대한 지역에 대한 입력 분 및 최대 값을 선택합니다. &quot;신장&quot;과이 단계를 반복합니다 &quot;순환성합니다.&quot; </li><li> &quot;측정&quot;을 선택하고 &quot;제한을 사용하여 바이너리를 생성&quot;을 선택하고, HBMEC - 60 세포 monolayer에 압연 세포의 NIS - 요소 소프트웨어 인식을 최적화하기 위해 제한 값을 설정합니다. </li><li> &quot;측정&quot;, &quot;필드 데이터&quot;를 선택한 다음 &quot;초기화 데이터&quot;를 선택으로 돌아갑니다. 이 메뉴를 닫습니다. </li><li> &quot;측정&quot;과 SE (으)로 돌아가기&quot;스캔 필드를&quot;lect. </li><li> 열기 &quot;법안&quot;은, &quot;필드 데이터&quot;, &quot;숫자 또는 개체&quot;를 선택하고 &quot;모든 필드&quot;를 선택하고 Microsoft Excel로 데이터를 내보낼 수 있습니다. </li><li> 다음 데이터 수집을위한 NIS - 요소 세포 인수를 준비하는 &quot;명확한 데이터&quot;를 선택하십시오. </li></ol> 결과 : <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_8/1009_figure3.png" alt="그림 3" width="600" height="382" /> 그림 3. KG1a 셀에서 E - selectin 바인딩 활동 병렬 플레이트 흐름 회의소 분석. sialidase이나 단백 분해 효소로 처리 KG1a 세포는 HBMEC - 60 세포를 IL - 1β와 사전 처리의 monolayers에 대한 효율성을 압연에 대해 분석했다. 실험 롤링 대조군도 아닌 IL - 1β 자극 HBMEC -60 세포 또는 압연 KG1a 세포 분석을 실시했다 IL - 1β 자극 반 인간 E - selectin 모아브 (5D11)을 중화 취급 HBMEC - 60 세포. 세포 회전 주파수는 세중의에서 수행하고 NIS - 요소 소프트웨어로 분석했다. (* 통계 의미, P는 &lt;0.001) physiologic 전단 응력 조건 하에서 내피 세포의 상호 작용 -이 비디오 기반의 보고서에서, 우리는 백혈구를 분석하는 방법에 대한 시각적 묘사를 제공했습니다. 백혈구 tethering을 중재하고, 같은 integrins 및 hyaluronan 수용체와 같은 수용체를 통해 중등 더 안정적인 구속력이 활동의​​ 노력에 필요한 접착제 행동을 압연에서 E - selectin 리간드 - 특히, 우리는 E - selectin의 역할을 분석. 거꾸로 현미경, 하버드 주사기 펌프, 비디오 카메라와 컴퓨터 / 셀 수집 하드웨어와 함께 사용하기위한 적응 병렬 플레이트 흐름 챔버를 사용하여, 우리는 실험 E - selectin 리간드 궁극적으로 실시 + KG1a 세포는 우리의 백혈구 모델과 hBMEC 세포로 사용되었다 (HBMEC - 프로 염증성 시토킨, IL - 1β로 자극 60), 우리 E - selectin + 인간 내피 세포 모델 (1-6)로 사용되었습니다. 이전에보고, 우리는에서 압연 강력한 KG1a 세포를 관찰 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 E - selectin에 의존 방식으로 (그림 3) (KG1a 세포가 압연에 비해 통계적으로 중요한 차이 전단 응력 수준의 범위에서 셀 비 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 세포). 비 IL - 1β 자극 HBMEC - 60 세포에서 또는 압연 KG1a 세포로 구성되어 부정적인 컨트롤, IL - 1β 자극 반 인간 E - selectin mAb와 HBEMC - 60 세포 pretreated, 의존을 설명하기 위해 병렬로 진행되었다 롤링 활동 시토킨 자극과 E - selectin 표현 (그림 3). 비브리오 cholerae와 pretreated KG1a 세포뿐만 아니라, 압연 분석 neuraminidase (sialidase) 또는 브로 멜 라인, 표면 E - selectin 당단백질의 리간드를 소화 알려져 아닌 특정 프로 테아제와가 E - selectin 리간드에 대한 터미널 sialic 산성 잔류물 및 표면 당단백질의 중요성을 강조 활동 (2,3).

<ol><li>Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+leukocytic+migration+to+inflamed+skin+with+a+novel+fluorosugar+modifier+of+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen.</a> J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 Forthcoming.</li>
<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li>
<li>Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+leukocyte+E-selectin+ligands%2C+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+and+E-selectin+ligand-1%2C+on+human+metastatic+prostate+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells.</a> Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).</li>
<li>Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ameliorating+Skin-Homing+Receptors+on+Malignant+T+cells+with+a+Fluorosugar+Analog+of+N-acetylglucosamine%3A+P-selectin+Ligand+is+a+More+Sensitive+Target+than+E-selectin+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand.</a> J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).</li>
<li>Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-homing+receptors+on+effector+leukocytes+are+differentially+sensitive+to+glyco-metabolic+antagonism+in+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis.</a> J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).</li>
<li>Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+bone+marrow+endothelial+cells%3A+characterisation+of+new+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines.</a> Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).</li>
</ol>

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병렬 플레이트 흐름 챔버 분석 백혈구를 공부에 사용되는 시험 관내 분석 시스템의 전문입니다 - 유사한 전단 응력 조건 하에서 내피 접착 상호 작용 후 모세관 venule의 표면에 이수 사람. 백혈구 tethering을 중재하고 활성화 microvascular의 내피의 표면에 압연에서 E - selectin 리간드 - 여기로 우리의 시각적인 표현에 묘사된, 우리는 E - selectin의 역할을 조사하는이 시스템의 가치를 보여줍니다. 우리는 또한 프로 테아제, glycosidase이 시스템에서 E - selectin과 리간드의 역할을 elucidating에 대한 차단 항체 치료의 응용 프로그램을 공개. 이러한 분석은 매우 재현성 있으며, E - selectin 연구를위한 실험적인 근거 형태 도움말 - 생체내에서 E - selectin 리간드 기능을. 시토킨 - 활성 microvascular 내피 세포 (hBMEC 또는 인간 제대 정맥이나 피부 microvascular 내피 세포)의 monolayers와 세포 부착을 공부 이외에 assays은 기판으로 재조합 E - selectin 인간 또는 E - selectin - IG 키메라 분자를 정화 사용하여 수행할 수 세포 접착하십시오. 기타 접착제 상호 작용은 백혈구 (P) (L -) - selectin 및 혈소판 - selectin은 또한 병렬 플레이트 흐름 챔버 기술을 사용하여 assayed 수 있습니다 통해 중재. 세포 monolayer / 단백질 기판의 종류를 변화하거나 입력 백혈구 / selectin - transfectant 세포 모델의 조사는 physiologic 전단 응력 조건 하에서 이러한 상호 작용의 역할을 공부할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6178-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>평행판 유량 챔버 키트</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>PHD2000 프로그래밍 가능 시린지 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>35x10mm 조직 배양 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin, 인간 혈장 유래</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86088-83-7 F2006-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Interleukin-1_, 인간; 재조합</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9401-5UG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank s 완충 식염수 용액)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (HEPES &amp;amp; Glutamine 함유)</td><td>Invitrogen</td><td>12320-039</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈청</td><td>Innovative Research, Inc.</td><td>IPLA-SER1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Abraxis BioScience</td><td>504011</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 섬유아세포 성장 인자</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 시험관</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human E-selectin 클론 BBIG-E4(5D11)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BBA16</td><td></td></tr><tr><td>Bromelain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-4882</td><td></td></tr></tbody></table>

microvascular 내피에 physiologic e - selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

E - selectin은 피부, 뼈 및 염증 조직에 leukocytes 순환 모집을 시작하는 데 도움이 microvascular 내피 세포에 종류 - 1 막 단백질이다. E - selectin의 표현이 피부와 뼈가 microvessels에 제정되고 같은 염증 조직에서 IL - 1α 및 / TNF - α, microvessels 등 프로 염증 크린 시토킨에 의해 inducible 있습니다. 이 렉틴과 수용체는 mediates 특성 회전 동작의 결과를 순환 leukocytes에 탄수화물 카운터 - 수용체의 리간드와 상호 작용을 약한 구속력. 이러한 상호 작용은보다 안정 접착제 이벤트 및 diapedesis 활동, 백혈구 압연 활동의 특성화 및 백혈구 E - selectin의 리간드의 신분을 앞에 있기 때문에 백혈구 인신 매매 및 염증의 연구 및 안티 - 염증성 치료제의 개발 (1-5)의 주요 목표를했습니다 . 이 보고서의 목적은 physiologic 혈액 흐름 조건 E - selectin E - selectin의 리간드 상호 작용을 연구에 가장 널리 사용되는 기술의 시각, 포괄적인 설명을 제공하는 것입니다. 하버드 피부 질환 연구 센터와 함께 우리 연구실은 디지털 시각화하고 새 레코딩 소프트웨어, NIS - 요소와 함께 최첨단가 병렬 플레이트 흐름 챔버 장치를 사용합니다. 이 기술은 우리가 화면의 시각화뿐만 아니라 비디오 형식으로 기록 롤링 활동을 실시간으로 접착 이벤트를 분석할 수 있습니다. 같은 주파수, 전단 저항을 압연 및 바인딩 / 효율성을 tethering 같은 세포 접착 매개 변수, Excel 스프레드 시트에 수출 및 통계 분석의 대상, NIS - 요소 소프트웨어로 계산됩니다. 데모 여기에 제시, 우리는 살고 인간 골수 내피 세포 (hBMEC)에서 E - selectin에 의존 백혈구 압연 활동을 조사하기 위해 병렬 플레이트 흐름 챔버를 채용. 불후의 hBMEC 세포 라인, HBMEC - 60 세포, 우리의 내피 세포 모델 (6)로 사용하는 동안 E - selectin 리간드의 높은 수준을 표현하는 인간의 조혈 전구 KG1a 세포는, 우리 백혈구 모델로 사용되었습니다. 유도 및 시뮬레이션 네이티브 E - selectin 표현 흐름 챔버에서 HBMEC - 60 세포를 처음 IL - 1이 활성화되었습니다.하려면 우리의 비디오 프레 젠 테이션은 병렬 플레이트 흐름 분석 프로 테아제 또는 glycosidase을 구현하여 ascertained 수있는 흐름 챔버에 physiologic E - selectin - 중재 백혈구 압연 활동 및 백혈구 E - selectin 리간드 (S)의 기능 특성을 공부에 적합한 방법입니다했다 digestions.

이 보고서는 physiologic 전단 응력 하에서 백혈구 내피 상호 작용을 공부를위한 병렬 플레이트 흐름 챔버 분석의 시각적 묘사를 제공합니다. 이 방법은 트리거 백혈구가 내피 세포 표면에 롤링되는 내피 (E) - selectin과 E - selectin 백혈구 리간드의 역할을 조사에 특히 유용합니다.

Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

E-selectin은 미세혈관 내피세포에 존재하는 1형 막단백질로, 순환 백혈구가 피부, 골...로 모집되는 과정을 개시하는 데 도움을 줍니다.

본 영상에서는 혈관 내피세포 표면에서 백혈구 롤링(leukleocyte rolling)을 유발하는 요인을 조사하기 위한 평행판 흐름 챔버(parallel plate flow chamber) 분석법을 시연합니다. 내피세포 단일층은 전염증성 사이토카인인 IL-1β로 자극하여 S-selectin 발현을 상향 조절합니다. 그 다음, 내피세포 위에 평행판 흐름 챔버를 배치하고 S-selectin 양성 백혈구를 단일층 위로 주입합니다.따라서 챔버 내의 세포 상호작용에는 모세혈관 후 백혈구 부착 시와 유사한 전단 응력이 가해집니다. 롤링 현상은 NIS elements를 사용하여 포착 및 수치화하며, E select independence를 분석합니다. 안녕하세요, 저는 하버드 의과대학 브리검 여성 병원 피부과 Dr. Charles de Nitro 연구실의 George Weis입니다.오늘 우리는 생리적 혈류 조건 하에서 인간 백혈구가 인간 골수 내피세포에 부착되는 과정에서 e selectin과 E selectin 리간드의 역할을 분석하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 혈관의 내면을 구성하는 내피세포에 백혈구나 전이성 암세포의 부착을 유도하는 세포 표면 분자의 역할을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이러한 부착 현상은 볼링공이 레인을 따라 굴러가는 것과 같은 롤링(rolling) 동작이 특징입니다.이제 시작하겠습니다. 본 절차의 첫 번째 단계는 유체 챔버(flow chamber)의 내벽을 형성할 혈관 내피 세포를 준비하는 것입니다. 본 프로토콜에서는 인간 골수 유래 H-B-M-E-C 60 세포를 사용합니다.미세혈관 배양 접시는 fibronectin으로 미리 코팅해야 합니다. 이를 위해 35 mL 조직 배양 접시에 20 µg/mL의 fibronectin이 포함된 PBS를 넣고 배양합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 또는 37 °C에서 3시간 동안 배양할 수 있습니다. H-B-M-E-C 60 세포를 medium 1 99에 현탁하여 접시당 10⁵ cells로 분주하고, 세포 밀도가 90% 이상이 될 때까지 배양합니다.E-selectin의 발현을 상향 조절하는 데 약 2일이 소요됩니다. 성장 배지를 흡입하여 제거하고 50 ng/mL의 IL-1β가 포함된 신선한 배지를 첨가한 후 4~6시간 동안 배양합니다. 이제 세포 단층을 플로우 챔버 분석에 사용할 수 있습니다. 추가적인 HBMEC-60 세포 플레이트는 IL-1β로 자극하고, 37 °C에서 1시간 동안 20 µg/mL의 중화 항인간 E-selectin 항체를 처리하여 준비할 수 있습니다.이는 E-selectin의 기능적 발현에 대한 대조군이 됩니다. 다음으로, E-selectin 양성 백혈구를 준비합니다. 여기에는 인간 조혈 전구 세포인 KG-1 세포가 사용됩니다.이 세포들은 RPMI 1640 배지에서 10⁶ cells/mL 농도가 될 때까지 부유 배양합니다. KG-1A 세포는 배양액에서 직접 피펫으로 취하여 혈구계수기(hemocytometer)로 수를 측정할 수 있습니다. 이후 10 mM HEP 또는 2 mM calcium chloride가 포함된 HH 완충액이 들어 있는 HBSS에서 세포를 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다.분석 전까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 다음 단계에서는 현미경, 평행 플레이트 유동 챔버 및 시린지 펌프를 준비합니다. 분석을 위해 현미경과 시린지 펌프의 전원을 켜십시오.현미경의 10x 대물렌즈를 선택하십시오. 50 mL 원심분리관을 홀더에 놓고 2 mM 염화칼슘이 포함된 HH 완충액을 채웁니다. 그런 다음 아래쪽 홀더에 5 mL 플라스틱 시험관들을 배치하십시오.다음으로, 60 mL 주사기를 주사기 펌프에 장착합니다. 플런저와 주사기 본체가 모두 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 60 mL 주사기의 끝에 3방향 스톱콕(three-way stop cock)을 연결한 후, 3방향 스톱콕에 5 mL 주사기를 연결합니다.입력 튜브는 오른쪽, 출력 튜브는 왼쪽, 진공 튜브는 뒤쪽에 오도록 하여 평행 유동 챔버 장치를 현미경 스테이지 위에 배치합니다. 튜브를 진공 장치에 연결한 후, 공기 밸브를 열어 평행 플레이트 장치가 스테이지에 밀착되도록 합니다. 이를 통해 유동 챔버의 진공 스커트가 기밀 상태인지 확인할 수 있습니다.밀봉이 확인되면 공기 밸브를 닫으십시오. 이제 주사기에 이미 연결되어 있는 3방향 스톱콕에 출력 튜브 라인을 연결하십시오. 이제 장치를 H-B-M-E-C 60 세포 위에 배치할 준비가 되었습니다.진공 장치를 켜고 유동 챔버 장치를 플레이트 위에 천천히 내린 후, 장치가 흡착되도록 합니다. 공기가 새는 소리가 들리지 않아야 하며, 이때 고무 가스켓을 압착하기 위해 챔버에 압력을 가해야 할 수도 있습니다. 진공 상태가 형성되면, 입력 튜브를 50 milliliter 원추형 튜브에 넣습니다.3방향 스톱콕을 60 mil 시린지 방향으로 열고, 펌프를 펌프 모드로 설정하여 플레이트 위의 세포가 들뜨지 않게 라인 내부의 공기를 제거합니다. 시린지 펌프를 분당 2 mil 속도로 설정하여 흡입 튜브를 채웁니다. 그 후 신속하게 분당 0.5 mil로 설정합니다.액체가 장치에 도달하기 직전에, 셋업을 주의 깊게 프라이밍하여 단층을 플레이트에서 들어 올릴 수 있는 공기 방울이 생기지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 액체가 60 mil 시린지로 이동하면, 유동 챔버와 시린지 펌프의 프라이밍이 완료된 것입니다. 이제 입력, 출력 및 진공 라인 각각에 테이프를 붙여 유동 챔버를 스테이지에 고정하십시오.이렇게 하면 데이터를 시각화하고 수집할 때 시야가 일정하게 유지됩니다. 이제 유동 챔버를 사용할 준비가 되었습니다. 이 단계들은 각 세포 주입 실행 시와 새로운 플레이트를 사용할 때마다 반복해야 합니다.Lucas site의 rolling 이벤트를 캡처하려면, 데스크톱에서 NIS elements를 실행하고 재생 아이콘을 눌러 라이브 이미지를 확인하십시오. 자동 노출 기능을 통해 플레이트를 확인하고 이미지의 초점을 맞출 수 있습니다. 현미경의 초점을 수동으로 조정하여 세포 단층에 초점이 정확하게 맞았는지 확인하십시오.이미지 초점이 맞으면 노출을 초당 1프레임으로 재설정하고 현미경의 조명을 조절하십시오. 이미지는 컴퓨터 화면에 나타나야 하며 현미경으로는 더 이상 보이지 않아야 합니다. 이후 배경 노출을 제거하거나 세포의 선명도를 높이기 위해 라이트 히스토그램을 조절할 수 있으며, 2x2 bin 또는 live bin을 클릭하여 동영상 캡처에 이상적인 이미지를 얻으십시오.메뉴 바에서 macro를 클릭하고 right를 선택한 다음, 포트에서 com three를 선택하고 open을 누릅니다. 이렇게 하면 시린지 펌프와 조정하기 위한 포트가 열립니다. 이제 유량 챔버에 KG1A 세포를 주입할 준비가 되었습니다. KG1A 세포 현탁액 1 mL를 입력 튜브 라인 근처의 5 mL 시험관에 피펫으로 분주합니다.그런 다음 입력 라인을 시험관 바닥에 배치하십시오. 메뉴 표시줄에서 capture 및 time lapse acquisition을 클릭합니다. 210초 동안 지속되는 프로토콜을 선택하십시오.이것은 H-B-M-E-C 60 세포의 롤링을 위한 프로그램의 길이입니다. 각 단계는 펌프 프로토콜이 진행되는 동안 매초 사진을 찍도록 프로그래밍되어 있습니다. 또한 comm three 포트를 통해 펌프를 시작하는 명령을 보내도록 설정되어 있습니다.시린지 펌프를 특정 유속을 수동으로 설정할 수 있는 프로그램 모드로 설정합니다. 이를 통해 챔버 내의 전단 응력 수준이 결정되며, H-B-M-E-C 60 세포 상에서 KG one A 세포의 상호작용이 제어됩니다. 이러한 상호작용을 위한 설정값은 4.2 dines/cm²로 45초 동안 유지하는 것입니다.60초 동안 cm²당 3 dyne으로 설정하고, 15초마다 단계적으로 증가시켜 최대 cm²당 4.2 dyne까지 높입니다. 이제 현미경과 컴퓨터가 타임랩스 사진을 촬영할 준비가 되었습니다. 컴퓨터에서 'start run'을 눌러 프로그램을 실행하며 데이터 수집을 시작하십시오.입출력 튜브가 배지로 가득 차게 유지하고 시스템 내에 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해, KG one A 세포가 들어 있는 튜브에 반드시 배지를 추가하십시오. 타임랩스가 중단되면 펌프가 자동으로 멈추지 않으므로 반드시 리셋해야 합니다. 취소를 누르면 실시간 이미지로 돌아갑니다.자극되지 않은 혈관 내피세포 단층을 본 실험의 음성 대조군으로 사용합니다. 이를 위해 처리되지 않은 H-B-M-E-C 60 세포 위의 유동 챔버에 KG-1A 백혈구를 주입하여 E-selectin 독립성을 제어하고, 내피세포 단층을 IL-1β로 자극한 후 이 세포들 위로 백혈구를 주입하여 E-selectin 독립성을 추가로 제어합니다. H-B-M-E-C 60 세포를 IL-1β로 처리한 다음 항-인간 S-selectin 항체로 처리합니다.그런 다음 이 세포들에서 백혈구 롤링 현상을 분석합니다. 세포 롤링은 S-selectin뿐만 아니라 백혈구 세포 표면의 시알산 잔기에 의해서도 결정됩니다. 이를 확인하기 위해, KG-1A 세포를 0.1 units/mL의 neuraminidase로 37 °C에서 1시간 동안 처리합니다.그 다음, 자극된 H-B-M-E-C 60 세포 상에서 롤링 이벤트를 분석합니다. 백혈구 표면의 당단백질 또한 세포 롤링에 중요합니다. 이는 KG one A 세포를 37 °C에서 1시간 동안 0.2 units per mil broma lane으로 처리한 후, 이를 유동 챔버에 주입함으로써 입증할 수 있습니다.시간 시퀀스 획득이 완료되면 데이터를 분석할 준비가 된 것입니다. 데이터를 저장하고 메뉴 바의 measure 탭으로 이동하여 defined threshold를 선택하십시오. 원하는 세포가 빨간색으로 표시되도록 바를 이동한 다음, 모든 이미지를 선택하고 okay를 누릅니다. 이제 전체 타임랩스 시퀀스가 수정되어 빨간색으로 표시된 구르는 세포들이 나타나야 합니다.측정(measure)으로 이동하여 제한 사항(restrictions)을 선택합니다. 이를 통해 굴러가는 세포(rolling cells)를 나타내지 않는 임계값 객체들을 제외할 수 있습니다. 이러한 객체들은 주로 H-B-M-E-C 60 단일층 선택 영역에 의해 생성된 배경이며, 굴러가는 백혈구에 이상적인 최소값과 최대값을 입력하십시오.신장도(elongation)와 원형도(circularity)에 대해서도 이 단계를 반복하십시오. 'measure'를 선택한 다음 'create binary using restrictions'를 선택하십시오. 이전 단계에서 설정한 것과 동일한 제한 값이 이제 내피세포 단층 위의 롤링 백혈구를 인식하도록 NIS elements 소프트웨어를 최적화하는 데 사용됩니다. 다시 'measure'로 돌아가 'field data'를 선택한 다음 'reset data'를 선택하십시오.메뉴를 닫고 측정 단계로 돌아가 스캔 영역을 선택한 후, 측정 영역 데이터를 열고 객체 수를 선택하십시오. 그런 다음 모든 영역을 선택하고 데이터를 Microsoft Excel로 내보내십시오. 마지막으로 데이터 지우기를 선택하십시오.이제 NIS 요소들이 추가 데이터 수집을 위한 준비가 되었습니다. 이 대표 데이터들은 백혈구와 혈관 내피세포 간의 상호작용이 생리적 전단 응력에 어떻게 반응하는지를 보여주며, 특히 접착 리간드인 E selectin의 역할을 테스트합니다.내피세포를 IL-1β로 사전 자극하면 강력한 백혈구 롤링이 발생합니다. 이 결과를 자극하지 않은 대조군과 비교하면, 세포 롤링이 사이토카인 자극에 의존한다는 점이 명확해집니다. HBMEC-60 세포를 IL-1β로 처리한 후 항인간 E-selectin 항체로 처리하면, 세포 롤링이 특히 E-selectin에 의존한다는 것을 알 수 있습니다.이 분석법은 다른 파라미터를 테스트하는 데에도 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 자극된 세포를 sase 또는 brolin으로 전처리하면 결과의 견고성이 떨어집니다. 이러한 데이터는 세포 표면 당단백질뿐만 아니라 말단 sialic acid 잔기의 중요성을 강조합니다.S-selectin 리간드 활성의 경우, 백혈구가 혈액을 떠나 조직으로 진입하는 순환계 영역인 모세혈관 후 정맥에 존재하는 힘을 모사한 조건에서 백혈구와 혈관 내피세포 사이의 E-selectin 기반 접착 상호작용을 분석하는 방법을 방금 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 해당 분석 시스템에서 각 selectin과 그 리간드의 필요성을 검증하기 위해 적절한 블로킹 항체나 효소 처리 대조군을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

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