Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

이 비디오에서는 내피세포 표면에서 백혈구 롤링(rolling)을 유발하는 요인을 조사하기 위한 평행판 유동 챔버(parallel plate flow chamber) 분석법을 보여줍니다. 내피세포 단일층에 전염증성 사이토카인 IL-1β를 처리하여 S-selectin 발현을 상향 조절합니다. 그 후 내피세포 위에 평행판 유동 챔버를 배치하고, S-selectin 양성 백혈구를 단일층 위로 주입합니다.

따라서 챔버 내의 세포 상호작용에는 모세혈관 후 백혈구 부착 시와 유사한 전단 응력이 가해집니다. 롤링 현상은 NIS elements를 사용하여 포착 및 수치화하며, E select 독립성을 분석합니다. 안녕하세요, 저는 하버드 의과대학 브리검 여성 병원 피부과 Charles de Nitro 박사 연구실의 George Weis입니다.

오늘은 생리적 혈류 조건하에서 인간 백혈구가 인간 골수 내피세포에 부착될 때 e-selectin과 E-selectin 리간드의 역할을 분석하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 통해 백혈구 또는 전이성 암세포가 혈관 내벽을 이루는 내피세포에 부착을 시작하게 하는 세포 표면 분자의 역할을 연구합니다. 이러한 부착 현상은 마치 볼링공이 레인을 따라 굴러가는 것과 같은 롤링(rolling) 동작이 특징입니다.

그럼 시작하겠습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 유동 챔버(flow chamber)의 내벽을 형성할 혈관 내피 세포를 준비하는 것입니다. 본 프로토콜에서는 인간 골수 유래 H-B-M-E-C 60 세포를 사용합니다.

미세혈관 배양 접시는 피브로넥틴으로 사전 코팅되어야 합니다. 이를 준비하기 위해 35 mL 조직 배양 접시에 20 µg/mL의 피브로넥틴이 포함된 PBS를 넣고 배양합니다. 이는 4 °C에서 하룻밤 동안 또는 37 °C에서 3시간 동안 배양할 수 있습니다. H-B-M-E-C 60 세포를 medium 1 99에 현탁하여 접시당 10⁵ cells로 분주하고, 배양액이 90% 이상의 confluence에 도달할 때까지 성장시킵니다.

E-selectin의 발현을 상향 조절하는 데 약 이틀이 소요됩니다. 성장 배지를 흡입하여 제거하고 50 ng/mL의 IL-1β가 포함된 신선한 배지를 첨가한 후 4~6시간 동안 배양합니다. 이제 세포 단층은 flow chamber 분석을 위한 준비가 완료되었습니다. 추가적인 HBMEC-60 세포 플레이트를 IL-1β로 자극하고, 37°C에서 1시간 동안 20 µg/mL의 중화 anti-human E-selectin 항체로 처리할 수 있습니다.

이 과정은 E-selectin의 기능적 발현을 대조군으로 설정하는 것입니다. 다음으로, E-selectin 양성 백혈구를 준비합니다. 이는 KG-1 인간 조혈모세포입니다.

이 세포들은 RPMI 1640 배지에서 10⁶ cells/mL 농도가 될 때까지 부유 배양합니다. KG-1A 세포는 배양액에서 직접 파이펫팅하여 헤모사이토미터로 계수할 수 있습니다. 10mM HEP 또는 2mM CaCl₂가 포함된 HH 완충액이 들어있는 HBSS에서 세포를 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다.

세포를 분석 시까지 얼음에 보관하십시오. 다음 단계에서는 현미경, 평행 플레이트 흐름 챔버 및 시린지 펌프를 준비합니다. 분석을 위해 현미경과 시린지 펌프의 전원을 켭니다.

현미경의 10배율 대물렌즈를 선택하십시오. 50 mL 원심분리관을 홀더에 넣고 2 mM 염화칼슘이 포함된 HH 완충액으로 채웁니다. 그런 다음 아래쪽 홀더에 5 mL 플라스틱 시험관들을 배치하십시오.

다음으로, 60 mL 주사기를 주사기 펌프에 장착합니다. 플런저와 주사기 몸체가 모두 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 60 mL 주사기 끝에 3방향 스톱콕(three-way stop cock)을 연결한 다음, 3방향 스톱콕에 5 mL 주사기를 연결합니다.

입력 튜브는 오른쪽, 출력 튜브는 왼쪽, 진공 튜브는 뒤쪽에 오도록 하여 평행 흐름 챔버 장치를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 튜브를 진공 장치에 연결한 후, 공기 밸브를 열어 평행 플레이트 장치가 스테이지에 밀착되게 합니다. 이를 통해 흐름 챔버의 진공 스커트가 기밀 상태인지 테스트할 수 있습니다.

밀폐가 확인되면 공기 밸브를 잠급니다. 이제 출력 튜브 라인을 시린지에 이미 연결되어 있는 3방향 스톱콕에 연결하십시오. 이제 장치를 H-B-M-E-C 60 세포 위에 배치할 준비가 되었습니다.

진공 장치를 켜고 유동 챔버 장치를 플레이트 위에 천천히 내린 다음, 장치가 흡착되도록 합니다. 공기가 새는 소리가 나지 않아야 하며, 이때 고무 가스켓을 압착하기 위해 챔버에 압력을 가해야 할 수도 있습니다. 진공 상태가 형성되면 입력 튜브를 50 milliliter 원뿔형 튜브에 넣습니다.

3방향 스톱콕을 60 mil 주사기 방향으로 열고 펌프를 펌프 모드로 설정하여 플레이트 위의 세포가 들뜨지 않도록 라인 내의 공기를 제거합니다. 주사기 펌프를 분당 2 mil로 설정하여 흡입 튜브를 채웁니다. 그런 다음 빠르게 분당 0.5 mil로 설정합니다.

액체가 장치에 도달하기 직전에 셋업을 주의 깊게 프라이밍하여 기포가 생기는 것을 방지하는 것이 매우 중요하며, 기포가 발생하면 단층이 플레이트에서 떨어져 나갈 수 있습니다. 액체가 60 mil 시린지에 들어가면 유동 챔버와 시린지 펌프의 프라이밍이 완료된 것입니다. 이제 입력 라인, 출력 라인 및 진공 라인의 각각에 테이프를 붙여 유동 챔버를 스테이지에 고정하십시오.

이렇게 하면 데이터를 시각화하고 수집할 때 시야(field of view)를 일정하게 유지할 수 있습니다. 이제 유동 챔버(flow chamber)를 사용할 준비가 되었습니다. 이 단계들은 각 세포 입력 실행 시와 새로운 플레이트를 사용할 때마다 반복해야 합니다.

Lucas site의 롤링 이벤트를 캡처하려면, 데스크톱에서 NIS elements를 열고 라이브 이미지를 위해 재생 아이콘을 누르십시오. 자동 노출 기능을 통해 플레이트를 확인하고 이미지의 초점을 맞출 수 있습니다. 현미경의 초점을 수동으로 조절하여 세포 단층에 초점이 정확하게 맞았는지 확인하십시오.

이미지의 초점이 맞으면 노출을 초당 1프레임으로 재설정하고 현미경의 조명을 조절하십시오. 이미지는 컴퓨터 화면에 나타나야 하며, 현미경 상으로는 더 이상 보이지 않아야 합니다. 그 후 배경 노출을 제거하거나 세포의 선명도를 높이기 위해 라이트 히스토그램을 조절할 수 있으며, 2x2 bin 또는 live bin을 클릭하여 동영상 캡처에 이상적인 이미지를 얻으십시오.

메뉴 바에서 macro를 클릭하고 right to port를 선택한 후 포트 com three를 선택하고 open을 누릅니다. 이렇게 하면 시린지 펌프와 연동하기 위해 포트가 열립니다. 이제 유동 챔버에 KG1A 세포를 주입할 준비가 되었습니다. 5 mL 시험관 내의 입력 튜브 라인 근처에 KG1A 세포 현탁액 1 mL를 피펫으로 분주합니다.

그런 다음 입력 라인을 시험관 바닥에 배치합니다. 메뉴 바로 이동하여 capture 및 time lapse acquisition을 클릭합니다. 210초 동안 지속되는 프로토콜을 선택합니다.

이는 H-B-M-E-C 60 세포의 롤링(rolling)을 위한 프로그램의 길이입니다. 각 단계는 펌프 프로토콜이 진행되는 동안 1초마다 사진을 찍도록 프로그래밍되어 있습니다. 또한, 펌프를 시작하기 위해 comm three 포트를 통해 명령어를 전송하도록 설정되어 있습니다.

시린지 펌프를 특정 유량을 수동으로 설정할 수 있는 프로그램 모드로 설정합니다. 이를 통해 챔버 내의 전단 응력 수준이 결정되며, H-B-M-E-C 60 세포 상의 KG one A 세포 상호작용이 조절됩니다. 이러한 상호작용을 위한 설정값은 4.2 dines/cm²로 45초 동안 적용합니다.

60초 동안 cm²당 3.0 dynes로 설정하고, 15초마다 단계적으로 증가시켜 최대 cm²당 4.2 dynes까지 도달하게 합니다. 이제 현미경과 컴퓨터가 타임랩스 사진 촬영을 할 준비가 되었습니다. 컴퓨터에서 run 시작 버튼을 눌러 프로그램을 실행하면서 데이터 수집을 시작하십시오.

입출력 튜브가 배지로 가득 차게 유지하고 시스템에 기포가 들어가는 것을 방지하기 위해 KG one A 세포가 들어 있는 튜브에 배지를 반드시 추가하십시오. 타임랩스가 중단되면 펌프가 자동으로 멈추지 않으므로 반드시 재설정해야 합니다. 취소 버튼을 눌러 라이브 이미지 화면으로 돌아가십시오.

자극되지 않은 내피세포 단층을 본 실험의 음성 대조군으로 사용합니다. 이를 위해 e-selectin 독립성을 대조하기 위해 처리되지 않은 H-B-M-E-C 60 세포가 있는 유동 챔버에 KG-1A 백혈구를 주입하고, 효과 독립성을 추가로 대조하기 위해 내피세포 단층을 IL-1β로 자극한 후 이 세포들 위로 백혈구를 주입합니다. H-B-M-E-C 60 세포를 IL-1β로 처리한 다음 항-인간 P-selectin 항체로 처리합니다.

그런 다음 이 세포들에서 백혈구 롤링(rolling) 현상을 분석하십시오. 세포 롤링은 S-selectin뿐만 아니라 백혈구 세포 표면의 시알산(sialic acid) 잔기에 의해서도 결정됩니다. 이를 증명하기 위해, KG-1A 세포를 37 °C에서 1시간 동안 0.1 units/mL의 뉴라미니다아제(neuraminidase)로 처리하십시오.

그런 다음 자극된 H-B-M-E-C 60 세포 상의 롤링 현상을 분석합니다. 백혈구 표면의 당단백질 또한 세포 롤링에 중요한 역할을 합니다. 이는 KG-1A 세포를 37 °C에서 1시간 동안 0.2 units/ml bromelain으로 처리한 후, 이를 유동 챔버에 주입함으로써 입증할 수 있습니다.

시간 시퀀스 획득이 완료되면 데이터를 분석할 준비가 된 것입니다. 데이터를 저장하고 메뉴 바의 measure 탭으로 이동하여 defined threshold를 선택하십시오. 원하는 세포가 빨간색으로 표시되도록 바를 이동시킨 후, 모든 이미지를 선택하고 okay를 누르면 전체 타임랩스 시퀀스가 수정되어 빨간색으로 표시된 구르는 세포들이 나타나게 됩니다.

'Measure'로 이동하여 'Restrictions'를 선택합니다. 이를 통해 롤링 세포(rolling cells)를 나타내지 않는 임계값 객체들을 제외할 수 있습니다. 이러한 객체들은 주로 H-B-M-E-C 60 단층의 선택 영역으로 인해 생성된 배경입니다. 롤링 백혈구(rolling leukocytes)에 적합한 최소값과 최대값을 입력하십시오.

신장(elongation) 및 원형도(circularity)에 대해 이 단계를 반복하십시오. measure를 선택한 다음 restrictions를 사용하여 binary 생성(create binary)을 선택하십시오. 이전 단계에서 설정한 것과 동일한 제한 값(restriction values)이 이제 내피세포 단층(endothelial cell monolayer) 상의 롤링 백혈구(rolling leukocytes)를 인식하도록 NIS elements 소프트웨어를 최적화하는 데 사용됩니다. 다시 measure로 돌아가 field data를 선택한 다음 reset data를 선택하십시오.

메뉴를 닫고 측정으로 돌아가 스캔 필드를 선택한 다음, 측정 필드 데이터를 열고 객체 수를 선택하십시오. 그런 다음 모든 필드를 선택하고 데이터를 Microsoft Excel로 내보내십시오. 마지막으로 데이터 삭제를 선택하십시오.

이제 NIS 요소들의 추가 데이터 수집 준비가 완료되었습니다. 이 대표 데이터는 백혈구와 혈관 내피세포 간의 상호작용이 생리적 전단 응력에 어떻게 반응하는지를 보여주며, 특히 접착 리간드인 E selectin의 역할을 테스트합니다.

내피세포를 IL-1β로 사전 자극하면 강한 백혈구 롤링이 발생합니다. 이 결과와 자극하지 않은 대조군을 비교하면, 세포 롤링이 사이토카인 자극에 의존한다는 것이 분명해집니다. HBMEC 60 세포를 IL-1β로 처리한 후 항인간 E-selectin 항체로 처리함으로써, 세포 롤링이 구체적으로 E-selectin에 의존한다는 사실을 알 수 있습니다.

이 분석법은 다른 매개변수를 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 자극된 세포를 sase 또는 brolin으로 전처리하면 결과의 견고함이 떨어집니다. 이러한 데이터는 세포 표면 당단백질뿐만 아니라 말단 sialic acid 잔기의 중요성을 강조합니다.

S selectin 리간드 활성에 대하여, 백혈구와 혈관 내피세포 사이의 E-selectin 기반 접착 상호작용을 백혈구가 혈액을 떠나 조직으로 들어가는 순환계 영역인 모세혈관 후 정맥에 존재하는 힘과 유사한 조건에서 분석하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 해당 분석 시스템에서 각 selectin과 그 리간드의 필요성을 검증하기 위해 적절한 차단 항체 또는 효소 처리 대조군을 사용하는 것이 중요함을 기억하십시오. 이것으로 모두 마치겠습니다.

시청해주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.