Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

이 동영상은 내피 세포 표면에서 백혈구 굴러를 유발하는 요인을 조사하기 위한 병렬 플레이트 유동 챔버 분석을 보여줍니다. 내피 세포 단층은 염증성 사이토카인 IL one beta로 자극되어 S 셀렉틴 발현을 상향 조절합니다. 그런 다음 병렬 플레이트 흐름 챔버를 내피 세포 위에 놓고 S 셀렉트인 양성 백혈구를 단층에 주입합니다.

따라서 챔버 내의 세포 상호 작용에는 모세혈관 후 및 백혈구 접착에서와 유사한 순전한 응력이 부여됩니다. 롤링 이벤트는 NIS 요소와 E 선택 독립성에 대한 분석을 사용하여 캡처되고 열거됩니다. 안녕하세요, 저는 하버드 의과대학 Brigman Women's Hospital 피부과 Dr.Charles de Nitro의 실험실에서 근무하는 George Weis입니다.

오늘은 생리학적 혈류 조건에서 인간 백혈구와 인간 골수 내피 세포의 접착에서 e selectin, E selectin 리간드의 역할을 분석하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 백혈구 또는 전이성 암세포가 혈관 내부 표면을 감싸고 있는 내피 세포에 접착을 시작하는 세포 표면 분자의 역할을 연구합니다. 이 접착 현상은 볼링공이 레인을 굴러가는 것과 같은 굴러가는 동작이 특징입니다.

시작하겠습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 유동 챔버를 둘러싸고 있는 내피 세포를 준비하는 것입니다. 이 프로토콜은 인간 골수에서 유래한 H-B-M-E-C 60 세포를 사용합니다.

미세혈관 배양 접시는 피브로넥틴으로 사전 코팅하여 피브로넥틴을 미리 코팅하여 1mil당 20마이크로그램을 함유한 PBS로 35ml 조직 배양 접시를 준비해야 합니다. 이들은 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 또는 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양할 수 있습니다. H-B-M-E-C 60 세포를 배지 1 99에 현탁시키고 접시 당 10-5 번째 세포에서 파종하여 배양액을 90 % confluence 이상으로 성장시킵니다.

이것은 e 선택 및 발현을 상향 조절하고, 성장 배지를 흡인하고, IL mil당 50 나노그램의 새로운 배지를 첨가하고, 1 베타 배지를 4-6 시간 동안 배양하는 데 약 2일이 걸립니다. 이제 세포 단층이 플로우 챔버 분석을 위한 준비가 되었습니다. H-B-M-E-C 60 세포의 추가 플레이트는 IL one beta로 자극되고 섭씨 37도에서 1시간 동안 mil당 20마이크로그램의 중화 항인간 e 셀렉틴 항체로 처리할 수 있습니다.

이것은 e selectin의 기능적 발현을 제어합니다. 다음으로, 양성 백혈구에서 e select를 준비합니다. 이들은 KG one 인간 조혈전구세포입니다.

이들은 현탁액에서 성장하여 RPMI 1640에서 mil 당 6 개의 세포와 합류하거나 경향이 있습니다. KG one A 세포는 배양액에서 직접 피펫을 추출하여 혈세포 분석기에서 계산할 수 있습니다. Resus는 2 밀리몰 염화칼슘을 포함하는 10 밀리몰 hep 또는 HH 완충액을 사용하여 HBSS에서 10에서 6 개의 세포로 세포를 현탁시킵니다.

분석이 완료될 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 다음 단계에는 현미경, 평행판 흐름 챔버 및 주사기 펌프를 준비하는 작업이 포함됩니다. 분석을 위해 현미경과 주사기 펌프를 켭니다.

현미경에서 10 x 대물렌즈를 선택합니다. 홀더에 50ml 원뿔형 튜브를 넣고 2밀리몰의 염화칼슘이 든 HH 버퍼로 채웁니다. 그런 다음 아래 홀더에 5mL 플라스틱 시험관을 넣습니다.

다음으로 60ml 주사기를 주사기 펌프에 넣습니다. 플런저와 주사기 본체가 모두 고정되어 있는지 확인하십시오. 60 mil 주사기 끝에 3 방향 정지 콕을 부착 한 다음 3 방향 정지 cock에 5 mil 주사기를 부착합니다.

평행 흐름 챔버 장치를 현미경 스테이지에 놓고 입력 튜브는 오른쪽에, 출력 튜브는 왼쪽에, 진공관은 뒤쪽에 놓습니다. 튜브를 진공에 연결한 후 공기 밸브를 열어 평행판 장치가 스테이지에 부착되도록 합니다. 이것은 흐름 챔버의 진공 스커트가 밀폐되어 있는지 테스트합니다.

씰이 확인되면 공기 밸브를 끕니다. 이제 출력 튜빙 라인을 이미 주사기에 연결된 3방향 스톱 콕에 연결합니다. 이제 장치를 H-B-M-E-C 60 셀 위에 배치할 준비가 되었습니다.

진공 청소기를 켜고 흐름 챔버 장치를 플레이트 위로 부드럽게 내리고 장치가 흡입되도록 합니다. 공기가 빠져나가는 소리가 없어야 하며 이 시점에서 고무 개스킷을 압축하기 위해 챔버에 압력을 가해야 할 수 있습니다. 진공이 설정되면 입력 튜브를 50ml 원추형 튜브에 넣습니다.

3방향 스톱 콕을 60mil 주사기에 열고 펌프를 펌프 모드로 설정하여 플레이트의 셀을 들어 올리지 않고 라인에서 공기를 제거합니다. 분당 2mil로 설정된 주사기 펌프를 사용하여 흡기 튜브를 채웁니다. 그런 다음 분당 0.5mils로 빠르게 설정합니다.

유체가 장치에 도달하기 직전에 설정을 신중하게 프라이밍하고 플레이트에서 단층을 들어 올리는 기포를 피하는 것이 중요합니다. 유체가 60mil 실린지로 이동하면 플로우 챔버와 실린지 펌프가 프라이밍됩니다. 이제 각 입력, 출력 및 진공 라인 위에 테이프 조각을 사용하여 챔버의 흐름을 스테이지로 고정합니다.

이렇게 하면 데이터를 시각화하고 수집할 때 시야가 일정하게 유지됩니다. 이제 플로우 챔버를 사용할 준비가 되었습니다. 각 셀 입력 실행과 각 새 플레이트에 대해 이러한 단계를 반복해야 합니다.

Lucas 사이트 롤링 이벤트를 캡처하려면 바탕 화면에서 NIS 요소를 열고 라이브 이미지의 재생 아이콘을 누릅니다. 자동 노출을 사용하면 플레이트를 보고 이미지의 초점을 맞출 수 있습니다. 현미경에서 수동으로 초점을 조정하여 현미경이 세포 단층에 적절하게 초점을 맞췄는지 확인하십시오.

이미지에 초점이 맞춰지면 노출을 초당 1프레임으로 재설정하고 현미경의 빛을 조정합니다. 이미지는 컴퓨터에 나타나야 하며 현미경에서 더 이상 보이지 않아야 합니다. 그런 다음 광 히스토그램을 조정할 수 있습니다.배경 노출을 제거하거나 셀 선명도를 개선하기 위해 2x2 빈 또는 라이브 빈을 클릭하여 동영상 캡처에 이상적인 이미지를 얻을

메뉴 표시줄에서 매크로를 클릭하고 포트 오른쪽을 선택하고 포트 com 3을 선택한 다음 엽니다. 이렇게 하면 주사기 펌프와 조정하기 위해 포트가 열립니다. 이제 플로우 챔버에 KG one A 셀 피펫 1mil KG one A S 현탁액을 주입할 준비가 되었습니다.

그런 다음 입력 라인을 시험관 바닥에 놓습니다. 메뉴 표시줄로 이동하여 Capture and Time Lapse acquisition을 클릭합니다. 210초 동안 지속되는 프로토콜을 선택합니다.

이것은 H-B-M-E-C 60 셀에서 롤링하는 프로그램의 길이입니다. 각 단계는 펌프 프로토콜 기간 동안 매초 사진을 촬영하도록 프로그래밍되어 있습니다. 또한 comm three 포트를 통해 명령을 보내 펌프를 시작하도록 설정되어 있습니다.

실린지 펌프를 프로그램 모드로 설정하여 특정 유량을 수동으로 프로그래밍할 수 있습니다. 이를 통해 챔버 내의 순전한 스트레스 수준을 결정하고 H-B-M-E-C 60 세포에 대한 KG one A 세포 상호 작용을 지시합니다. 이러한 상호 작용에 대한 설정은 45초 동안 제곱센티미터당 4.2디너입니다.

포인트 3 디닝 당 센티미터 제곱 60초 동안 그리고 스텝 어웨이는 15초마다 증가하여 최대 센티미터 제곱당 4.2 디닝까지 증가합니다. 이제 현미경과 컴퓨터가 타임랩스 사진을 촬영할 준비가 되었습니다. 컴퓨터에서 실행 시작을 눌러 프로그램을 실행하는 동안 데이터 수집을 시작합니다.

입력 출력 튜브를 매체로 가득 채우고 기포가 시스템에 유입되는 것을 방지하기 위해 KG one A 셀이 포함된 튜브에 매체를 추가해야 합니다. 시간 경과가 중단되면 펌프가 자체적으로 멈추지 않으므로 재설정해야 합니다. 취소를 눌러 라이브 이미지로 돌아갑니다.

자극되지 않은 내피 세포 단층은 이 실험의 음성 대조군 역할을 합니다. 이를 위해 KG one A 백혈구를 처리되지 않은 H-B-M-E-C 60 세포의 유동 챔버에 주입하여 e 선택 독립성을 제어하고, IL one beta로 내피 세포 단일층을 자극하고, 이러한 세포에 백혈구를 주입하여 발굴 독립성을 추가로 제어합니다. H-B-M-E-C 60 세포를 IL one beta로 치료한 다음 anti-human S selectin 항체로 치료합니다.

그런 다음 이러한 세포에서 백혈구 롤링 이벤트를 분석합니다. 세포 롤링은 S 셀렉틴에 의해서만 결정되는 것이 아니라 백혈구 세포 표면의 슬릭 산 잔기에 의해서도 결정됩니다. 이를 보여주기 위해 KG one A 세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 0.1 units per mil neuraminidase로 분해합니다.

그런 다음 자극된 H-B-M-E-C 60 세포에 대한 롤링 이벤트를 분석합니다. 백혈구 표면의 당단백질(glycoprotein)도 세포 롤링에 중요합니다. 이는 섭씨 37도에서 1시간 동안 KG one A cell을 mil broma lane당 0.2 units로 처리한 다음 flow chamber에 주입함으로써 입증할 수 있습니다.

시간 시퀀스를 획득하면 데이터를 분석할 준비가 된 것입니다. 데이터를 저장하고 메뉴 모음의 측정 탭으로 이동하여 정의된 임계값을 선택합니다. 원하는 셀이 빨간색으로 표시되도록 막대를 이동하고 모든 이미지를 선택한 다음 이제 전체 타임랩스 시퀀스가 보이는 빨간색 롤링 셀로 수정되어야 합니다.

측정으로 이동하여 제한을 선택합니다. 이를 통해 사용자는 롤링 셀을 나타내지 않는 임계값 개체를 제외할 수 있습니다. 이는 주로 H-B-M-E-C 60 단층 선택 영역에 의해 생성된 배경이며, 이는 롤링 백혈구에 이상적인 최소값 및 최대값을 입력합니다.

연신율 및 원형에 대해 이 단계를 반복합니다.측정값을 선택한 다음 제한을 사용하여 이진 생성을 선택합니다. 이전 단계에서 설정한 것과 동일한 제한 값이 이제 내피 세포 단층에서 롤링 백혈구를 인식하기 위한 NIS 요소 소프트웨어를 최적화하는 데 사용됩니다. 다시 측정으로 돌아가서 필드 데이터를 선택한 다음 데이터 재설정을 선택합니다.

메뉴를 닫고 측정으로 돌아가서 스캔 필드를 선택하고 측정 필드 데이터를 열고 숫자 또는 개체를 선택합니다. 그런 다음 모든 필드를 선택하고 데이터를 Microsoft Excel로 내보냅니다. 마지막으로 데이터 지우기를 선택합니다.

이제 NIS 요소가 더 많은 데이터를 수집할 준비가 되었습니다. 이러한 대표적인 데이터는 백혈구 내피 세포 상호 작용이 생리학적 순전한 스트레스에 어떻게 반응하는지, 특히 접착 리간드의 역할을 테스트하는 방법을 보여줍니다. E 선택.

강력한 백혈구 롤링은 내피 세포가 IL one 베타로 사전 자극될 때 발생합니다. 이 결과를 자극되지 않은 대조군과 비교하면 세포 굴림이 사이토카인 자극에 의존한다는 것이 분명합니다. H-B-M-E-C 60 세포를 IL one beta로 처리한 다음 항-인간 E selectin 항체로 처리함으로써, 세포 롤링이 e selectin에 특이적으로 의존한다는 것이 분명해집니다.

이 분석은 다른 파라미터도 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 자극된 세포를 사제(sase) 또는 브롤린(brolin)으로 전처리하면 결과가 덜 견고해집니다. 이러한 데이터는 말단 슬라크산 잔기와 세포 표면 당단백질의 중요성을 강조합니다.

S 셀렉틴 리간드 활성의 경우, 백혈구가 혈액을 떠나 조직으로 들어가는 순환계 영역인 모세혈관 후 정맥(post capillary venial)에 존재하는 힘을 모방하는 조건에서 백혈구와 내피 세포 사이의 e 셀렉틴 기반 접착 상호 작용을 분석하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 적절한 차단 항체 또는 효소 처리 제어를 사용하여 이 분석 시스템에서 각 selectin과 해당 리간드의 필요성을 검증하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.