2.13: 토양 샘플에서 박테리아 배양 및 나열

1. 토양 희석제 준비

1. 절차를 시작하려면 토양 샘플 10g의 무게를 측정하고 95 mL의 탈온 화 물을 추가합니다. 서스펜션을 잘 흔들어 "A"라고 표시합니다.
2. 토양이 정착하기 전에 멸균 파이펫으로 서스펜션 1mL를 제거하고 9mL 의 증분 비워로 옮기습니다. 소용돌이를 철저히 표시하고"B"로 라벨을 붙입니다.
3. 이 희석 단계를 세 번 반복하며, 매번 이전 서스펜션의 1mL및 9mL 의 분수 블랭크를 반복한다. 이러한 레이블을 튜브 C, D 및 E로 순차적으로 라벨을 지정합니다. 이로 인해 mL당 10-1~10-5그램의 토양희석이 발생합니다.

2. 세균 문화를 위한 스프레드 플레이트 만들기

1. 세균성 식민지를 성장시키기 위하여는, 3개의 미리 준비된 펩톤 효모 한천 판을 취하고 C, D 및 E. 소용돌이 견본 C, D 및 E, 및 파이펫 0.1 mL각 접시에 그(것)들을 레이블을 붙입니다. 이렇게 하면 희석 값을 10배 증가시킨다(C^=10-3,D =^10-4,E =^10-5).
2. 다음으로 유리 스프레더를 에탄올에 담급드세요. 스프레더를 화염에 몇 초 동안 놓고 에탄올을 점화하고 태워버린다. 이렇게 하면 스프레더가 소독됩니다.
3. 불꽃이 꺼질 때까지 스프레더를 첫 번째 접시 위에 놓습니다. 뚜껑을 닫고 접시를 빠르게 엽니다. 스프레더를 접종(이노쿨룸 = 배양시 시작에 사용되는 세포)에서 멀리 떨어진 천에 터치한 다음, 자유 액체의 흔적이 사라질 때까지 천자의 표면 주위에 접종을 퍼뜨립니다. 플레이트 뚜껑을 교체합니다.
4. 스프레더를 다시 불태우고 다음 플레이트로 프로세스를 반복하여 공기 중 유기체로 한고를 오염시키지 않도록 신속하게 작업합니다.
5. 1 주일 동안 실온에서 박테리아 플레이트를 배양하십시오. 복어질 중에 플레이트가 반전되어 응축으로 인한 수분 방울이 천 표면에 떨어지는 것을 방지하십시오.

3. 액티노미세테스용 스프레드 플레이트 만들기

1. 액티노마이세테를 성장시키기 위해 미리 준비된 글리세롤 카제인 플레이트 3개를 가지고 B, C 및 D. 이전에 도시된 기술을 사용하여 서스펜션 B, C 및 D에서 0.1 mL를 확산시니다. 저희석은 작용근세테가 전형적으로 세균 집단의 1/10^th(B = 10-2, C =^10-3,D = 10-4)로 존재하기 때문에 사용된다.
2. 실온에서 액티노미세테 플레이트(반전)를 2주 동안 배양한다.

4. 세균 및 액티노미세테 카운트

1. 인큐베이션 후 모든 박테리아 플레이트를 주의 깊게 살펴보고 식민지 크기와 모양의 차이를 주의하십시오. 한천에서 재배할 때 박테리아는 무색에서 밝은 오렌지, 노란색 또는 분홍색에 이르는 끈적끈적한 식민지를 생성합니다. 대조적으로, actinomycete 식민지는 백악질, 단단한, 가죽, 그리고 압력에서 중단됩니다, 그밖 세균성 식민지는 얼룩질 것입니다. 이를 통해 식민지는 멸균 루프와 접촉하여 구별할 수 있습니다.
2. 계산 하 고 세균성 식민지의 수를 기록, 어떤 actinomycetes를 포함 하 여. 플레이트당 30-200개의 콜로니가 있는 플레이트만 계산합니다.

5. 순수한 문화의 고립

1. 플레이트 중 하나에서 개별 세균 성 식민지를 선택합니다. 토양에 특별한 관심이 있는 경우 더 많은 식민지를 선택할 수 있습니다. 그것은 잘 분리 된 순수한 식민지를 가지고하는 경향이 있기 때문에, 높은 희석 판을 사용합니다. 이웃 식민지와 잘 분리된 식민지만 선택하고 서로 형태학적으로 구별되는 것처럼 보입니다.
2. 알코올에 찍어 그것을 불타는하여 루프를 살균. 페트리 요리를 빠르게 열고 루프를 한천의 맨 자리에 터치하여 식힙니다. 그런 다음 루프에 소량의 관심 있는 콜로니를 제거합니다.
3. 신선한 펩톤 효모 접시를 가지고, 한쪽에 몇 센티미터 길이의 줄무늬를 합니다. 살균하고 다시 식힌 다음 첫 번째 패스에서만 초기 연승을 가로지르는 연승을 만듭니다. 이 프로세스를 동일한 방식으로 두 번 더 반복합니다. 이 줄무늬 "희석"은 루프의 셀이 서로 분리되는 결과를 낳습니다. 2 주 동안 실온에서 배양하는 어두운 영역에 접시를 배치합니다.

환경 박테리아의 정확한 수를 결정하는 것은 토양 생태계의 건전성을 평가하는 데 매우 중요합니다. 이는 적절한 희석액으로 박테리아 군체를 배양함으로써 달성할 수 있습니다.

토양 박테리아는 건강한 토양 생태계의 중요한 부분이며 분해, 질소 고정 및 영양 순환에 중요한 역할을 합니다. 표면 토양은 유기 및 무기 입자의 기질로, 공기 또는 물로 채워진 기공을 둘러싸는 복잡한 매트릭스를 형성합니다. 이러한 조건은 박테리아를 위한 이상적인 생태계를 조성하며, 표면 토양에는 일반적으로 그램당 100만 개 이상의 박테리아가 포함되어 있습니다.

이러한 박테리아 농도가 높기 때문에 성장 배지에 도금하기 전에 희석이 필요합니다. 연속 희석은 원래 토양 샘플의 농도를 배지 플레이트에서 단일 콜로니가 자랄 수 있을 만큼 충분히 낮은 수준으로 낮출 수 있으므로 토양 샘플에서 박테리아의 초기 수를 계산할 수 있습니다.

이 비디오는 토양 샘플의 연속 희석을 준비하는 방법, 이러한 박테리아 샘플을 도금하는 방법 및 희석 플레이트에서 토양 박테리아 수를 계산하는 방법을 보여줍니다.

박테리아는 단순한 원핵 생물이지만 종과 생태계 측면에서 매우 다양합니다. 방선균(Actinomycetes)은 섬유질 구조로 인해 종종 고유한 그룹으로 간주되는 박테리아의 하위 집합으로, 함께 묶여 자라 균사를 형성합니다.

일반적으로 방선균은 토양의 전체 박테리아 개체군의 10%를 차지합니다. 박테리아와 방선균은 지구상의 거의 모든 환경에 풍부하지만 토양에서 비교할 수 없는 다양성과 풍부함을 가지고 있습니다.

토양 박테리아가 열거되고 잠재적으로 희석 도금으로 배양 및 식별됩니다. 여기에서 토양 샘플을 물에 연속적으로 희석한 다음 한천 성장판에 분산시킵니다. 그런 다음 결과 콜로니가 계산됩니다. 이 값은 희석 계수와 함께 토양 내 박테리아의 초기 농도를 밝히는 데 사용됩니다.

희석 도금은 박테리아 계수를 위한 일반적이고 저렴하며 간단한 방법이지만 몇 가지 단점이 있습니다. 희석 중에 토양이 가라앉도록 해서는 안 되며, 이는 편향된 성장으로 이어질 수 있습니다. 일부 토양 박테리아는 플레이트에서 배양하지 않거나 너무 느리게 자라서 관찰되지 않습니다. 또한 이 방법은 군체가 단일 박테리아에서 형성된다고 가정하지만 여러 세포의 덩어리에서 발생할 수 있습니다.

특정 박테리아 종은 다른 성장 배지에서 더 잘 자랍니다. 광범위한 박테리아를 배양하기 위한 일반적인 기질은 한천-펩톤 효모 플레이트입니다. 방선균은 글리세롤-카제인 기반 플레이트에서 우선적으로 자라며, 이는 이러한 사상 박테리아의 성장에 더 적합합니다.

이제 박테리아 계수의 개념을 이해했으므로 이 과정이 실험실에서 어떻게 수행되는지 살펴보겠습니다.

절차를 시작하려면 10g의 토양 샘플의 무게를 측정하고 95mL의 탈이온수를 추가합니다. 서스펜션을 잘 흔들고 "A"로 라벨을 붙입니다. 토양이 가라앉기 전에 멸균 피펫으로 현탁액 1mL를 제거하고 9mL의 탈이온수에 옮깁니다. Vortex를 철저히 만들고 "B"로 레이블을 지정합니다.

이 희석 단계를 3회 반복하며, 매번 이전 현탁액 1mL와 탈이온수 9mL를 사용합니다. 튜브 C, D 및 E로 순차적으로 레이블을 지정합니다. 그 결과 mL당 10-1에서 10-5g의 토양이 연속적으로 희석됩니다.

박테리아 콜로니를 성장시키려면 미리 준비된 펩톤-효모 한천 플레이트 3개를 가져와서 C, D 및 E. Vortex로 레이블을 지정합니다. 해당 샘플과 피펫을 각 플레이트에 0.1mL씩 가열합니다. CFU는 mL 단위로 보고되므로 0.1mL를 사용하면 희석도가 10배 더 증가합니다.

다음으로 유리 스프레더를 에탄올에 담그십시오. 스프레더를 화염 속에 몇 초 동안 두어 에탄올을 점화하고 태웁니다. 이것은 스프레더를 살균합니다.

불꽃이 꺼질 때까지 첫 번째 플레이트 위의 스프레더를 잡습니다. 뚜껑을 가까이 잡고 접시를 빠르게 엽니다. 스프레더를 접종물에서 멀리 떨어진 한천에 접촉하여 식힌 다음 유리 액체의 흔적이 사라질 때까지 표면 주위에 접종물 방울을 펴 바릅니다. 플레이트 뚜껑을 교체합니다.

스프레더를 다시 점화하고 다음 플레이트로 프로세스를 반복하여 플레이트가 공기 중 유기체로 오염되지 않도록 빠르게 작업합니다. 한천에 수분이 떨어지지 않도록 플레이트를 뒤집고 일주일 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.

방선균을 성장시키려면 미리 준비된 글리세롤-카제인 플레이트 3개를 B, C, D로 표시합니다. 앞서 보여준 기술을 사용하여 현탁액 B, C, D에서 플레이트를 0.1mL 벌립니다. 방선균은 일반적으로 박테리아 개체군의 1/10로 존재하기 때문에 더 낮은 희석액이 사용됩니다.

마지막으로, 이 플레이트를 뒤집어 실온에서 2주 동안 보관합니다.

배양 후 모든 박테리아 플레이트를 주의 깊게 검사하고 군집 크기와 모양의 차이를 확인합니다. 한천에서 자랄 때 박테리아는 무색에서 밝은 주황색, 노란색 또는 분홍색에 이르는 끈적끈적한 군체를 생성합니다. 대조적으로, 방선균 군체는 백악질이고 단단하며 가죽 같으며 압력을 받으면 부서지며 다른 박테리아 군체가 번집니다. 이를 통해 군체는 멸균 루프로 접촉하여 구별할 수 있습니다.

방선균을 포함한 박테리아 군집의 수를 세고 기록합니다. 플레이트당 30-200개의 콜로니가 있는 플레이트만 계산하십시오.

특정 개별 박테리아의 배양을 성장시키려면 플레이트 중 하나에서 개별 콜로니를 선택하고 인접한 콜로니와 잘 분리된 콜로니를 선택합니다. 퍼짐 루프를 살균한 다음 플레이트를 열고 루프를 빈 곳에 대면 식힙니다. 다음으로, 루프에 관심 있는 식민지의 소량을 선택합니다.

신선한 펩톤 효모 플레이트를 가져 와서 한쪽에 몇 센티미터 길이의 줄무늬를 만듭니다. 살균하고 다시 식힌 다음 첫 번째 패스에서만 초기 줄무늬를 가로지르는 줄무늬를 만듭니다. 같은 방법으로 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 이 줄무늬 "희석"으로 인해 루프의 세포가 서로 분리됩니다. 플레이트를 어두운 곳에 놓고 실온에서 2주 동안 배양합니다.

박테리아 및 방선균 군집 수에서 토양 그램당 군집 형성 단위를 결정할 수 있습니다. 토양 1g당 콜로니의 수는 플레이트에 계산된 콜로니의 수에 플레이팅된 희석액의 역수를 곱한 값과 같습니다. 예를 들어, 0.1mL 접종제가 있는 10-5의 희석 플레이트에 46개의 집락을 계산하면 토양 그램당 CFU는 10-6 x 46 또는 토양 그램당 4,600만 CFU와 같습니다.

박테리아 계수 및 배양을 수행하는 것은 많은 과학적 조사 또는 프로토콜에서 중요한 첫 번째 단계입니다.

건강한 토양에는 그램당 106-108개의 박테리아가 포함되어 있습니다. 토양의 박테리아 계수는 관심 토양의 건강 상태를 결정하는 데 사용할 수 있으며, 그램당 106 및 108 미만의 박테리아 수는 건강하지 않거나 열악한 토양을 나타냅니다. 이는 영양소 또는 유기물 부족, 극심한 토양 pH로 인한 비생물적 스트레스 또는 토양 오염으로 인해 발생할 수 있습니다.

오늘날 의학에서 사용되는 많은 유형의 항생제는 토양에 서식하는 박테리아 또는 곰팡이에서 처음 확인되었습니다. 토양 배양에서 순수 균주를 분리하면 과학자들이 새로운 항생제 화합물을 식별하는 데 잠재적으로 도움이 될 수 있습니다. 여기서, 관심 있는 테스트 박테리아 또는 분리된 화합물을 박테리아 잔디로 자란 플레이트에 첨가할 수 있으며, 잔디 성장에 미치는 영향을 기록할 수 있습니다. 테스트 박테리아 또는 화합물에 의해 성장이 억제된 박테리아 잔디밭의 투명한 패치는 항생제 활성을 나타낼 수 있습니다.

완두콩과 콩을 포함한 콩과 식물은 질소 고정 박테리아와의 공생 관계에 의존합니다. 이 박테리아는 토양이나 뿌리 시스템의 결절 내에서 자유롭게 살며 식물이 사용하는 질소 화합물을 생성합니다. 척박한 토양에서 콩과 식물 작물에 토양에서 배양된 질소 고정 박테리아를 보충하면 식물의 성장과 건강을 향상시킬 수 있습니다. 이것은 더 크고 더 단단한 식물을 만들 수 있으며, 이는 차례로 더 많은 작물 수확량을 제공합니다.

당신은 방금 박테리아 계수에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이제 토양 샘플의 희석을 수행하는 방법, 집락 계수 및 집락 격리를 위해 도금하는 방법, 토양 샘플의 박테리아 수를 계산하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!