토양 샘플에서 박테리아 배양 및 나열

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Environmental Microbiology
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JoVE 과학 교육 Environmental Microbiology
Culturing and Enumerating Bacteria from Soil Samples

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10:57 min
April 30, 2023

개요

출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 – 애리조나 대학교
시연 저자: 브래들리 슈미츠와 루이사 이크너

표면 토양은 이차 골재를 형성하기 위해 함께 결합무기와 유기 입자의 이질 혼합물이다. 골재 안팎은 공기와 물을 시각적으로 포함하는 공극또는 모공이 있습니다. 이러한 조건은 박테리아에 대 한 이상적인 생태계를 만듭니다., 그래서 모든 토양 박테리아의 광대 한 인구를 포함, 일반적으로 이상 1 백만 토양의 그램 당.

박테리아는 프로카요테로 알려진 미생물의 가장 간단합니다. 이 대핵계 그룹 안에는 actinomycetes로 알려진 필라멘트 미생물이 있습니다. 액티노미세테는 실제로 박테리아이지만, 종종 자궁균을 형성하기 위해 함께 매달려 여러 세포로 구성된 필라멘티드 구조 때문에 박테리아분류 내에서 독특한 그룹으로 간주됩니다. 이 실험은 희석 및 도금 중에 액티노마이세테 콜로니를 선택하는 글리세롤 케이스 미디어를 사용합니다. 전형적으로, actinomycetes는 전체 세균성 인구의 대략 10%입니다. 박테리아와 액티노미세테는 지구상의 모든 환경에서 발견되지만 토양에 있는 이 미생물의 풍부하고 다양성은 비교할 수 없습니다. 이 세균은 또한 인간의 생활에 필수적이며 사람들이 먹고, 마시거나, 호흡하거나, 만지는지에 영향을 미칩니다. 또한, 사람을 감염시키고 질병을 일으킬 수 있는 세균성 종도 있으며, 사람을 치유할 수 있는 천연제품을 생산할 수 있는 박테리아가 있다. Actinomycetes는 연쇄상 구균과 같은 항생제를 생산하기 위해 특히 중요합니다. 박테리아는 영양 순환에 대 한 중요 한, 식물 성장, 그리고 유기 오염 물질의 저하.

박테리아는 토양에서 찾을 수 있는 종의 수측면에서 매우 다양, 부분적으로 그들은 생리및 대사 다양 하기 때문에. 박테리아는 이종성 위축될 수 있습니다, 그(것)들이 음식과 에너지를 위해 포도당과 같은 유기 화합물을 이용한다는 것을 의미합니다, 또는 autotrophic, 음식과 에너지를 위해 원소 황과 같은 무기 화합물을 이용한다는 것을 의미합니다. 그(것)들은 또한 호흡을 위한 산소를 이용하는, 또는 혐기성, 질산염 또는 황산염과 같은 산소의 결합한 양식을 이용하는, 호흡하기 위하여 호기성일 수 있습니다. 일부 박테리아는 산소 또는 산소의 결합 된 형태를 사용할 수 있으며, 능력 성 혐제로 알려져 있다.

Principles

Procedure

1. 토양 희석제 준비 절차를 시작하려면 토양 샘플 10g의 무게를 측정하고 95 mL의 탈온 화 물을 추가합니다. 서스펜션을 잘 흔들어 “A”라고 표시합니다. 토양이 정착하기 전에 멸균 파이펫으로 서스펜션 1mL를 제거하고 9mL 의 증분 비워로 옮기습니다. 소용돌이를 철저히 표시하고”B”로 라벨을 붙입니다. 이 희석 단계를 세 번 반복하며, 매번 이전 서스펜션의 1mL및 9mL 의 분수 블랭크를 반복한다. 이러한 레이블을 튜브 C, D 및 E로 순차적으로 라벨을 지정합니다. 이로 인해 mL당 10-1~10-5그램의 토양희석이 발생합니다. 2. 세균 문화를 위한 스프레드 플레이트 만들기 세균성 식민지를 성장시키기 위하여는, 3개의 미리 준비된 펩톤 효모 한천 판을 취하고 C, D 및 E. 소용돌이 견본 C, D 및 E, 및 파이펫 0.1 mL각 접시에 그(것)들을 레이블을 붙입니다. 이렇게 하면 희석 값을 10배 증가시킨다(C=10-3,D =10-4,E =10-5). 다음으로 유리 스프레더를 에탄올에 담급드세요. 스프레더를 화염에 몇 초 동안 놓고 에탄올을 점화하고 태워버린다. 이렇게 하면 스프레더가 소독됩니다. 불꽃이 꺼질 때까지 스프레더를 첫 번째 접시 위에 놓습니다. 뚜껑을 닫고 접시를 빠르게 엽니다. 스프레더를 접종(이노쿨룸 = 배양시 시작에 사용되는 세포)에서 멀리 떨어진 천에 터치한 다음, 자유 액체의 흔적이 사라질 때까지 천자의 표면 주위에 접종을 퍼뜨립니다. 플레이트 뚜껑을 교체합니다. 스프레더를 다시 불태우고 다음 플레이트로 프로세스를 반복하여 공기 중 유기체로 한고를 오염시키지 않도록 신속하게 작업합니다. 1 주일 동안 실온에서 박테리아 플레이트를 배양하십시오. 복어질 중에 플레이트가 반전되어 응축으로 인한 수분 방울이 천 표면에 떨어지는 것을 방지하십시오. 3. 액티노미세테스용 스프레드 플레이트 만들기 액티노마이세테를 성장시키기 위해 미리 준비된 글리세롤 카제인 플레이트 3개를 가지고 B, C 및 D. 이전에 도시된 기술을 사용하여 서스펜션 B, C 및 D에서 0.1 mL를 확산시니다. 저희석은 작용근세테가 전형적으로 세균 집단의 1/10th(B = 10-2, C =10-3,D = 10-4)로 존재하기 때문에 사용된다. 실온에서 액티노미세테 플레이트(반전)를 2주 동안 배양한다. 4. 세균 및 액티노미세테 카운트 인큐베이션 후 모든 박테리아 플레이트를 주의 깊게 살펴보고 식민지 크기와 모양의 차이를 주의하십시오. 한천에서 재배할 때 박테리아는 무색에서 밝은 오렌지, 노란색 또는 분홍색에 이르는 끈적끈적한 식민지를 생성합니다. 대조적으로, actinomycete 식민지는 백악질, 단단한, 가죽, 그리고 압력에서 중단됩니다, 그밖 세균성 식민지는 얼룩질 것입니다. 이를 통해 식민지는 멸균 루프와 접촉하여 구별할 수 있습니다. 계산 하 고 세균성 식민지의 수를 기록, 어떤 actinomycetes를 포함 하 여. 플레이트당 30-200개의 콜로니가 있는 플레이트만 계산합니다. 5. 순수한 문화의 고립 플레이트 중 하나에서 개별 세균 성 식민지를 선택합니다. 토양에 특별한 관심이 있는 경우 더 많은 식민지를 선택할 수 있습니다. 그것은 잘 분리 된 순수한 식민지를 가지고하는 경향이 있기 때문에, 높은 희석 판을 사용합니다. 이웃 식민지와 잘 분리된 식민지만 선택하고 서로 형태학적으로 구별되는 것처럼 보입니다. 알코올에 찍어 그것을 불타는하여 루프를 살균. 페트리 요리를 빠르게 열고 루프를 한천의 맨 자리에 터치하여 식힙니다. 그런 다음 루프에 소량의 관심 있는 콜로니를 제거합니다. 신선한 펩톤 효모 접시를 가지고, 한쪽에 몇 센티미터 길이의 줄무늬를 합니다. 살균하고 다시 식힌 다음 첫 번째 패스에서만 초기 연승을 가로지르는 연승을 만듭니다. 이 프로세스를 동일한 방식으로 두 번 더 반복합니다. 이 줄무늬 “희석”은 루프의 셀이 서로 분리되는 결과를 낳습니다. 2 주 동안 실온에서 배양하는 어두운 영역에 접시를 배치합니다.

Results

건조 중량 기준으로 수분 함량이 20%인 토양 10g 샘플은 희석 및 도금 기술을 통해 가능한 컬처 성 박테리아에 대해 분석됩니다. 희석은 표 1에표시된 대로 만들어졌습니다. 용액 의 1 mL은 적절한 배지에 도금되어 200 개의 박테리아 식민지를 초래합니다. 그러나, 습한 토양 10 g의 경우, <p class="…

Applications and Summary

토양 박테리아의 희석 및 도금의 두 가지 기본 응용 프로그램이 있습니다. 첫 번째 응용 프로그램은 특정 토양 내에서 컬터 박테리아의 열거입니다. 토양 박테리아의 수의 정량화는 토양 건강의 표시를 제공합니다. 예를 들어, 토양 의 그램 당 존재하는 106 받는 사람은 108 culturable 박테리아가있는 경우, 이것은 건강한 숫자로 간주 될 것이다. 그램당106 미만의 숫자는 낮은 ?…

내레이션 대본

1. 토양 희석제 준비 절차를 시작하려면 토양 샘플 10g의 무게를 측정하고 95 mL의 탈온 화 물을 추가합니다. 서스펜션을 잘 흔들어 “A”라고 표시합니다. 토양이 정착하기 전에 멸균 파이펫으로 서스펜션 1mL를 제거하고 9mL 의 증분 비워로 옮기습니다. 소용돌이를 철저히 표시하고”B”로 라벨을 붙입니다. 이 희석 단계를 세 번 반복하며, 매번 이전 서스펜션의 1mL및 9mL 의 분수 블랭크를 반복한다. 이러한 레이블을 튜브 C, D 및 E로 순차적으로 라벨을 지정합니다. 이로 인해 mL당 10-1~10-5그램의 토양희석이 발생합니다. 2. 세균 문화를 위한 스프레드 플레이트 만들기 세균성 식민지를 성장시키기 위하여는, 3개의 미리 준비된 펩톤 효모 한천 판을 취하고 C, D 및 E. 소용돌이 견본 C, D 및 E, 및 파이펫 0.1 mL각 접시에 그(것)들을 레이블을 붙입니다. 이렇게 하면 희석 값을 10배 증가시킨다(C=10-3,D =10-4,E =10-5). 다음으로 유리 스프레더를 에탄올에 담급드세요. 스프레더를 화염에 몇 초 동안 놓고 에탄올을 점화하고 태워버린다. 이렇게 하면 스프레더가 소독됩니다. 불꽃이 꺼질 때까지 스프레더를 첫 번째 접시 위에 놓습니다. 뚜껑을 닫고 접시를 빠르게 엽니다. 스프레더를 접종(이노쿨룸 = 배양시 시작에 사용되는 세포)에서 멀리 떨어진 천에 터치한 다음, 자유 액체의 흔적이 사라질 때까지 천자의 표면 주위에 접종을 퍼뜨립니다. 플레이트 뚜껑을 교체합니다. 스프레더를 다시 불태우고 다음 플레이트로 프로세스를 반복하여 공기 중 유기체로 한고를 오염시키지 않도록 신속하게 작업합니다. 1 주일 동안 실온에서 박테리아 플레이트를 배양하십시오. 복어질 중에 플레이트가 반전되어 응축으로 인한 수분 방울이 천 표면에 떨어지는 것을 방지하십시오. 3. 액티노미세테스용 스프레드 플레이트 만들기 액티노마이세테를 성장시키기 위해 미리 준비된 글리세롤 카제인 플레이트 3개를 가지고 B, C 및 D. 이전에 도시된 기술을 사용하여 서스펜션 B, C 및 D에서 0.1 mL를 확산시니다. 저희석은 작용근세테가 전형적으로 세균 집단의 1/10th(B = 10-2, C =10-3,D = 10-4)로 존재하기 때문에 사용된다. 실온에서 액티노미세테 플레이트(반전)를 2주 동안 배양한다. 4. 세균 및 액티노미세테 카운트 인큐베이션 후 모든 박테리아 플레이트를 주의 깊게 살펴보고 식민지 크기와 모양의 차이를 주의하십시오. 한천에서 재배할 때 박테리아는 무색에서 밝은 오렌지, 노란색 또는 분홍색에 이르는 끈적끈적한 식민지를 생성합니다. 대조적으로, actinomycete 식민지는 백악질, 단단한, 가죽, 그리고 압력에서 중단됩니다, 그밖 세균성 식민지는 얼룩질 것입니다. 이를 통해 식민지는 멸균 루프와 접촉하여 구별할 수 있습니다. 계산 하 고 세균성 식민지의 수를 기록, 어떤 actinomycetes를 포함 하 여. 플레이트당 30-200개의 콜로니가 있는 플레이트만 계산합니다. 5. 순수한 문화의 고립 플레이트 중 하나에서 개별 세균 성 식민지를 선택합니다. 토양에 특별한 관심이 있는 경우 더 많은 식민지를 선택할 수 있습니다. 그것은 잘 분리 된 순수한 식민지를 가지고하는 경향이 있기 때문에, 높은 희석 판을 사용합니다. 이웃 식민지와 잘 분리된 식민지만 선택하고 서로 형태학적으로 구별되는 것처럼 보입니다. 알코올에 찍어 그것을 불타는하여 루프를 살균. 페트리 요리를 빠르게 열고 루프를 한천의 맨 자리에 터치하여 식힙니다. 그런 다음 루프에 소량의 관심 있는 콜로니를 제거합니다. 신선한 펩톤 효모 접시를 가지고, 한쪽에 몇 센티미터 길이의 줄무늬를 합니다. 살균하고 다시 식힌 다음 첫 번째 패스에서만 초기 연승을 가로지르는 연승을 만듭니다. 이 프로세스를 동일한 방식으로 두 번 더 반복합니다. 이 줄무늬 “희석”은 루프의 셀이 서로 분리되는 결과를 낳습니다. 2 주 동안 실온에서 배양하는 어두운 영역에 접시를 배치합니다.