고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)

1. 모바일 단계 만들기

1. 약 1.5L의 정제 된 DI 물에 400 mL의 아세토나이트를 추가하여 이동 단계를 준비하십시오.
2. 이 용액에 2.4mL의 빙하 아세트산을 조심스럽게 추가하십시오.
3. 정제된 DI 물로 볼륨 플라스크에서 총 2.0 L의 부피로 용액을 희석합니다. 결과 솔루션은 2.8에서 3.2 사이의 pH가 있어야 합니다.
4. 보정된 디지털 pH 미터를 사용하여 수산화 나트륨40%를 추가하여 pH를 4.2로 조정합니다. pH가 4.0에 도달하면 매우 느리게 추가합니다. 이것은 달성하기 위해 약 50 방울이 소요됩니다.
5. 0.47-μm 나일론 66 멤브레인 필터를 통해 이동 단계를 필터링하여 용액을 탈착하고 크로마토그래피 컬럼을 연결할 수 있는 고체를 제거합니다. 기둥 입구의 고정 된 단계에서 공백을 유발하거나 검출기 세포로 작동하여 UV 흡광도로 불안정을 일으킬 수있는 거품을 피하기 위해 이동 단계를 탈염하는 것이 중요합니다.

2. 구성 요소 솔루션 만들기

만들어야 할 세 가지 구성 요소는 카페인 (0.8 mg / mL), 칼륨 벤조아테 (1.4 mg / mL), 아스파타메 (L-aspartyl-L-페닐라닌 메틸 에스테르) (6.0 mg/mL). 이러한 농도는 한때 같은 방식으로 희석되면 소다 샘플에서 발견되는 수준에서 표준을 넣습니다.

1. 500mL 체피 플라스크에 0.40 g의 카페인을 넣은 다음 DI 물로 500mL 마크에 희석합니다.
2. 벤조아테 0.70g을 500mL 체피플라스크에 넣은 다음 DI 물로 500mL 마크에 희석합니다.
3. 100mL 체피 플라스크에 아스파타메 0.60 g을 추가한 다음 DI 물로 100mL 마크에 희석합니다. 보관 시 분해를 방지하기 위해 이 솔루션을 냉장고에 놓습니다.

3. 7가지 표준 솔루션 만들기

세 가지 구성 요소는 모두 서로 다른 분포 계수를 가지며, 이는 각 단계가 모두 상호 작용하는 방식에 영향을 미칩니다. 분포 계수가 클수록 부품이 고정 단계에서 더 많은 시간을 소비하여 검출기에 도달하는 데 시간이 길어집니다.

1. 표 1의차트에 따라 각 구성 요소의 적절한 양을 50mL 체적 플라스크로 파이프합니다.
2. 각 스톡 솔루션을 볼륨 플라스크의 50mL 마크에 모바일 단계로 희석합니다.
3. 각 표준 솔루션을 샘플 랙에 라벨이 부착된 작은 바이알에 붓습니다.
4. 50mL 체적 플라스크에 남은 솔루션과 함께 샘플 랙을 냉장고에 보관합니다.

4. HPLC 시스템의 초기 설정 확인

1. 폐기물 라인이 폐기물 용기에 있고 이동 단계로 다시 재활용되지 않는지 확인합니다.
2. 이동 단계의 유량이 0.5mL/min으로 설정되어 있는지 확인합니다. 이것은 모든 피크가 5 분 이내에 elute에 충분히 높고 좋은 해상도를 허용 할 수있을만큼 느립니다.
3. 최소 및 최대 압력 및 유량이 용매 전달 시스템(펌프)의 전면 패널의 올바른 값으로 설정되어 있는지 확인합니다.
   1. 최소 압력 설정: 250 psi (누출이 발생하는 경우 펌프를 차단하는 것입니다).
   2. 최대 압력 설정: 4,000 psi(나막신이 형성되는 경우 펌프가 파손되지 않도록 보호하는 것입니다).
4. 공백을 설정하려면 검출기의 전면 패널에서 "0"을 눌러 (공백은 순수한 이동 단계입니다).
5. 100μL 주사기를 탈온화된 물로 헹구고, 분석해야 할 작업 표준 중 하나의 여러 부피를 분석하고 주사기를 해당 솔루션으로 채웁니다. 관심 있는 각 구성 요소의 피크를 식별할 수 있는 3개의 단일 구성 요소 샘플로 시작합니다.

5. 샘플 및 데이터 수집을 수동으로 삽입

1. 인젝터 핸들을 하중 위치에 배치하면 중격 포트를 통해 100 μL의 용액을 천천히 주입하십시오.
2. 데이터 수집 프로그램이 300s에 대한 데이터를 수집하도록 설정되어 있는지 확인하여 3개의 피크가 모두 검출기를 통해 엘로테할 수 있는 충분한 시간을 할애할 수 있습니다.
3. 평가판을 시작할 준비가 되면 인젝터 핸들을 삽입 위치로 회전(샘플을 모바일 단계에 삽입) 즉시 컴퓨터 데이터 수집 프로그램에서 "평가판 시작"을 클릭합니다. 표준 1-3의 경우 실행 중에 3개의 순차 피크 중 하나만 화면에나타납니다(그림 1).
4. 300이 지나면 데이터 수집은 데이터 파일을 저장하는 프롬프트를 보냅니다. 적절한 파일이름(예:STD#1)으로 데이터를 저장합니다.
5. 각 평가판의 피크에 대한 몇 초 의 시간을 기록하며, 이 시간은 해당 구성 요소를 식별하는 데 사용됩니다.
6. 중격에서 주사기를 제거하고 첫 번째 실행에서 결정된 크로마토그램 당 동일한 시간을 사용하여 나머지 각 작업 표준에 대한 프로세스를 반복합니다.

그림 1. 3 성분의 크로마토그램. 왼쪽에서 오른쪽으로, 그들은 카페인, 아스파타메, 벤조아테입니다.

6. 다이어트 탄산음료 샘플

다이어트 콜라, 다이어트 펩시, 콜라 제로는 "미지수"입니다. 그들은 거품이 HPLC 시스템에 좋지 않기 때문에 탄산을 제거하기 위해 하룻밤 동안 열린 용기에 빠져 나왔습니다. 이것은 충분히 샘플의 가스를 제거합니다.

1. 다이어트 소다의 약 2mL를 플라스틱 주사기에 넣습니다.
2. 필터 팁을 Luer-Lok를 통해 주사기에 부착하여 제자리에 비틀어 놓습니다.
3. 주사기의 액체를 필터를 통해 작은 유리 바이알로 밀어 넣습니다. 이렇게 하면 분리 열을 막을 수 있는 원치 않는 미립자를 제거합니다.
4. 각 시료를 동일한 양의 DI 물로 희석하여 순도가 50%에 달합니다.
5. 샘플의 100 μL을 샘플 루프에 주입하고 표준과 동일한 매개 변수로 시험을 실행합니다.

7. 계산

1. 성분 용액의 농도에서 7개의 시료에 대해 만들어진 희석을 기반으로 표준의 모든 성분의 농도를 계산합니다.
2. 각 표준에 대한 크로마토그램의 피크 영역과 1/2 높이에서 폭의 피크 높이 시간과 동일한 삼각형 방법에 의해 알려지지 않은 시료를 결정합니다(그림2). 각 구성 요소가 각각의 피크를 표시하는 데 걸리는 시간을 기준으로 각 구성 요소에 해당하는 피크를 결정한 후 이러한 피크 영역을 컴퓨터 스프레드시트에 입력합니다.
3. 세 가지 구성 요소에 대한 표준에서 피크 영역 대 농도(mg/L)의 교정 곡선을 만듭니다.
4. 각 교정 곡선에 맞는 최소 사각형을 결정합니다.
5. 샘플에 대한 HPLC 시험에서 표시된 피크 영역에서 다이어트 소다의 각 성분의 농도를 계산합니다. 다이어트 소다는 HPLC 시스템에 주입하기 전에 2의 요인에 의해 희석되었다는 것을 기억하십시오.
6. 다이어트 소다의 각 성분의 mg/L양을 계산합니다.
7. 결과에 따라 12 온스의 소다 캔에 있는 각 성분의 밀리그램을 계산합니다. 12 온스 = 354.9 mL을 가정합니다.

그림 2. 곱해야 하는 곡선의 피크 높이와 너비의 기본 예입니다(높이 시간 폭은 1/2 높이).