3.4: 교정 곡선

1. 표준 만들기: 직렬 희석

1. 표준의 농축 재고 솔루션을 만드십시오. 전형적으로, 화합물은 정확하게 밖으로 무게다음 양적 플라스크로 정량적으로 전송된다. 일부 용매를 추가, 샘플이 용해되도록 혼합, 다음 적절한 용매와 라인에 채우기.
2. 직렬 희석을 수행합니다. 희석에 필요한 표준의 양을 다른 체피 플라스크와 파이펫을 가져 간 다음 용매로 라인에 채우고 혼합하십시오. 10배 희석은 전형적으로 이루어지므로 10mL 체적 플라스크의 경우 이전 희석의 1mL를 추가합니다.
3. 더 많은 희석에 필요한 대로 계속, 다음 샘플을 만들기 위해 희석하기 위해 이전 솔루션에서 파이펫. 좋은 교정 곡선을 위해서는 적어도 5 개의 농도가 필요합니다.

2. 교정 곡선및 알 수 없는 샘플 실행

1. UV-Vis 분광광계로 샘플을 실행하여 교정 곡선에 필요한 기악 반응을 결정합니다.
2. 첫 번째 샘플로 읽기를 가져 가라. 체계적인 오류가 있는 경우 무작위로 샘플을 실행하는 것이좋습니다(즉, 가장 높거나 가장 높지 않음에서 가장 높지 않음에서 가장 높지 않음). 소음의 추정을 얻으려면 주어진 샘플 3-5x에서 판독값을 반복하십시오.
3. 추가 표준 샘플을 실행하여 각 샘플에 대한 측정을 반복하여 잡음의 추정값을 얻습니다. 나중에 플롯을 만들 도록 데이터를 기록합니다.
4. 알 수 없는 샘플을 실행합니다. 가능한 한 표준을 실행하는 것과 유사한 조건을 사용합니다. 따라서, 샘플 매트릭스 또는 버퍼는 동일해야 하며, pH는 동일해야 하며, 농도는 표준 실행의 범위에 있어야 한다.

3. 교정 곡선 만들기

1. 스프레드시트에 데이터를 기록하고 컴퓨터 프로그램을 사용하여 데이터 대 농도를 플롯합니다. 각 점에 대해 적어도 트리플리케이트 측정을 수행한 경우 오류 막대는 각 점의 오류를 추정하기 위해 해당 측정값의 표준 편차를 플로팅할 수 있습니다. 일부 곡선의 경우 데이터를 선을 얻으려면 로그로 축으로 플로팅해야 할 수 있습니다. 교정 곡선을 제어하는 방정식은 일반적으로 미리 알려지므로 방정식에 로그가 있을 때 로그 플롯이 사용됩니다.
2. 교정 곡선을 검사합니다. 선형으로 보이나요? 비선형으로 보이는 부분이있습니까(예: 기악 응답의 한계에 도달)? 확인하려면 모든 데이터를 소프트웨어를 사용하여 선형 회귀에 맞춥시게 합니다. 결정계수(R2)가높지 않은 경우, 선에 맞지 않는 커브의 시작 또는 끝에 있는 일부 점을 제거하고 선형 회귀를 다시 수행한다. 큰 오류 표시줄이 있기 때문에 중간에 있는 점을 제거하는 것은 허용되지 않습니다. 이 분석에서 곡선의 어떤 부분이 선형인지 결정합니다.
3. 선형의 출력은 m이 경사이고 b가 y-intercept인 형식 y=mx+b의 방정식이어야 합니다. 경사의 단위는 y축 단위/농도이며, 이 예에서(도 1)흡광도/μM이다. y-intercept 단위는 y축 단위입니다. 결정계수(R2)가 얻어진다. R^2가 높을수록 적합도가 높아진다. 완벽한 핏으로 R^2의 1이 됩니다. 프로그램은 또한 경사 및 가로채기에 오류의 추정을 제공 할 수 있습니다.

4. 결과: 블루 염료의 흡수도 보정 곡선 #1

1. 파란색 염료 #1(631nm)의 흡수를 위한 교정 곡선은아래(그림 1)를도시한다. 응답은 0에서 10 μM까지 선형입니다. 그 농도는 반응이 UV-Vis 분광포토미터의 선형 범위를 벗어났기 때문에 신호가 평준화되기 시작합니다.
2. LOD를 계산합니다. 교정 곡선의 경사에서 LOD는 3 *S.D. (노이즈)/m입니다. 이러한 교정 곡선의 경우, 노이즈는 반복 측정의 표준 편차를 취하여 얻어졌고 0.021이었다. LOD는 3*0.021/.109=0.58 μM입니다.
3. LOQ를 계산합니다. LOQ는 10*S.D.(노이즈)/m입니다. 이 교정 곡선의 경우 LOQ는 10*0.021/.109 =1.93 μM입니다.
4. 알 수없는 농도를 계산합니다. 선 방정식을 사용하여 알 수 없는 샘플의 농도를 계산합니다. 교정 곡선은 알 수 없는 것이 표준 샘플의 선형 범위에 속하는 경우에만 유효합니다. 판독값이 너무 높으면 희석이 필요할 수 있습니다. 이 예에서는 알 수 없는 스포츠 음료가 1:1로 희석되었습니다. 흡광도는 0.243이고 이것은 2.02 μM의 농도에 해당했다. 따라서 스포츠 음료에서 #1 청색 염료의 최종 농도는 4.04 μM이었다.

그림 1. 블루 염료의 UV-Vis 흡수를 위한 교정 곡선. 왼쪽: 흡광도는 #1 있는 청색 염료의 다른 농도로 측정되었습니다. 흡광도가 1이상인 10μM 이후에 응답이 레벨오프됩니다. 오류 막대는 동일한 샘플의 반복된 측정에서 발생하며 표준 편차입니다. 오른쪽: 교정 곡선의 선형 부분은 선, y=0.109*x + 0.0286에 맞습니다. 알 수 없는 데이터는 검은색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

검량선은 분석물에 대한 기기 반응을 이해하고 시료 내 분석물의 농도를 예측하는 데 사용됩니다.

검량선은 먼저 분석물의 농도가 알려진 표준 용액 세트를 준비하여 생성됩니다. 기기 응답은 각각에 대해 측정되고 표준 용액의 농도 대비 플롯됩니다. 그런 다음 이 플롯의 선형 부분을 사용하여 농도에 대한 반응을 상관시켜 분석물 샘플의 농도를 예측할 수 있습니다.

이 비디오는 일련의 표준물질의 준비를 시연한 후 농도를 알 수 없는 샘플을 분석하는 방법을 보여줌으로써 검량선과 그 사용법을 소개합니다.

일련의 표준 용액이 검량선을 준비하는 데 사용됩니다. 이러한 용액은 분석물의 대략적인 농도를 포함하는 다양한 농도로 구성됩니다.

표준 용액은 종종 연속 희석으로 준비됩니다. 연속 희석은 먼저 분석물의 원액을 준비하여 수행됩니다. 그런 다음 원액은 알려진 양, 종종 한 자릿수만큼 희석됩니다. 그런 다음 새 용액을 동일한 방식으로 희석합니다. 그 결과 농도가 여러 자릿수에 이르는 용액 세트가 생성됩니다.

검량선은 기기 신호 대 농도를 표시한 그래프입니다. 표준의 플롯은 선형이어야 하며 방정식 y=mx+b에 맞을 수 있습니다. 플롯의 비선형 부분은 이러한 농도 범위가 선형성 한계를 벗어나므로 버려야 합니다.

그런 다음 최적선 방정식을 사용하여 기기 신호를 사용하여 농도와 상관 관계를 파악함으로써 샘플의 농도를 결정할 수 있습니다. 측정값이 있는 샘플이 플롯의 선형 범위를 벗어나면 선형 범위 내에 있도록 희석해야 합니다.

기기의 감지 한계 또는 노이즈에 대해 통계적으로 결정할 수 있는 최소 측정값도 교정 곡선에서 계산할 수 있습니다. 블랭크 샘플은 여러 번 측정됩니다. 검출 한계는 일반적으로 평균 공백 신호에 표준 편차의 3배를 더한 값으로 정의됩니다.

마지막으로, 수량화의 한계도 계산할 수 있습니다. 정량화의 한계는 정확하게 정량화할 수 있는 분석물의 가장 낮은 양입니다. 이는 ?blank 신호보다 10 표준 편차 높은 값으로 계산됩니다.

지금까지 검량선의 기초를 배웠으니 이제 실험실에서 검량선을 준비하고 사용하는 방법을 알아보겠습니다.

먼저, 표준의 농축 원액을 준비합니다. 표준물질을 정확하게 칭량하고 부피 플라스크로 옮깁니다. 소량의 용매를 넣고 샘플이 용해되도록 혼합합니다. 그런 다음 라인에 용매를 채웁니다. 샘플과 동일한 용매를 사용하는 것이 중요합니다.

표준물질을 준비하려면 부피 플라스크에 필요한 양을 피펫팅합니다. 그런 다음 플라스크를 라인에 용매로 채우고 혼합하십시오.?

원액에서 피펫팅하고 희석하여 표준물질을 계속 만듭니다. 양호한 검량선을 위해서는 최소 5개의 농도가 필요합니다.

이제 분석 기기(이 경우 UV-Vis 분광 광도계)로 샘플을 실행하여 검량 곡선에 필요한 기기 반응을 측정합니다.

첫 번째 표준을 측정합니다. 시스템적 오류가 있는 경우 임의의 순서로 표준을 실행합니다. 각 표준을 3?5x?측정하여 노이즈 추정치를 얻습니다.

나머지 표준물질을 측정하고 각각에 대해 측정을 반복합니다. 모든 데이터를 기록합니다.

마지막으로 샘플을 실행합니다. 표준에 사용된 것과 동일한 샘플 매트릭스 및 측정 조건을 사용합니다. 샘플이 기기의 표준 및 한계 범위 내에 있는지 확인하십시오.

검량선을 구성하려면 컴퓨터 프로그램을 사용하여 데이터를 신호 대 농도로 플롯합니다. 각 데이터 점에 대한 반복 측정의 표준 편차를 사용하여 오차 막대를 만듭니다.

곡선에서 비선형 부분을 제거한 다음 선형 회귀를 수행하고 최적선을 결정합니다. 출력은 y = m x + b 형식의 방정식이어야 합니다. R2 값이 1에 가까우면 적합하다는 것을 나타냅니다.

이것은 631 nm에서 측정된 청색 염료 #1에 대한 검량선입니다. 응답은 0mM에서 15mM 사이의 선형입니다.

최적선 방정식을 사용하여 샘플의 농도를 계산합니다. 샘플의 흡광도는 0.141이었고 6.02mM의 농도에 해당했습니다.

지금까지 UV-Vis 분광광도계와 함께 검량선을 사용하는 방법을 살펴보았으므로 이제 몇 가지 다른 유용한 Application을 살펴보겠습니다.

검량선은 전기화학 응용 분야에서 자주 사용되는데, 전극 신호는 용액의 이온 농도에 맞게 교정되어야 하기 때문입니다. 이 예에서는 불소에 대한 이온 선택성 전극에 대한 데이터가 수집되었습니다.

농도 데이터는 선을 얻기 위해 로그 스케일에 표시해야 합니다. 이 검량선은 치약이나 식수와 같은 용액 내 불소 농도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 분석 화학에서 많이 사용되는 분리 및 분석 기술입니다. HPLC는 분자가 크로마토그래피 컬럼의 길이를 이동하는 데 필요한 시간을 기준으로 혼합물의 구성 요소를 분리합니다. 이 시간은 분자의 화학적 특성의 범위에 따라 다릅니다.

분자의 용리는 검출기를 사용하여 측정되어 크로마토그램이 생성됩니다. 피크 면적은 인기 있는 소다 성분의 예와 같이 다양한 표준 용액의 간단한 보정 곡선을 사용하여 농도와 상관관계를 가질 수 있습니다.

용액 매트릭스가 용질 측정을 방해하는 일부 경우에는 기존 검량선이 부정확할 수 있습니다. 이러한 경우 수정된 검량선이 준비됩니다. 이를 위해 다양한 표준 용액 부피가 샘플에 추가됩니다. 신호 대 농도 플롯이 생성되며, 여기서 x 절편은 샘플 용액의 원래 농도와 같습니다. 이 기술에 대한 자세한 내용은 JoVE 과학 교육 비디오 "표준물질 덧셈 방법"을 시청하십시오.

방금 JoVE의 캘리브레이션 곡선 소개를 시청했습니다. 이제 검량선이 사용되는 위치, 검량선을 생성하는 방법 및 검량선을 사용하여 시료 농도를 계산하는 방법을 이해해야 합니다.

언제나 그렇듯이 시청해 주셔서 감사합니다!