3.5: 자외선 눈에 보이는 (UV-Vis) 분광법

1. 분광계 교정

1. UV-Vis 분광기를 켜고 램프가 적절한 기간(약 20분)동안 예열하여 안정화되도록 합니다.
2. 큐벳을 샘플용 용매로 채우고 외부가 깨끗한지 확인합니다. 이것은 빈 역할을하고 용매에 의한 산란 또는 흡수로 인한 가벼운 손실을 설명하는 데 도움이됩니다.
3. 큐벳을 분광계에 놓습니다. 큐벳은 핸들링(홈일 수 있음)을 위한 양면을 가지고 있으며 빛을 비추기 위한 것이 아니기 때문에 큐벳을 올바르게 정렬해야 합니다.
4. 빈 공간을 읽으십시오. 흡수도는 최소화해야 하지만, 흡수도는 향후 샘플에서 빼야 합니다. 일부 계측기는 빈 데이터를 저장하고 빼기 작업을 자동으로 수행할 수 있습니다.

2. 흡광스펙트럼 수행

1. 큐벳을 샘플로 채웁니다. 전송이 정량적인지 확인하려면 큐벳을 샘플로 두 번 헹구고 약 3/4 전체를 채웁니다. 외부가 지문 등을 깨끗하게 하고 있는지 확인하십시오.
2. 큐벳을 분광기에 올바른 방향으로 배치합니다.
3. 큐벳을 덮어 주변 광을 방지합니다.
4. 악기가 다른 파장을 통해 스캔하고 흡수도를 수집 할 수 있도록하여 흡수 스펙트럼을 수집합니다. 파장 범위는 특정 샘플에 대한 정보로 설정할 수 있지만 200-800 nm의 범위는 표준입니다. 다이오드 어레이 계측기는 한 번의 실행으로 전체 흡광도 스펙트럼을 수집할 수 있습니다.
5. 수집된 흡수 스펙트럼으로부터, 흡수도 최대(λ_max)를결정한다. 스펙트럼의 컬렉션을 반복하여 λ 최대값에서 오차 추정치를_{얻습니다.}
6. 교정 곡선을 만들려면 다양한 농도 샘플의 UV-Vis 스펙트럼을 수집합니다. 분광계는 종종 선형 범위에서 제한되며 1.5보다 큰 흡광도 값을 측정할 수 없습니다. 샘플의 흡광도 값이 계측기의 선형 범위 외부에 있는 경우 샘플을 희석하여 선형 범위 내에서 값을 가져옵니다.

3. UV-비스 분광기와 운동 실험

1. UV-Vis는 시간이 지남에 따라 흡광도의 변화를 검사하여 운동 실험에 사용할 수 있습니다. 운동 학 실험의 경우 샘플을 초기 읽기로 하십시오.
2. 시약을 빠르게 추가하여 화학 반응을 시작합니다.
3. 잘 저어서 샘플과 섞습니다. 소량이 추가되면 큐벳에서 이 작업을 수행할 수 있습니다. 또는 시약을 시료와 혼합하여 큐벳에 빠르게 붓습니다.
4. 시간이 지남에 따라 관심 있는 단량에 대 한 λ_최대에서 흡광도측정. 측정 중인 시약을 사용하는경우(즉, 흡수시약이 적기 때문에 흡수성이 올라가고 있음), 부패는 반응의 순서를 나타냅니다.
5. 교정 곡선을 사용하여, 흡수성 값을 농도로 변환, 시간 대 Aalyte 농도의 플롯을 합니다. 거기에서,이 그래프는 반응 속도 상수를 결정하기 위해 적절한 방정식에 맞을 수 있습니다.

자외선 가시광선 또는 UV-Vis, 분광법은 실험실에서 가장 널리 사용되는 분석 기법 중 하나입니다.

UV-Vis 분광법에서 빛은 UV™ 또는 가시광선 스펙트럼의 특정 파장에서 샘플을 통과합니다. 샘플이 빛의 일부를 흡수하면 모든 빛이 통과하거나 투과되는 것은 아닙니다. 투과율은 입사광에 대한 투과광의 강도의 비율이며 흡광도와 상관관계가 있습니다. 흡광도는 샘플의 농도를 얻기 위해 정량적 방식으로 사용할 수 있습니다. 또한 정성적 방식으로 사용하여 흡광도 스펙트럼이라고 하는 다양한 파장에서 측정된 흡광도를 게시된 데이터와 일치시켜 화합물을 식별할 수 있습니다. 이 동영상은 UV-Vis 분광법을 소개하고 실험실에서 시료 농도 및 반응 역학을 결정하는 데 UV-Vis 분광법이 어떻게 사용되는지를 보여줍니다.

광자가 분자에 부딪혀 흡수되면 분자는 바닥 상태에서 더 높은 에너지 상태로 승격됩니다. 둘 사이의 에너지 차이는 밴드 갭입니다. 광자의 에너지는 광자가 흡수되기 위해 밴드 갭과 정확히 일치해야 합니다. 화학 구조는 밴드 갭을 결정합니다. 따라서 분자는 각각 고유한 흡광도 스펙트럼을 가지고 있습니다.

흡광도는 Beer의 법칙을 따르며, 이 법칙에 따르면 흡광도는 몰 감쇠 계수에 경로 길이 및 농도를 곱한 값과 같습니다. 몰 감쇠 계수는 특정 파장의 빛을 흡수하는 개별 화합물의 능력과 관련이 있습니다. 경로 길이는 빛이 샘플을 통해 이동한 거리를 나타내며, 일반적으로 표준 큐벳의 경우 1cm입니다. Beer의 법칙은 흡수율이 알려진 경우 시료 농도를 계산하는 데 사용할 수 있거나 보정 곡선을 사용할 수 있습니다.

UV-Vis는 대부분의 분자가 UV 가시광선 파장 범위의 빛을 흡수하기 때문에 종종 일반 기술이라고 합니다. UV 범위는 100μm 400nm, 가시 스펙트럼 범위는 400μm 700nm입니다. 그러나 대부분의 분광 광도계는 100?200nm의 깊은 자외선 범위에서 작동하지 않습니다.이 범위의 광원은 비싸기 때문입니다. 대부분의 UV-Vis 분광 광도계는 170?375nm의 빛을 생성하는 UV 범위의 경우 중수소 램프를 사용하고, 가시 범위의 경우 350-2,500nm의 빛을 생성하는 텅스텐 필라멘트 램프를 사용합니다.

광원은 일반적으로 넓은 파장 범위를 가진 램프이기 때문에 특정 흡광도 파장은 필터 또는 모노크로메이터를 사용하여 선택합니다. 모노크로메이터(monochromator)는 빛의 파장을 공간적으로 분리한 다음 원하는 빛의 파장이 있는 곳에 출구 슬릿을 배치하는 장치입니다. 모노크로메이터는 전체 흡광도 스펙트럼을 제공하기 위해 파장 범위에서 스캔할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 광범위한 분자를 정량화하고 식별하는 데 유용합니다.

UV-Vis 분광광도계의 기본 사항을 설명했으므로 이제 실험실에서 간단한 UV-Vis 실험을 살펴보겠습니다.

측정을 시작하기 전에 분광 광도계를 켜고 lamps를 안정화하기 위해 적절한 시간 동안 예열합니다.

깨끗한 큐벳에 샘플 용매를 채워 블랭크를 준비한 다음 보푸라기가 없는 종이로 바깥쪽을 닦아 지문을 제거합니다.

큐벳이 빔 경로 바깥쪽의 홈이 있는 면과 올바르게 정렬되었는지 확인하고 분광 광도계에 삽입합니다. 주변 조명이 시스템에 유입되지 않도록 덮개를 고정합니다.

한 파장 또는 파장 범위에서 블랭크의 흡광도를 측정합니다. 흡광도는 샘플의 흡광도에서 빼야 하므로 기록하거나 저장하십시오.

다음으로, 블랭크를 버리고 큐벳을 샘플로 두 번 헹굽니다. 그런 다음 큐벳을 약 ? 샘플로 가득 차있습니다. 큐벳 외부를 다시 닦아 깨끗하고 지문이 없는지 확인합니다.

분광 광도계에 큐벳을 올바른 방향으로 놓고 뚜껑을 고정합니다.

블랭크와 동일한 파장 또는 파장 범위에서 흡광도 측정 또는 스펙트럼을 수집합니다. 기기가 자동으로 블랭크 스펙트럼 또는 측정을 수행하지 않는 경우 빼십시오.

수집된 흡광도 스펙트럼에서 최대 흡광도 또는 ?최대를 결정합니다.

샘플의 분석물 양을 정량화하려면 알려진 분석물 농도 범위를 사용하여 검량선을 생성합니다. 검량선을 구성하고 사용하는 방법에 대한 자세한 내용은 이 컬렉션의 비디오 "검량선"을 시청하십시오.

흡광도 측정은 또한 반응 전반에 걸쳐 화합물 농도의 증가 또는 감소를 측정하여 반응 역학을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 반응 전 최대 흡광도에서 샘플(이 경우 파란색 염료)의 초기 판독을 수행하는 것으로 시작합니다.

다음으로, 시약(이 경우 표백제)을 빠르게 첨가하여 화학 반응을 시작합니다. 샘플과 섞이도록 잘 저어줍니다.

시간이 지남에 따라 최대 흡광도에서 흡광도를 측정합니다.

청색 염료 샘플의 초기 흡광도 스펙트럼이 표시됩니다. 배경색은 가시 스펙트럼의 빛의 색상을 보여줍니다. 청색 염료는 약 630nm에서 최대 흡광도를 갖습니다.

청색 염료와 표백제 사이의 반응 역학은 시간이 지남에 따라 측정되었습니다. 파란색 염료의 흡수력은 표백제와 반응하기 때문에 시간이 지남에 따라 감소합니다. 흡광도는 300초 후에 거의 0에 도달하여 반응이 거의 완료되었음을 나타냅니다. 역학 및 반응에 대한 자세한 내용은 JoVE 과학 교육 비디오 "반응 속도 법칙"을 시청하십시오.

UV-Vis 분광광도계는 샘플을 식별하거나 정량화하기 위해 다양한 연구 분야에서 많이 사용됩니다.

예를 들어, UV-Vis 분광법은 시료 내 단백질의 양을 정량화하기 위해 생물학 분야에서 많이 사용됩니다. Bradford 분석은 염료를 사용하여 단백질을 정량화하는 데 자주 사용됩니다. 먼저, 일반적으로 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)을 사용하여 알려진 단백질 농도의 검량선을 준비합니다. 그런 다음 Coomassie blue stain이 각 표준물질과 샘플에 추가됩니다. 그런 다음 단백질-염료 복합체의 흡광도를 595nm에서 측정합니다.

또는 단백질을 280nm에서 흡광도로 직접 측정할 수 있습니다. 이 예에서는 초저용량 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 정량화합니다. 많은 단백질에서 1의 흡광도는 1mg/mL의 농도와 관련이 있습니다.

UV-Vis 분광광도계는 세포 배양에서 박테리아 세포의 양을 정량화하는 데에도 사용됩니다. 이 측정을 위해 흡광도 또는 광학 밀도는 600nm에서 측정됩니다. 일반적으로 OD600 측정값이 1이면 mL당 8 x 108 박테리아 세포가 존재함을 나타냅니다. 배양 성장 전반에 걸쳐 세포 밀도를 측정하면 박테리아 성장 곡선을 측정할 수 있으며 배양이 기하급수적 성장 단계에 있는 시점을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

질소산화물과 이산화질소(NOx)는 자동차 배기가스의 부산물이며 유해한 대류권 오존을 형성하기 때문에 환경에 해로울 수 있습니다. NOx는 sulfanilic acid 및 napthyl-ethylenediamine의 용액과 반응시켜 측정 할 수 있습니다. 생성된 용액은 분홍색의 아조 염료 분자이며, 그 강도는 NOx 농도와 직접적인 상관관계가 있습니다. 그런 다음 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 이 농도를 측정할 수 있습니다.

UV 가시광선 분광법에 대한 JoVE의 소개를 방금 시청하셨습니다. 이제 UV-Vis 작동의 기본 사항, UV-Vis를 사용하여 샘플을 측정하는 방법 및 흡광도와 샘플 농도의 상관 관계를 파악하는 방법을 이해해야 합니다.

시청해 주셔서 감사합니다!