칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

본 영상에서는 병아리 배아의 신경 유도 분석을 위한 다양한 단계를 보여줍니다. 먼저, 수혜 배아를 적출하여 새로운 배양액에 넣습니다. 공여 배아는 식염수 내에서 적출하며, 헨슨 결절(Henson's node)을 형광 염료로 표지합니다. 공여 배아에서 헨슨 결절을 절제하여 수혜 배아에 이식합니다.

숙주 배아를 24시간 동안 배양한 후, 고정시키고 형광 하에서 광산화를 위해 처리합니다. DAB를 사용하여 처리합니다. 배아를 신경 마커를 이용한 인시튜 하이브리다이제이션(in-situ hybridization)으로 처리합니다.

안녕하세요, 저는 휴스턴 소재 텍사스 A&M 대학교 환경 및 유전체 의학 센터의 Labor Fennell 소속 Delphine입니다. 오늘은 닭 배아에서 신경 유도 분석을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 항경련제가 헨젠 결절(Hensen's node)의 신경 유도 특성에 미치는 영향을 연구하고 있습니다.

이제 시작하겠습니다. 신경 유도 분석을 위해 난자를 준비해야 합니다. 이 난자들은 습윤 배양기에서 옆으로 눕힌 상태로 13시간 동안 배양하여 햄버거 및 해밀턴 단계 3+ 또는 HH 3+ 단계가 되도록 해야 합니다.

다음으로, 이전에 입증된 새로운 배양법을 사용하여 숙주 배아를 준비합니다. JoVE에서는 숙주 배아의 표면을 200 microliters 식염수로 덮어줍니다. 이렇게 하면 추후 공여 이식편의 전이 및 위치 선정이 용이해집니다.

마지막으로, 뒤집은 Falcon 35 millimeter 배양 접시로 어셈블리를 덮습니다. 공여 배아를 꺼내기 위해 핀셋으로 껍질을 톡톡 쳐서 달걀을 엽니다. 껍질의 윗부분을 제거하고 폐기합니다.

핀셋으로 두꺼운 알부민을 제거하고, 거친 핀셋으로 난황낭을 기울여 배아가 위를 향하게 합니다. 알부민을 제거한 후, 미세 가위를 사용하여 배아 주변의 난황낭을 사각형 모양으로 절개합니다. 스푼을 사용하여 난황에서 배아를 분리한 다음 PBS가 담긴 접시에 옮깁니다.

다음으로, 핀셋을 사용하여 공여 배아를 난황 및 area lucida로부터 분리합니다. 분리가 완료되면, 공여 배아를 PBS가 담긴 SIL guard 커버 유리 접시로 옮겨 이식편을 표시하고 이식합니다. 현미경 하에서 마이크로 전극 풀러(micro electrode puller)를 사용하여 50 µL 유리 마이크로 모세관 피펫을 제작합니다.

미세 핀셋을 사용하여 마이크로 피펫의 끝부분을 자릅니다. 모델링 점토 띠가 깔린 페트리 접시에 마이크로 피펫을 놓습니다. 다음으로, 이식 전 이식편을 표지하는 데 사용할 염료 용액을 준비합니다.

먼저, 1 mL의 절대 에탄올에 0.5% 농도의 dye eye 스톡을 준비합니다. 이 스톡은 영하 20°C의 암소에 보관할 수 있습니다. 그 다음 45°C로 설정된 히트 블록에서, 미리 가온된 10 µL의 dai 스톡을 90 µL의 0.3 M sucrose와 혼합합니다. 이 온도는 dai의 침전과 불용성 결정의 형성을 방지하기 위해 필요합니다.

미니 SPECT 원심분리기에서 용액을 5~10초 동안 짧게 원심 분리합니다. 이제 DAI 용액을 사용할 준비가 되었습니다. 곤충 핀을 사용하여 기증 배아의 등쪽이 위로 향하도록 하여 sill guard 커버 디쉬 바닥에 고정합니다. 배아가 고정되면, 마이크로 피펫에 부드럽게 압력을 가해 D eye를 다시 채웁니다.

흡입기 튜브 어셈블리를 사용합니다. henson's node에 소량의 dai를 투여합니다. henson's node 전체가 다음 단계에서 표시되도록 반복하여 수행합니다.

마이크로 모세관 피펫 또는 마이크로 해부 칼을 사용하여 헨슨 결절(henson's node)을 절단합니다. 결절의 배측은 홈을 형성하는 반면 복측은 평평하므로 이를 통해 구분할 수 있습니다. 필요한 경우, 카민 분말을 사용하여 이식편의 배측을 표시하십시오. 이렇게 하면 이식편이 적절한 배복 방향으로 배치되도록 보장할 수 있습니다.

10 µL Gilson 피펫을 사용하여 마이크로 모세관 피펫으로 이식편을 호스트 배아로 옮깁니다. 이식편을 호스트 배아의 헨슨 결절(henson's node) 수준에 있는 불투명 경계 영역인 area lucida 근처로 가져갑니다. 다음으로, 마이크로 모세관 피펫 또는 마이크로 해부 칼을 사용하여 해당 영역에 80에서 100 µm 크기의 작은 절개를 만듭니다.

호스트 배아의 henson's node 수준에서 불투명한 경계 영역을 확인합니다. 마이크로 모세관 피펫이나 마이크로 해부 칼을 사용하여, 이식편의 복측이 사용자 쪽을 향하고 후단이 호스트 배아 O의 해당 영역과 평행하도록 위치시킵니다. 적절한 위치에 배치되면 호스트 배아에서 식염수를 제거하되, 이식편이 호스트 부위와 밀접하게 유지되도록 주의하며, 이전 제출물에 기술된 대로 18~22시간 동안 새로운 배양을 위해 호스트 배아를 처리합니다.

24시간 동안 배양한 후, 배아를 인큐베이터에서 꺼내 시가 접시(cigar dish)에 핀으로 고정합니다. 포함되어 있던 PBS를 제거하고 4% paraformaldehyde로 교체합니다. 그런 다음 배아를 24시간 동안 고정합니다.

고정액을 적절한 유해 폐기물 수거함에 버리고 고정 접시에 PBS를 추가하십시오. 핀을 제거한 후 핀셋으로 곤충 핀을 제거합니다. 끝이 뭉툭한 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 PBS가 들어 있는 신틸레이션 바이알로 옮기십시오.

배아를 PBS로 5분씩 2회 세척하고, twist buffer로 5분 동안 1회 세척합니다. 세척 후, 배아를 0.1 milliliters Tris buffer가 들어 있는 유리 공동 슬라이드로 옮깁니다. Tris buffer 용액을 0.1 milliliter DAB 용액으로 교체합니다. 사용한 팁은 표백제 용액이 담긴 버킷에 폐기합니다.

DAB를 제거하기 위해, FEI fluorescein isothiocyanate 형광 초점 하의 캐비티 슬라이드 위에 커버 슬립을 덮습니다. 이식 공여자 세포에 맞춰진 현미경 대물렌즈를 통해 세포들이 형광 빨간색으로 나타나며, 모든 형광 빨간색 세포가 갈색으로 변할 때까지 FEI 형광에 노출시킵니다. 이는 형광색소가 FEI 여기 파장에 노출되어 불용성 갈색 결정으로 광전환됨으로써 일어나는 결과입니다.

DAB이 존재하는 상태에서 488nm 파장의 빛을 조사합니다. 이 과정은 20분에서 2시간 정도 소요됩니다. 광산화 반응이 완료되면, 정밀 핀셋을 사용하여 커버슬립을 제거합니다.

배아를 PBTW 또는 0.1% tween 20이 포함된 PBS가 들어 있는 20 milliliter 신틸레이션 바이알로 옮깁니다. 마지막으로 커버 글라스, 슬라이드 글라스 및 유리 캐비티에서 DAB를 비활성화합니다. 배아의 시각화를 위해 표백액으로 배아를 처리하여 인큐베이션합니다.

배아를 DIG 표지 프로브만으로 배양하여 인시튜 하이브리다이제이션(in-situ hybridization)을 진행합니다. 다음으로, Jo Video 2에 설명된 대로 촬영 및 섹셔닝을 시작합니다. 다음은 신경 유도 분석의 예시입니다.

처음에 이식편은 숙주 배아의 area lucita와 area alpaca 사이의 경계에 배치됩니다. 공여체와 숙주 배아 모두 3단계 플러스(stage three plus) 상태입니다. 배양 후 9시간이 지나면 이식편이 분화하기 시작하며, 8단계 마이너스(stage eight minus)의 소형 머리와 유사한 형태를 유도합니다.

배양 24시간 후, 고정을 거쳐 신경 유도가 완료됩니다. 배아는 광산화 처리를 위해 준비됩니다. 우선, 여기서 빨간색으로 보이는 것과 같이 공여체 유래의 다이-이(dye eye) 표지 세포들이 증식하여 소형 신경관을 형성했음을 알 수 있습니다.

광산화 후, 이 세포들은 갈색으로 나타납니다. 그 다음, 배아를 신경 마커인 Otx2에 대해 홀마운트 인시튜 하이브리다이제이션(whole mount in situ hybridization)으로 처리합니다. Otx2는 Bonelli 박사의 실험실에서 개발되었습니다.

공여 이식편이 숙주 유래 조직에서 OTX two의 발현을 유도하는 것이 확인되었습니다. 지금까지 닭 배아에서 신경 유도 분석법을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 이식 후 파이펫을 사용하여 이식편 주변 부위의 모든 액체를 제거하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

이렇게 하면 이식편이 안정적으로 배치되어 배양 과정 동안 숙주 배아로부터 떨어지지 않게 됩니다. 이것으로 모든 과정을 마쳤습니다. 감사합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.