Name: 칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 배우세요 칙 배아에서 Hensen's node를 이용한 신경 유도 분석법을. 형광 염료 표지와 이식을 통해 신경 운명 결정 메커니즘을 연구하는 발달신경생물학의 핵심 실험 기법입니다.

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DP는 약물 남용에있는 국립 연구소에서 루스 Kirschstein 수상 1F32 - 01A1 DA021977의받는 사람입니다. 이 작품은 RHF에 마가렛 M. 알켁 재단에 의해 지원되었다.

<html> I. 도식 개요 : <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_2/Figure1.png" alt="그림 1" width="460" height="384" /> 이 비디오는 여자의 배아에서 신경 유도에 대한 분석에서 여러 단계를 보여줍니다. 먼저, 호스트 배아는 새로운 문화에 explanted입니다 [NI1]. 그런 다음 donnor의 배아가 호수와 Hensen의 노드 (여자의 &quot;구성&quot;)에 explanted됩니다 것은 형광 염료 DiI로 표시됩니다 [NI2]. Hensen의 노드가 donnor의 배아에서 excised입니다 [NI3]와 호스트 배아에 이식 [NI4, NI5]. 호스트 배아는 다음 donnor 조직 호스트 영역에서 이소성 축을 유도 가지고있는 기간이 지난 후 최대 22 시간에 대한 양식입니다 opaca [NI6]. 문화에 따라, 호스트 배아는 고정 및 DAB의 면전에서 photooxidation에 대한 처리 : DAB와 갈색 다음과 같은 반응이 될 사전 photooxidation [NI7]에 FITC의 형광 아래에 빨간색으로 나타납니다이 화학 반응, donnor 파생된 셀로 [NI8]. 배아는 다음 신경 마커 [NI8]와 현장 하이브 리다이 제이션에 대한 처리, 호스트 파생 조직 donnor 그래프트의 존재에 신경 조직을 형성 하였다. 이 조직 파란색 나타납니다. 1 : 새로운 문화에 대한 호스트의 배아를 준비 <ol><li> 이 신경 유도 분석 프로토콜 햄버거 &amp; 해밀턴 단계 3 incubated되었습니다 계란으로 시작 + (또는 HH3 +). 이 계란은 13 시간 동안 습기가 인큐베이터에서 측면에 누워 incubated되었습니다. </li><li> 새로운 문화 (단계 3.1. 5.5 9)에 대한 호스트 배아를 준비합니다. </li><li> 200 μl 식염수에 호스트 배아의 표면을 커버. 이것은 나중에 전송 donnor 그래프트의 위치를​​ 용이하게합니다. </li><li> 마지막으로, 거꾸로 팰컨 35mm 문화 요리와 함께 어셈블​​리를 커버. </li></ol> 2 : 호수에있는 donnor의 배아를 Explanting <ol><li> 포셉와 껍질을 두드리고있는 모든 셀 주위의 껍질 조각을 제거하여 계란을 엽니다. 껍질 위로를 제거하고 폐기. </li><li> 포셉와 두꺼운 알부민을 제거하고, 배가 위쪽으로 얼굴을 너무 거친 포셉로 난황을 기울. </li><li> 좋은 가위를 사용하여 배아 주위에 난황의 사각형 잘라. 숟가락으로 노른자에서 배아를 제거하고, PBS를 포함하는 접시에 장소. </li><li> 포셉를 사용하여, 지역 pellucida에서 donnor의 배아를 분리. </li><li> PBS를 포함 Sylgard 보상 요리로 전송 donnor의 배아. </li></ol> 3, 라벨링 절개 및 donnor 그래프트를 이식 <ol><li> microelectrode의 풀러를 사용하여 50 μl 유리 microcapillary pipettes를 가져옵니다. 현미경, 미세 집게를 사용하여 micropipette의 끝을 잘라. 배양 접시에있는 장소 micropipette는 plasteline의 리본으로 정렬했습니다. </li><li> 전에 이식에 그래프트 레이블을하는 데 사용됩니다 염료 솔루션을 준비 : 염료 DiI (1,1 &#39;- dioctadecyl - 3, 3,3&#39;, 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine 퍼클로레이트) carbocyanine : 우선, 1ml에 DiI의 재고를 준비 0.5 %에서 절대 에탄올. 이 주식은 어둠 속에서 - 20C에 저장할 수 있습니다. 42 세트 물 목욕에서 ° C, 혼합 360μl 0.3M 자당 40 μl DiI 주식을 prewarmed. 물 목욕 온도가 DiI과 불용성 결정 형성의 침전을 방지하기 위해 필요합니다. 간단히 미니 spectrafuge에 솔루션을 (5-10 초 동안) 스핀. DiI 솔루션은 이제 사용할 준비가되었습니다. </li><li> 곤충 핀을 사용하여 Sylgard 적용 접시의 바닥에있는 donnor의 배아를 확보. </li><li> 백 - 채우기 DiI로 micropipette합니다. 흡인기 튜브 어셈블리를 사용하여 부드러운 압력을 적용하여, Hensen의 노드에 DiI의 작은 볼러스를 적용합니다. 전체 Hensen의 노드가 표시되었는지 확인합니다. </li><li> microcapillary 피펫 또는 microdissecting 칼을 사용 Hensen의 노드를 ( &quot;주최자&quot;donnor 그래프트) 컷. </li><li> 복부 측면과 카마인과 이식의 사후 끝을 표시합니다. 이것은 이식이 단계에서 적절한 dorso 4.3 - 복부 방향과 위치 있는지 확인합니다. </li><li> 200μl 길슨 피펫을 사용하여 호스트 배아에 이식을 전송하기만하면됩니다. </li></ol> 4 : 이식 및 culturing 호스트 배아를 확보 <ol><li> 그래프트 호스트 사이트 근접 위치에 남아 있는지 확인하고, 호스트 배아에서 염분 제거합니다. </li><li> microcapillary 피펫 또는 microdissecting 나이프를 사용하여 호스트 배아의 Hensen의 노드의 수준, 지역 pellucida / 지역 opaca 경계 영역에 작은 절개 (80 - 100μm)을합니다. </li><li> 그 복부 측면 당신과 사후 최종 향해 얼굴 있도록 microcapillary 피펫 또는 microdissecting 나이프, 위치 그래프트를 사용하면 호스트 배아에 상응하는 지역에 평행이다. </li><li> 남은 생리를 제거하고, 81-22 시간 (단계 6.1 6.6 9)에 대한 새로운 문화에 대한 호스트 배아를 처리합니다. </li><li> 호스트 배아는 다음 4 ° C (단계 7.1-7.7 9)에서 하룻밤 고정됩니다. </li></ol>E &quot;&gt; 5 : 형광 아래 그래프트를 Photooxidise <ol><li> 펌 후드 아래, 트리스 버퍼에 DAB 작업 솔루션을 준비 : 500μg/ml에서 트리스 버퍼 (100mM 트리스 - HCL, pH를 7.4)에서 (3,3 &#39;- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride) DAB 기판을 디졸브, 얼음, 어두운 솔루션을 유지. </li><li> 트리스 버퍼의 각 한 번 5 MN 5 MN에 대한 두 번 PBS에서 배아를 씻으십시오. </li><li> 1 ML 트리스 버퍼를 포함하고있는 유리 슬라이드 캐비티에 배아를 전송합니다. </li><li> 1.5 ML DAB 솔루션 트리스 버퍼 솔루션을 교체합니다. DAB를 오염을 제거하다하기 위해 10 % 표백 용액이 들어있는 양동이에 Eppendorf 끝 처리. 공동 슬라이드 위에 coverslip 놓으십시오. </li><li> FITC (플루오레신 isothiocyanate) 형광 아래 그래프트 (donnor 세포가 형광 빨간색으로 나타납니다)에있는 현미경의 목표를 집중하고 모든 형광 붉은 세포가 갈색 (이것은 DiI의 결과로 발생 될 때까지 FITC의 형광에 노출될 photoconverted되는 fluorochrome 불용성 갈색 결정하기 위해, DAB의 면전에서 FITC 여기 파장 (488nm)에 적용됩니다. 노출에 의해이 과정은 20 MN 2 시간 사이에 걸립니다. </li><li> photooxidation 반응의 완료에 따라, 미세 집게를 사용하여 coverslip을 제거합니다. 유리 PBTw (또는 0.1 % 트윈 - 20와 함께 PBS)가 포함된 20 ML의 섬광 병을를 배아를 전송합니다. </li><li> 10 % 표백 용액에 잠복기로 coverslip 유리 캐비티 슬라이드에서 DAB를 비활성화합니다. </li></ol> 6 : 현장 하이브리드화, 사진에 대한 배아를 처리하고 sectioning <ol><li> 전용 라벨 프로브를 발굴을위한 배아를 잠복기, 현장 하이브리드화 (단계 3.7 6.5 9)에서 진행합니다. </li><li> 사진 촬영 (8.2 9 단계) 및 (단계 8.3 및 8.4 9) sectioning 진행합니다. </li></ol> 대표 결과 신경 유도 분석의 다음 예제에서는 donnor 그래프트는 호스트 파생 조직에서 신경 마커 꼬리가없는의 표현을 유도 표시됩니다. donnor 그래프트는 &quot;주최자&quot;영역이 수술 단계에서 donnor의 배아에서 제거되었습니다있는 배아 유래 :이 특정 예제에서, 우리는 일반적으로 &quot;주최자&quot;능력이없는 배아 영역의 신경 유도하는 능력의 획득을 평가 3 +. 구멍 치유하고 Hensen의 노드를 닮은 구조가 형성 때까지 절제 따라 donnor의 배아는 새로운 문화의 개발을 허용합니다. 이 구조는 다음 DiI로 표시된 donnor의 배아에서 excised 및 호스트 배아 면적 pellucida / 지역 opaca 경계에 이식할 수 있습니다. 새로운 문화에 따라, 미니어처 축이 호스트 배아에 인접한 형성이 미니어처 축 붉은 세포의 막대 (donnor는 파생)와 머리처럼 구조 (호스트 파생)의 구성에서 (A), donnor - 파생 DiI 분류 전지는 FITC 형광 현미경 하에서 이전에 고정으로 표시됩니다. 이러한 donnor - 유래 세포는 붉은 세포의 막대로 표시 미니 notochord를 형성 확산있다. (B) DiI의 다음 photoconversion,이 donnor - 유래 세포는 갈색 나타납니다. donnor 그래프트는 호스트에서 신경 조직의 형성을 유도했다 :이 조직은 뇌를 엽 성의 전구 물질로 구성되어 등 현장 하이브리드화에 마커 꼬리가없는 다음과 같은 그들의 표현에 의해 공개 [6에서 reprinted]. <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_3/Figure 2.png" alt="그림 2" width="230" height="154" /> 참고 :이 절차에서는, 우리는 &quot;신경&quot;조직 (파란색) 파생 호스트에서 신경 유도 donnor 조직 (레드 / 브라운)을 차별화하기 위해 DiI 레이블 세포를 사용했습니다. 대신 파생 여자, DiI 표시 donnor 그래프트를 사용하는 일부 작가도 아닌 여자의 메추라기 배아에서 파생된 donnor 조직 [예 6].를 사용하여 이 대체 방법은 호스트 조직에서 donnor을 차별화 할 수 있습니다. 이 경우, 그래프트 (donnor 조직) 대신 닭고기 계란의 메추라기 계란에서 유래. 4.5 단계에 따라, 호스트가 5.7-3.4와 5.1 조직 (QCP1)와 단계 3.1 퀘일 특정 항체와 함께 전체 마운트 immunohistochemistry에 대한 처리는 프로토콜에서 생략됩니다. 이 대안 절차의 예제는 아래와 같습니다 :이 경우에는, (같은 QCPN 항체 [갈색]의 표현에 의해 참조) 우리는 A, B에서 같은 실험 절차를 사용하지만 우리는 퀘일 - 파생 donnor 조직을 사용 : 재생 메추라기 배아에서 파생 노드는 호스트에있는 냄비 - 신경 마커 Sox2의 표현을 유도했다 [6에서 reprinted] <img src="/files/ftp_upload/old/1027_2009_1_22_4/Figure 3.png" alt="그림 3" width="154" height="230" />

<ol><li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiments+on+the+development+of+chick+and+duck+embryos%2C+cultivated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro.</a> Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).</li>
<li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+by+the+primitive+streak+and+its+derivatives+in+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick.</a> J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+et+transplantation+des+diff%26eacute%3Brentes+r%26eacute%3Bgions+de+la+ligne+primitive+chez+le+poulet%5BTitle%5D)+AND+%22C.+R.+Ass.+Anat%22%5BJournal%5D)">Excision et transplantation des diff&eacute;rentes r&eacute;gions de la ligne primitive chez le poulet.</a> C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).</li>
<li>Gallera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+induction+in+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Morph.+9%22%5BJournal%5D)">Primary induction in birds.</a> Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+neural+crest+cell+migration+in+the+mouse+embryo+as+revealed+by+vital+dye+labeling.+Development+108%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108.</a> , 605-612 (1990).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.+Development+122%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122.</a> , 3263-3273 (1996).</li>
<li>Joubin, K., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+continuously+define+the+organizer+during+the+cell+movements+of+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation.</a> Cell. 98, 559-571 (1999).</li>
<li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. , 406-474 (2000).</li>
<li>Psychoyos, D., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Culture+of+Early+Chick+Embryos+ex+vivo+%28New+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture.</a> JoVE. 20, 10-3791 (2008).</li>
</ol>

이 동영상은 신경 유도에 대한 분석을 수행하는 다른 단계를 설명합니다,이 분석은 본질적으로 여자의 putative 신경 유도하는 분자의 특성에 사용되며, 따라서 embryological micromanipulations 1-4을 이르기까지 애플 리케이션의 다양한 사용할 수 있습니다; 6 무너지고 새로운 신호 폭포로 7,8 모든 두뇌 형성하고 남은 신경 계통의 초기 단계에 대한 이해를 목표로.

<table><tbody><tr><td>난자</td><td>동물</td><td>Charles River Laboratories</td><td>프리미엄 가임성</td><td>수정된 HH3+ (14시간)</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5 또는 이와 유사한 제품</td><td></td></tr><tr><td>하이브리다이제이션 인큐베이터</td><td>장비</td><td>Robbins Scientific, SciGene</td><td>M1000</td><td>뒤집힌 Pyrex 접시와 500 ml ddH2O를 함께 사용하십시오.&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;비커 O</td></tr><tr><td>Marsh 자동 배양기</td><td>장비</td><td>리옹</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 접시 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>시계 제조공&amp;rsquo;50mm 유리 슬라이드</td><td>도구</td><td>VWR international</td><td>66112-060</td><td></td></tr><tr><td>유리 링</td><td>도구</td><td>물리적 시설 관리 부서</td><td></td><td>유리 튜브(외경 27 mm, 내경 25 mm)를 4 mm 두께의 섹션으로 절단한다. 정밀 연마는 하지 않는다.</td></tr><tr><td>곡선 핀셋 (1)</td><td>도구</td><td>전자현미경 과학</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>포셉 (2)</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td>숫돌을 사용하여 끝을 뭉툭하게 만든 후 100ul의 미네랄 오일을 사용함</td></tr><tr><td>정밀 가위</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 배양 접시</td><td>도구</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>고무 벌브</td><td>도구</td><td>전자현미경 과학</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>흡입 튜브 어셈블리</td><td>도구</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>마이크로&amp;#8211;전극 추출기</td><td>장비</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Sutter Instruments P-97 화염 처리/갈색화 마이크로피펫</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 모세관 피펫</td><td>도구</td><td>전자현미경학</td><td>70950-12</td><td>화염 상에서 가장자리 둥글리기</td></tr><tr><td>배양 챔버</td><td>도구</td><td>파이오니어 플라스틱스(Pioneer Plastics)</td><td>030C</td><td></td></tr><tr><td>모세관**</td><td>도구</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1049-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>미세해부용 나이프</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization) 전 공동(cavity)을 천공하는 데 사용하십시오.</td></tr><tr><td>미뉴트 핀 0.2mm 직경</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>경화제 1부와 베이스 9부를 혼합한 후, 37°C에서 하룻밤(O/N) 동안 굳힙니다.</td></tr><tr><td>디에틸피로카보네이트(depc)</td><td>시약</td><td>전자현미경학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 경화제 및 베이스</td><td></td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>경화제 1분량과 베이스 9분량을 혼합한 후, 37°C에서 밤새(O/N) 정치하십시오.</td></tr><tr><td>디에틸피로카보네이트 (depc)</td><td></td><td>Acros Organics</td><td>10025025</td><td>PBS 1L에 DEPC 1mL를 첨가하고, 흔들어 섞은 후, 고압증기멸균한다.</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td></td><td>전자현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr></tbody></table>

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

여자의 난자는 초기 배아 발달의 연구에 귀중한 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작 용이성, 그건 신경 시스템의 형성과 초기 patterning을 공부를위한 이상적인 도구가합니다. 이 동영상은 호스트에 그래프트 구성 조직하는 방법하는 Hensen의 노드 (여자의 배아에서 주최자가) 호스트 관할 ectoderm에 이식할 수 있습니다 방법을 보여줍니다. 주최자의 수술이 신경 유도 신호를 통해 신경 운명을 채택하는 조직을하신 나 overlying 지시합니다. 이 메커니즘은 신경 유도이라고하고, amniotes의 뇌 및 척수의 형성의 초기 단계를 구성합니다. 이 메소드는 본질적으로 여자의 putative 신경 유도하는 분자의 특성에 사용됩니다. 이 동영상은 신경 유도에 대한 분석에서 여러 단계를 보여주는, 첫째, d​​onnor의 배아는 explanted과 요리에 박혀있다. 그런 다음, 호스트 배아는 새로운 문화에 대한 준비가되어 있습니다. 이식은 excised과 호스트 영역 pellucida 여백에 이식합니다. 호스트는 18-22 시간에 대한 양식입니다. 어셈블리가 고정되어 더 이상 응용 프로그램 (예에 원위치 하이브리드화)에 대한 처리됩니다. 이 방법은 원래 웨딩턴에 의해 고안되었다<sup&gt; 1,2</sup&gt; 그리고 Gallera<sup&gt; 3,4</sup&gt;.

신경 유도는 뇌의 형성의 첫 단계입니다. 그것은 Hensen의 노드 (주최자), 신경 운명을 채택할에 인접한 조직을 지시하는 메커니즘이며, 신경 계통을 일으키다하는 즉. 이 비디오는 여자의 배아에서 신경 유도에 대한 분석을 보여줍니다.

닭 배아는 초기 배아 발달 연구에 있어 가치 있는 도구입니다. 투명성, 접근성 및 조작의 용이성 덕분에 이는 ...

본 영상에서는 병아리 배아의 신경 유도 분석을 위한 다양한 단계를 보여줍니다. 먼저, 수혜 배아를 적출하여 새로운 배양액에 넣습니다. 공여 배아는 식염수 내에서 적출하며, 헨슨 결절(Henson's node)을 형광 염료로 표지합니다. 공여 배아에서 헨슨 결절을 절제하여 수혜 배아에 이식합니다.숙주 배아를 24시간 동안 배양한 후, 고정시키고 형광 하에서 광산화를 위해 처리합니다. DAB를 사용하여 처리합니다. 배아를 신경 마커를 이용한 인시튜 하이브리다이제이션(in-situ hybridization)으로 처리합니다.안녕하세요, 저는 휴스턴 소재 텍사스 A&amp;M 대학교 환경 및 유전체 의학 센터의 Labor Fennell 소속 Delphine입니다. 오늘은 닭 배아에서 신경 유도 분석을 수행하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 이 절차를 통해 항경련제가 헨젠 결절(Hensen's node)의 신경 유도 특성에 미치는 영향을 연구하고 있습니다.이제 시작하겠습니다. 신경 유도 분석을 위해 난자를 준비해야 합니다. 이 난자들은 습윤 배양기에서 옆으로 눕힌 상태로 13시간 동안 배양하여 햄버거 및 해밀턴 단계 3+ 또는 HH 3+ 단계가 되도록 해야 합니다.다음으로, 이전에 입증된 새로운 배양법을 사용하여 숙주 배아를 준비합니다. JoVE에서는 숙주 배아의 표면을 200 microliters 식염수로 덮어줍니다. 이렇게 하면 추후 공여 이식편의 전이 및 위치 선정이 용이해집니다.마지막으로, 뒤집은 Falcon 35 millimeter 배양 접시로 어셈블리를 덮습니다. 공여 배아를 꺼내기 위해 핀셋으로 껍질을 톡톡 쳐서 달걀을 엽니다. 껍질의 윗부분을 제거하고 폐기합니다.핀셋으로 두꺼운 알부민을 제거하고, 거친 핀셋으로 난황낭을 기울여 배아가 위를 향하게 합니다. 알부민을 제거한 후, 미세 가위를 사용하여 배아 주변의 난황낭을 사각형 모양으로 절개합니다. 스푼을 사용하여 난황에서 배아를 분리한 다음 PBS가 담긴 접시에 옮깁니다.다음으로, 핀셋을 사용하여 공여 배아를 난황 및 area lucida로부터 분리합니다. 분리가 완료되면, 공여 배아를 PBS가 담긴 SIL guard 커버 유리 접시로 옮겨 이식편을 표시하고 이식합니다. 현미경 하에서 마이크로 전극 풀러(micro electrode puller)를 사용하여 50 µL 유리 마이크로 모세관 피펫을 제작합니다.미세 핀셋을 사용하여 마이크로 피펫의 끝부분을 자릅니다. 모델링 점토 띠가 깔린 페트리 접시에 마이크로 피펫을 놓습니다. 다음으로, 이식 전 이식편을 표지하는 데 사용할 염료 용액을 준비합니다.먼저, 1 mL의 절대 에탄올에 0.5% 농도의 dye eye 스톡을 준비합니다. 이 스톡은 영하 20°C의 암소에 보관할 수 있습니다. 그 다음 45°C로 설정된 히트 블록에서, 미리 가온된 10 µL의 dai 스톡을 90 µL의 0.3 M sucrose와 혼합합니다. 이 온도는 dai의 침전과 불용성 결정의 형성을 방지하기 위해 필요합니다.미니 SPECT 원심분리기에서 용액을 5~10초 동안 짧게 원심 분리합니다. 이제 DAI 용액을 사용할 준비가 되었습니다. 곤충 핀을 사용하여 기증 배아의 등쪽이 위로 향하도록 하여 sill guard 커버 디쉬 바닥에 고정합니다. 배아가 고정되면, 마이크로 피펫에 부드럽게 압력을 가해 D eye를 다시 채웁니다.흡입기 튜브 어셈블리를 사용합니다. henson's node에 소량의 dai를 투여합니다. henson's node 전체가 다음 단계에서 표시되도록 반복하여 수행합니다.마이크로 모세관 피펫 또는 마이크로 해부 칼을 사용하여 헨슨 결절(henson's node)을 절단합니다. 결절의 배측은 홈을 형성하는 반면 복측은 평평하므로 이를 통해 구분할 수 있습니다. 필요한 경우, 카민 분말을 사용하여 이식편의 배측을 표시하십시오. 이렇게 하면 이식편이 적절한 배복 방향으로 배치되도록 보장할 수 있습니다.10 µL Gilson 피펫을 사용하여 마이크로 모세관 피펫으로 이식편을 호스트 배아로 옮깁니다. 이식편을 호스트 배아의 헨슨 결절(henson's node) 수준에 있는 불투명 경계 영역인 area lucida 근처로 가져갑니다. 다음으로, 마이크로 모세관 피펫 또는 마이크로 해부 칼을 사용하여 해당 영역에 80에서 100 µm 크기의 작은 절개를 만듭니다.호스트 배아의 henson's node 수준에서 불투명한 경계 영역을 확인합니다. 마이크로 모세관 피펫이나 마이크로 해부 칼을 사용하여, 이식편의 복측이 사용자 쪽을 향하고 후단이 호스트 배아 O의 해당 영역과 평행하도록 위치시킵니다. 적절한 위치에 배치되면 호스트 배아에서 식염수를 제거하되, 이식편이 호스트 부위와 밀접하게 유지되도록 주의하며, 이전 제출물에 기술된 대로 18~22시간 동안 새로운 배양을 위해 호스트 배아를 처리합니다.24시간 동안 배양한 후, 배아를 인큐베이터에서 꺼내 시가 접시(cigar dish)에 핀으로 고정합니다. 포함되어 있던 PBS를 제거하고 4% paraformaldehyde로 교체합니다. 그런 다음 배아를 24시간 동안 고정합니다.고정액을 적절한 유해 폐기물 수거함에 버리고 고정 접시에 PBS를 추가하십시오. 핀을 제거한 후 핀셋으로 곤충 핀을 제거합니다. 끝이 뭉툭한 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 PBS가 들어 있는 신틸레이션 바이알로 옮기십시오.배아를 PBS로 5분씩 2회 세척하고, twist buffer로 5분 동안 1회 세척합니다. 세척 후, 배아를 0.1 milliliters Tris buffer가 들어 있는 유리 공동 슬라이드로 옮깁니다. Tris buffer 용액을 0.1 milliliter DAB 용액으로 교체합니다. 사용한 팁은 표백제 용액이 담긴 버킷에 폐기합니다.DAB를 제거하기 위해, FEI fluorescein isothiocyanate 형광 초점 하의 캐비티 슬라이드 위에 커버 슬립을 덮습니다. 이식 공여자 세포에 맞춰진 현미경 대물렌즈를 통해 세포들이 형광 빨간색으로 나타나며, 모든 형광 빨간색 세포가 갈색으로 변할 때까지 FEI 형광에 노출시킵니다. 이는 형광색소가 FEI 여기 파장에 노출되어 불용성 갈색 결정으로 광전환됨으로써 일어나는 결과입니다.DAB이 존재하는 상태에서 488nm 파장의 빛을 조사합니다. 이 과정은 20분에서 2시간 정도 소요됩니다. 광산화 반응이 완료되면, 정밀 핀셋을 사용하여 커버슬립을 제거합니다.배아를 PBTW 또는 0.1% tween 20이 포함된 PBS가 들어 있는 20 milliliter 신틸레이션 바이알로 옮깁니다. 마지막으로 커버 글라스, 슬라이드 글라스 및 유리 캐비티에서 DAB를 비활성화합니다. 배아의 시각화를 위해 표백액으로 배아를 처리하여 인큐베이션합니다.배아를 DIG 표지 프로브만으로 배양하여 인시튜 하이브리다이제이션(in-situ hybridization)을 진행합니다. 다음으로, Jo Video 2에 설명된 대로 촬영 및 섹셔닝을 시작합니다. 다음은 신경 유도 분석의 예시입니다.처음에 이식편은 숙주 배아의 area lucita와 area alpaca 사이의 경계에 배치됩니다. 공여체와 숙주 배아 모두 3단계 플러스(stage three plus) 상태입니다. 배양 후 9시간이 지나면 이식편이 분화하기 시작하며, 8단계 마이너스(stage eight minus)의 소형 머리와 유사한 형태를 유도합니다.배양 24시간 후, 고정을 거쳐 신경 유도가 완료됩니다. 배아는 광산화 처리를 위해 준비됩니다. 우선, 여기서 빨간색으로 보이는 것과 같이 공여체 유래의 다이-이(dye eye) 표지 세포들이 증식하여 소형 신경관을 형성했음을 알 수 있습니다.광산화 후, 이 세포들은 갈색으로 나타납니다. 그 다음, 배아를 신경 마커인 Otx2에 대해 홀마운트 인시튜 하이브리다이제이션(whole mount in situ hybridization)으로 처리합니다. Otx2는 Bonelli 박사의 실험실에서 개발되었습니다.공여 이식편이 숙주 유래 조직에서 OTX two의 발현을 유도하는 것이 확인되었습니다. 지금까지 닭 배아에서 신경 유도 분석법을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 이식 후 파이펫을 사용하여 이식편 주변 부위의 모든 액체를 제거하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이렇게 하면 이식편이 안정적으로 배치되어 배양 과정 동안 숙주 배아로부터 떨어지지 않게 됩니다. 이것으로 모든 과정을 마쳤습니다. 감사합니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

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