Name: 가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 배우세요 마우스 IL-17 분비 T 세포를 사이토카인 분비 분석 기술로 탐지 및 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 면역학 및 자가면역 질환 연구에 활용됩니다.

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시약 준비 <ol><li> BSA (0.5 %), 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS를 포함하는 버퍼를 확인합니다. 공기 거품이 맥 분리 열을 차단할 수 있기 때문에, 버퍼는 2-8 ° C에서 사용하기 전에 degassed하고 저장해야합니다. </li><li> 우리는 5 % 마우스 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용합니다. 문화 매체는 이러한 화합물은 세포 자극의 특이성을 변경하므로, BSA 또는 FCS를 포함해서는 안됩니다. </li><li> 마우스 IL - 17 분비 분석 - Miltenyi Biotec에서 셀 - 농축 및 탐지 키트. IL - 17 캐치 시약, IL - 17 탐지 항체 (비오틴), 안티 - 비오틴 - PE 및 안티 체육 MicroBeads : 키트는 다음과 같은 구성 요소가 포함되어 있습니다. </li></ol> Splenocytes을 자극 <ol><li> 이 프로토콜은 이러한 unstimulated splenocytes 및 T 세포에 대한 counterstain로 부정과 긍정적인 컨트롤의 존재에서 수행됩니다. 이 프로토콜은 살균 기술을 사용하여 수행됩니다. </li><li> gentleMACS ™의 Dissociator를 사용하여 격리되었다 마우스 splenocytes의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포의 농도는 세포 계수를 통해 미리 정해진해야합니다. 실온에서 10 분간 200 × g에서 펠렛은 세포. </li><li> 원심 분리 다음, 피펫을 사용하여 펠렛에서 뜨는을 대기음. 펠렛의 손실을 피하기 위해 튜브를 가만히 따르다하지 마십시오. </li><li> 이제 문화 매체에있는 세포를 resuspend 다음 잘 추가할 수 있습니다. ML 당 천만 세포 cm2 당 오백만 세포의 농도에 대한 충분한 매체를 추가합니다. </li><li> 우리 resuspended 세포에 면역 반응을 촉진하기 위해, 우리는 샘플을 ionomycin (1 μg / ML)와 PMA (10 NG / ML) 추가하고 부드럽게 최대 pipetting 아래로 혼합 솔루션을. 그러면 우물이 적절하게 표시됩니다. </li><li> 이제, 우리는 37 3 시간 동안 우리의 세포를 품어됩니다 ° C 자극 기간을 시작없이 믹싱과 함께. 자극의 시작에서 IL - 17 분석 3 시간 진행되므로 적절하게 계획이다. </li><li> 분비를 중지하려면, 전지가 얼음에 위치하고 부드럽게 감기 버퍼와 아래 pipetting하여 자극을 세포를 수집하고 있습니다. 세포는 다음 우물에서 튜브로 전송하고 두 번째 시간을 씻어 있습니다. </li><li> 모든 세포가 수집되는 것을 보장하기 위해, 그것은 현미경 아래에 접시를 확인하는 것이 좋습니다. 세포가 여전히 남아 첨부하면 감기 버퍼와 접시를 rinsing하여 남아있는 세포를 수집할 수 있습니다. 당신의 세포 현탁액의 모든 세포 대단히 짧은 시간은 미리 분리 필터를 사용하여 제거할 수 있습니다. </li></ol> 캐치 시약으로 세포를 라벨링 <ol><li> 그것은 IL - 17 - secreting 세포의 2 % 미만이있는 경우에는이 분석은 최적의 작동, 참고 파라마운트입니다. </li><li> IL - 17 secreting 세포의 농도가 적절하게 볼륨을 조절할 이상 2퍼센트 것으로 예상하는 경우. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="그림 8" width="500" height="162" /></li><li> 이 절차의 함정 하나 가능성 BI 특정 항체가되므로 잘못된 반응을 생성, 비 secreting의 T 세포와 인접 림프구에서 분비 트랩 IL - 17에 바인딩 할 때 레이블링하는 동안 발생할 수있는 캐치 시약의 교차 오염이다. </li><li> 이 문제를 회피하기 위해서는 IL - 17의 보급을 저하이 교차 오염을 피하기 위해 아래 사전 추위 버퍼와 라벨 부착 및 작동하도록 냉각 세포에 중요합니다. 세포 차가운 유지 이외에, 그들은 정의 농도에 보관해야합니다. </li><li> 라벨 절차를 시작하기 위해, 우리는 15 ML closable 튜브 천만 세포를 사용합니다. 높은 세포 숫자가 사용할 수있다면, 간단하게 따라 모든 볼륨을 최대 규모. 최적의 세포 농도를 얻을되면 추위 버퍼 10 ML을 추가하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 냉장 원심 분리기 10 분 (2-8 ° C) 300에서 전지 × g를 스핀 다운. </li><li> 원심 분리에 따라 완전히 피펫을 사용하여 표면에 뜨는를 대기음. 이 세포 손실 및 이란게 부정 확한 볼륨을 이끌로 뜨는을 가만히 따르다하지 마십시오. 감기 버퍼, 원심 분리하고, 열망의 10ml를 추가로 구성되어 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 이제 원하는 순도의 펠렛을 가지고, 차가운 문화 매체 80 μL의 세포를 resuspend. 그들을 분류하기 위해, 우리는 이제 마우스 IL - 17 캐치 시약 20 μL를 추가합니다. </li><li> 얼음 5 분 동안 세포를 품어. </li><li> 얼음에 5 분 잠복기 후, 튜브를 제거하고 37 ° C 따뜻한 매체 10 ML에있는 세포를 희석. 다음 MACSmix 튜브의 회전에 튜브를 확보하고 37 튜브를 품어 ° C를 지속적으로 움직임에 따라 45 분. 37 온도를 증가하는 것은 ° C는 시토킨 분비를 다시 시작합니다. </li></ol> IL - 17 탐지 항체 (비오틴) 및 안티 - 비오틴 - PE와 세포를 라벨링 <ol><li> 37 ° C에서 45 분 분비 기간 후, 얼음에 즉시 튜브를 놓으십시오. 이것은 시토킨 분비를 중지합니다. 여기에서 그것에 얼음에 세포를 유지하는 것이 중요합니다.감기 버퍼로 작업하면 캐치 시약의 교차 오염을 방지합니다. </li><li> 2-8에서 300xg에서 추위 버퍼와 원심 분리기 ° 10 분 C로 튜브를 입력합니다. 완전히 뜨는을 대기음. 세척이 한 번 더 단계를 반복합니다. </li><li> 세포 펠렛은 추위 버퍼의 80 μL에 resuspended이며, 튜브는 얼음에 위치합니다. </li><li> 항체의 unspecific 바인딩을 방지하기 위해, 우리는 5 분 얼음에 10μl의 FcR 차단 시약과 부화를 추가하는 것이 좋습니다. 그럼 우리가 얼음에 10 분간 비오틴과 부화 복합이다 마우스 IL - 17 탐지 항체 (비오틴) 20 μL를 추가합니다. </li><li> 다시 한번, 우리는 2-8에서 300xg에서 추위 버퍼와 원심 분리기 10 ML 추가 ° C, 10 분에 의해 전에했던 것처럼 세포를 씻으십시오. </li><li> 지금 뜨는을 대기음 차가운 버퍼 80 μl의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 우리 이차 항체, 안티 - 비오틴 - PE 20 μL를 추가합니다. </li><li> 세포와 보조 항체 솔루션을 섞어서 다시 얼음에 10 분 동안 튜브를 품어. </li><li> 이 두 번째 배양이 완료되면, 10 ML 감기 버퍼와 원심 분리기로 세포를 씻어. </li><li> 펠렛은 이제 추운 버퍼 500 μL에 resuspended 수 있습니다. </li><li> 세포가 더 하류 분석을 위해 분리 수있다면, 그들은 자기 (磁 气) 안티 - PE - MicroBeads으로 표시하고 Mac에서 열 및 Mac에서 구분 기호를 사용하여 수동 또는 자동 분리 수 있습니다. </li><li> 우리는 이제 splenocytes의 라벨링을 완료 및 분석을위한 준비가되어있다. </li></ol> 외과 분석 <ol><li> 우리의 분석을 위해, 우리는 유동세포계측법에 의해 자극과 unstimulated splenocytes을 비교합니다. </li><li> 흐름 cytometric 분석하기 전에 전지가 죽은 세포 밖으로 게이트 0.5 μg / ML에서 propidium 요오드화물 물들일 수 있습니다. MACSQuant ™ 분석기는 각 샘플에 대한 200,000 개 셀 탑재되어 이제 샘플의 상대적인 항체 반응의 스캐터 플롯을 볼 줄 수 있습니다. 희귀 세포의 분석을 위해 두 가지 중요한 고려 사항 - IL - 17 양성 세포와 같은 - 유동세포계측법에 있습니다 : <ul><li> 앞으로 분산 비교 측면 스캐터 플롯에 lymphocytes에 게이트를 설정 </li><li> 그리고 죽은 세포 (propidium 요오드화물의 물들일)와 B - 세포 (unspecific 배경 얼룩의 원인이 될 수있는)가 게이팅 추가 검출의 감도를 향상시키기 위해 </li></ul></li><li> 우리는 T 세포와 B 세포를 감지하는 CD45R/B220-PerCP 항체를 감지하는 CD4 - APC 항체를 사용했습니다. 우리는 샘플의 전방 및 측면 산란 특성을 확인하고 림프구 인구에 게이트를 적용합니다. </li><li> 두 번째 게이트는 스테인드 죽은 세포와 스테인드 B 세포 (Y 축)를 참조하기 위해 적용되었습니다. 이러한 세포는 T 세포 분석에서 제외됩니다. </li><li> 이 예제에서, 어떤은 본질적으로 우리의 부정적인 제어이며, 우리는 unstimulated 샘플에서 거의 IL - 17 secreting의 CD4 양성 T 세포가있다는 것을 알 수 있습니다 - 약 0.003 % (그림 4). 자극 T 세포 인구를 살펴보면, 우리는 CD4의 상당수 긍정적인 T 세포를 볼 수 분비 IL - 17 - 분리하기 전에 0.367 % 정도 (그림 5A)와 Mac에서 기술 (그림 5B)와 자성 분리 후 60.76 %. </li></ol>

모든 프로토콜 및 데이터 시트 www.miltenyibiotec.com에서 구할 수 있습니다. 경고 시약은 나트륨 azide가 포함되어 있습니다. 산성 조건 하에서 나트륨 azide은 매우 독성 hydrazoic 산을 산출. Azide 화합물은 폐기 전에 물을를 실행에 희석해야합니다. 이러한주의 사항은 폭발 조건이 개발 있습니다 배관 예금을 피하기 위해 권장합니다.

TH17 세포는 적응 면역과 염증 반응에 중요한 역할을하고 면역 염증을 유발하는 측면에서 핵심적인 구성 요소입니다. 이 동영상 Miltenyi의 마우스를 사용하는 방법 문서를 IL - 17 분비 분석 - 세포 강화 및 탐지 키트 (PE). 이 절차를 수행할 때 그것은 당신의 시작 셀 준비 IL - 17 - secreting 세포의 빈도의 추정을하는 것이 중요합니다. 라벨 및 시토킨 분비 기간 동안 적절한 세포 농도가 중단의 다른 세포에 의해 교차 오염을 방지하고 안정적​​인 결과를 보장합니다.

<table><tbody><tr><td>마우스 IL-17 분비 분석 세포 농축 및 검출 키트 (PE) </td><td>시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>배지</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 용액</td><td>시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR 블로킹 시약, 마우스용 </td><td>시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>사멸 세포 제거 키트 </td><td>시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix 튜브 회전기</td><td>기기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; 조직 분해기</td><td>기기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro 스타팅 키트</td><td>기기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS 컬럼</td><td>도구</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>도구</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

가능한 마우스 il - 17 - secreting의 t 세포 탐지 및 격리

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

맥스 시토킨 분비 분석 기술은 단일 세포 수준과 가능한 시토킨 - secreting 세포의 민감한 고립에서 분비 크린 시토킨의 검색이 가능합니다. IL - 17 - secreting 세포, 마우스 splenocytes의 단일 세포 현탁액 ° PMA / ionomycin와 C는 시토킨 분비를 유도하기 위해 37 준비와 자극입니다 레이블하기 위해. 분비 세포를 중지하기 위해서는 그것이 분비와 세포 표면 근처에 잡힌로 leukocytes의 세포 표면과 IL - 17 CD45에 바인딩 이중 특정 항체를 다음 얼음에 게재되고 IL - 17 캐치 시약에 노출되어 있습니다. 분비 그러면 37의 온도를 증가시켜 다시 시작 ° C와 IL - 17은 캐치 시약에 의해 갇혀있다. 분비 그런 다음 얼음에 세포를 배치하여 다시 중지됩니다. 함정 IL - 17을 감지하기 위해 세포는 비오틴에 복합 두번째 IL - 17 특정 항체 및 안티 - 비오틴 - PE 항체와 incubated 있습니다. 셀 이제 직접 유동세포계측법에 의해 분석이나 안티 - PE 복합 MicroBeads과 이후의 라벨링에 의해 분리 및 농축을위한 준비를하실 수 있습니다.

이 절차를 자극시 IL - 17 분비 적극적으로 마우스 TH17의 leukocytes의 탐지 및 격리에 대해 설명합니다.

가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

MACS 사이토카인 분비 분석(Cytokine Secretion Assay) 기술을 통해 단일 세포 수준에서 분비된 사이토카인을 검출하고, 생존 가능한 세포를 민감하게 분리할 수 있습니다...

max Cytokine secretion assay 기술을 통해 단일 세포 수준에서 분비된 사이토카인을 검출할 수 있으며, IL 17 분비 세포를 표지하기 위해 생존 가능한 사이토카인 분비 세포를 민감하게 분리할 수 있습니다. 마우스 백혈구의 단일 세포 현탁액을 준비하고 37 °C에서 PMA ion mycin으로 자극하여 사이토카인 분비를 유도한 뒤 분비를 중단시킵니다. 그 후 세포를 얼음 위에 놓아 IL 17 catch 시약에 노출시킵니다.온도를 37°C로 높여 분비가 다시 시작되면, IL 17은 포획 시약에 의해 포획됩니다. 백혈구의 세포 표면에 있는 CD 45와 분비되어 세포 표면 근처에서 포획되는 IL 17에 모두 결합하는 이중 특이성 항체를 사용합니다. 이후 세포를 얼음에 놓아 분비를 다시 중단시킨 뒤 포획된 IL 17을 검출합니다. 세포를 비오틴이 접합된 두 번째 IL 17 특이성 항체 및 항비오틴 PE 항체와 함께 배양합니다. 이제 유세포 분석법으로 직접 분석하거나, 항PE 접합 마이크로비드(microbeads)를 이용한 후속 표지로 분리 및 농축을 준비할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Miltenyi Biotec의 연구원 Ellie Rankin입니다.오늘은 자극 시 IL 17을 분비하는 TH 17 백혈구를 분리하고 검출하는 절차를 보여드리겠습니다. IL 17은 적응 면역과 염증 반응에서 중요한 역할을 하며, 자가면역 염증을 유발하는 데에도 중요합니다. 이제 분석 방법이 어떻게 진행되는지 보여드리겠습니다. 오늘 프로토콜을 위해, 먼저 BSA와 2 mM EDTA가 포함된 PBS 완충액을 만들어야 합니다. 기포가 Max separation column을 막을 수 있으므로, 완충액은 탈기 후 사용 전까지 2~8 °C에서 보관해야 합니다.둘째로, 5% mouse serum이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용합니다. BSA 또는 FCS는 세포 자극의 특이성을 변화시킬 수 있으므로 배양 배지에 포함되어서는 안 됩니다. 마지막으로, MIL 10 E Biotech의 mouse IL 17 secretion assay cell enrichment and detection kit가 필요합니다.이 키트는 IL 17 포획 시약, IL 17 검출 항체, biotin, anti biotin pe, 그리고 anti PE 마이크로비드를 포함하고 있습니다. 일반적으로는 자극되지 않은 PLE 세포와 같은 음성 및 양성 대조군, 그리고 T 세포용 대비 염색을 함께 사용하여 이 프로토콜을 수행하게 됩니다. 본 시연에서는 자극된 세포만을 대상으로 진행하겠습니다.본 프로토콜은 무균 조작법을 사용하여 수행됩니다. 본 프로토콜은 gentle max associator를 사용하여 분리한 마우스 SP 세포의 단일 세포 현탁액으로 시작합니다. 세포 농도는 세포 계수를 통해 미리 결정되어야 합니다.상온에서 200 Gs로 10분간 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 원심분리 후, 피펫을 사용하여 펠릿 위의 상층액을 흡입하여 제거합니다. 펠릿의 손실을 방지하기 위해 튜브를 기울여 따라내는 방식(decanting)은 사용하지 마십시오. 이제 세포를 배양 배지에 재부유시킨 후 웰에 첨가합니다. 이때 세포 농도가 10 million cells/mL 및 5 million cells/cm²가 되도록 충분한 양의 배지를 첨가하십시오.재현탁된 세포의 면역 반응을 자극하기 위해, 시료에 ion mycin과 PMA를 첨가하고 피펫으로 부드럽게 상하 혼합합니다. 그다음 각 웰에 적절히 라벨을 붙입니다. 이제 자극 기간을 시작하기 위해 37 °C에서 혼합 없이 3시간 동안 배양합니다.자극 시작 3시간 후부터 IL 17 분석을 진행하십시오. 따라서 이에 맞춰 계획을 세우십시오. 여기 자극된 마우스 비장 세포가 보입니다.자극된 세포의 뚜렷한 형태와 세포 응집 상태에 유의하십시오. 명확한 관찰을 위해 자극된 세포만을 추적하겠습니다. 분비를 중단시키기 위해, 이제 피펫팅을 통해 부드럽게 위아래로 섞어 자극된 세포를 수집합니다.그 후 차가운 버퍼를 사용하여 세포를 웰에서 튜브로 옮기고 두 번째 세척을 수행합니다. 모든 세포가 수집되었는지 확인하기 위해 현미경으로 디쉬를 확인하는 것이 좋습니다. 세포가 여전히 부착되어 있다면, 디쉬를 헹구어 남은 세포를 수집할 수 있습니다.차가운 완충액을 사용하면, 전처리 필터를 이용하여 세포 현탁액 내의 세포 덩어리를 제거할 수 있습니다. 이 과정에서 발생할 수 있는 한 가지 잠재적인 문제점은 라벨링 중에 포획 시약의 교차 오염이 일어날 수 있다는 것입니다. 이중특이성 항체가 비분비 T세포에 결합한 상태에서 인접한 림프구에서 분비된 IL 17을 포획하게 되면 위양성 결과가 생성될 수 있습니다. 이러한 문제를 방지하기 위해서는 라벨링 전에 세포를 냉각시키고 차가운 완충액으로 작업하여 분비를 제한하고 IL 17의 확산을 늦춤으로써 교차 오염을 피하는 것이 매우 중요합니다.IL 17 분비 세포가 2%를 초과하여 존재할 경우 교차 오염이 발생할 수 있다는 점에 유의하는 것이 매우 중요합니다. IL 17 분비 세포의 농도가 2%보다 높을 것으로 예상되면 그에 맞게 부피를 조절하십시오. 따라서 세포를 차갑게 유지하는 것 외에도 정해진 농도를 유지해야 합니다.라벨링 절차를 시작하려면 15 milliliter 밀폐 튜브에 10 million 개의 세포를 사용합니다. 더 많은 수의 세포를 사용해야 하는 경우, 모든 부피를 그에 맞게 비례하여 늘리십시오. 최적의 세포 농도를 얻었다면, 10 milliliters의 차가운 버퍼를 추가하여 세포를 세척합니다.이제 냉장 원심분리기를 사용하여 300 Gs에서 10분 동안 세포를 원심분리하십시오. 원심분리 후, 피펫을 사용하여 상청액을 완전히 흡입하여 제거합니다. 상청액을 따라내면 세포 손실이 발생하고 부피가 부정확해질 수 있으므로 주의하십시오. 10 mL의 차가운 버퍼를 추가하고 원심분리 및 흡입하는 세척 단계를 반복하십시오.원하는 순도의 펠릿을 얻었으므로, 세포를 식별하기 위해 차가운 배양액 수 µL에 세포를 재현탁합니다. 이제 mouse IL 17 catch 시약 20 µL를 첨가합니다. 세포를 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.얼음 위에서 5분간 배양한 후, 튜브를 꺼내 37 °C로 데운 배지 10 mL로 세포를 희석합니다. 그런 다음 MaxMix 튜브 회전기에 튜브를 고정하고 37 °C에서 45분간 배양합니다.지속적으로 흔들어 주면서 온도를 37 °C로 높이면 사이토카인 분비가 재개됩니다. 37 °C에서 45분 동안 분비를 진행한 후, 즉시 튜브를 얼음 위에 놓으십시오. 이렇게 하면 사이토카인 분비가 중단됩니다.여기서부터는 세포를 얼음 위에 유지하는 것이 매우 중요합니다. 차가운 버퍼를 사용하면 포획 시약(catch reagent)의 교차 오염을 방지할 수 있습니다. 튜브에 차가운 버퍼를 채우고 2~8 °C에서 300 Gs로 10분 동안 원심분리합니다.상층액을 완전히 흡입하여 제거합니다. 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 세포 펠릿을 80 µL의 차가운 버퍼에 재현탁한 후 튜브를 얼음에 보관합니다.항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 10 µL의 FCR 블로킹 시약을 첨가하고 얼음 위에서 5분 동안 배양하는 것을 권장합니다. 그런 다음, 비오틴이 접합된 20 µL의 mouse IL 17 검출 항체를 첨가하고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 이전과 동일하게 10 mL의 차가운 완충액을 첨가하여 세포를 세척한 후, 2~8 °C에서 300 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.이제 상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠렛을 80 µL의 차가운 버퍼에 재현탁한 후, 2차 항체인 Anti biotin pe 20 µL를 첨가합니다. 세포와 2차 항체 용액을 혼합하고 튜브를 얼음 위에서 다시 10분 동안 배양합니다.두 번째 배양이 완료되면, 10 milliliters의 차가운 버퍼로 세포를 세척하고 원심분리합니다. 침전물을 500 microliters의 차가운 버퍼에 다시 현탁할 수 있습니다. 후속 분석을 위해 세포를 분리해야 하는 경우, anti PE 마이크로비즈로 자기 표지한 후 max 컬럼과 max 세퍼레이터를 사용하여 수동 또는 자동으로 분리할 수 있습니다.이제 SPLU 세포의 라벨링을 완료했으며, 분석 준비가 되었습니다. 유세포 분석을 실행하기 전에 자극된 SP 세포와 자극되지 않은 SP 세포를 비교하겠습니다. 사멸 세포를 게이팅하여 제거하기 위해 세포를 0.5 µg/mL 농도의 propidium iodide로 염색합니다.각 샘플당 200,000개의 세포를 유세포 분석기에 로딩하였으며, 이제 샘플 내 상대적 항체 반응성의 산점도를 살펴보겠습니다. 유세포 분석을 통해 IL 17 양성 세포와 같은 희귀 세포를 분석할 때 고려해야 할 두 가지 중요한 사항은, 전방 산란광(forward scatter) 대 측방 산란광(side scatter) 도표에서 림프구에 게이트를 설정하는 것과, 비특이적 배경 염색을 유발할 수 있는 propidium iodide 염색 사멸 세포 및 B 세포를 게이트로 제외하는 것입니다. 검출 감도를 더욱 높이기 위하여.여기서는 CD 45 RB two 20 per CP 항체의 T 세포를 검출하기 위해 CD four A PC 항체를 사용합니다. B 세포를 검출하기 위해 샘플의 전방 및 측방 산란 특성을 확인하고 림프구 집단 영역에 게이트를 적용합니다. Y축에서 염색된 사멸 세포와 염색된 B 세포를 확인하기 위해 두 번째 게이트를 적용했습니다.이 세포들은 T 세포 분석에서 제외됩니다. 기본적으로 음성 대조군인 이 예시에서, 자극되지 않은 샘플에는 IL 17을 분비하는 CD four 양성 T 세포가 약 0.003%로 매우 적음을 확인할 수 있습니다. 자극된 T 세포 집단을 살펴보면, IL 17을 분비하는 CD four 양성 T 세포의 수가 상당하며, 분리 전에는 약 0.367%, max technology를 이용한 자기 분리 후에는 60.76%임을 알 수 있습니다. 지금까지 비디오 자료를 통해 pe를 이용한 mul 10 biotech의 세포 농축 및 검출 키트인 마우스 IL 17 분비 분석법의 사용 방법을 보여드렸습니다.이 절차에서 가장 중요한 부분은 시작 집단에 포함된 IL 17 분비 세포의 빈도를 파악하는 것입니다. 적절한 세포 농도를 유지해야 라벨링 및 사이토카인 분비 기간 동안 교차 오염을 줄일 수 있으며, 이를 통해 신뢰할 수 있는 결과를 보장할 수 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마칩니다.시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 영상은 불변 자연적인 살해 T 세포, 일컬어 iNKT 세포를 고립시키기를 위한 방법을 설명합니다. 절차는 비장에 있는 iNKT 세포의 활성화 그리고 증식을 자극하기 위하여 합성 당지질을 쥐로 주입하는 것으로 시작됩니다. 연속적으로, 단 하나 세포 현탁액은 비장에서 준비되고 형광단으로 레테르를 붙인 iNKT 세포 인식 복합물로 배양되고, 자석 구슬 근거한 별거가 뒤이어, iNKT 세포를 고립시키기 위하여 배양됩니다.

마우스 모델에서 불변 자연 살해 T 세포 분리

다른 T 세포의 하위 집합에서 별개의 이펙터 기능으로, TH17 세포는 중앙 염증성자가 면역 질환에 연루되어있다. 이 체외 TH17 분화 프로토콜은 순진 CD4 + T 림프구는 TH17 세포로 분화 할 수 있고, 또한자가 면역 및 호스트 응답에서 자신의 역할을 조사할지 여부를 결정하는 방법을 제공합니다.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

B 세포 표면의 Fc 수용체에 결합된 세포구성 IgE 분자로 인해 마우스의 클래스 스위치 재조합에 대한 체외 분석은 어렵습니다.  세포질 형광 염색을 위한 고정 및 투과화 전에 표면 결합 IgE의 트립신 매개 절단을 사용하여 IgE를 검출하는 방법을 설명합니다.

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

순진한 CD4+ T cell은 활성화 시점의 환경에 따라 다양한 subset으로 분극화합니다.  naive CD4+ T cell을 다양한 effector subset으로 분화하는 것은 T cell receptor stimuli 및 specific cytokine signal의 추가를 통해 in vitro에서 달성할 수 있습니다.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

여기에서는 바이러스에 감염된 미성숙한 림프구성 융모수막염 마우스에서 분리된 조절 T(Treg) 세포의 표현형을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한, Treg cell의 억제 활성을 평가하는 프로세스를 제공합니다.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

여기서는 서로 다른 마우스 조직 내에서 IL-22 생성 세포를 시각화하기 위한 형질전환 리포터 마우스 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스에서 다른 사이토카인 또는 비서 단백질의 위치를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

제2형 염증과 관련된 그룹 2 선천성 림프 세포(ILC2s)는 주로 기생충 감염, 알레르기 질환, 대사 항상성 및 조직 복구에 대한 반응에 참여합니다. 이 연구에서는 쥐의 코 점막에서 ILC2를 분리하고 CD226의 발현을 감지하는 절차를 입증합니다.

CD226의 발현을 검출하기 위해 마우스 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포 분리

이 프로토콜은 in vitro에서 naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 분화하는 과정을 설명합니다. 특히, 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합하면 이 분화 방법을 사용하여 naïve CD4+ T 세포에서 병원성 Th17 세포의 90% 순도를 얻을 수 있습니다.

마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

자사는 자기 비드 기반 T 세포 농축 및 펩타이드:주요 조직 적합성 복합체(MHC) 사량체를 통해 쥐 폐에서 희귀 항원 특이적 T 세포 집단을 분리하고 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

펩타이드를 이용한 생쥐 폐의 희귀 항원 특이적 T 세포 식별: 주요 조직적합성 복합체 테트라머

배우세요 마우스 IL-17 분비 T 세포를 사이토카인 분비 분석 기술로 탐지 및 분리하는 방법을. 이 프로토콜은 면역학 및 자가면역 질환 연구에 활용됩니다.

가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

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