가능한 마우스 IL - 17 - Secreting의 T 세포 탐지 및 격리

이 절차를 자극시 IL - 17 분비 적극적으로 마우스 TH17의 leukocytes의 탐지 및 격리에 대해 설명합니다.

max Cytokine 분비 분석 기술을 통해 단일 세포 수준에서 분비된 cytokine을 검출하고 생존 가능한 cytokine 분비 세포를 민감하게 분리하여 IL 17 분비 세포를 라벨링할 수 있습니다. 마우스 백혈구의 단세포 현탁액을 준비하고 섭씨 37도에서 PMA 이온 마이신으로 자극하여 사이토카인 분비를 유도하여 분비를 중단시킵니다. 그런 다음 세포를 얼음 위에 올려 IL 17 캐치 시약에 노출시킵니다.

온도를 섭씨 37도로 높여 분비가 다시 시작되면 IL 17은 캐치 시약에 의해 포획됩니다. 백혈구의 세포 표면 상의 CD 45 및 IL 17에 결합하는 이중특이성 항체는 세포 표면 분비 근처에서 분비 및 포착될 때 이를 다시 얼음 위에 올려놓음으로써 세포를 정지시키고, 포획된 IL 17 세포를 검출하기 위해 세포를 얼음 위에 올려놓음으로써 다시 정지시키고, 세포를 비오틴에 접합한 두 번째 IL 17 특이적 항체와 함께 배양하고, 항비오틴 PE 항체 세포는 이제 유세포 분석에 의해 직접 분석되거나 제조될 수 있다 anti PE conjugated microbeads를 사용한 후속 라벨링을 통한 분리 및 농축. 안녕하세요, 제 이름은 Mill Tenney Biotech의 과학자 중 한 명인 Ellie Rankin입니다.

오늘은 자극 시 IL 17 IL 17을 분비하는 TH 17 백혈구를 분리하고 검출하는 방법을 보여 드리려고 하는데, 이 백혈구는 적응 면역 및 염증 반응에 중요한 역할을 하며 자가면역 염증을 유발하는 데에도 중요합니다. 분석이 어떻게 이루어지는지 보여드리겠습니다. 오늘날의 프로토콜에서는 기포가 최대 분리 컬럼을 차단할 수 있기 때문에 BSA와 2밀리몰 EDTA가 포함된 PBS를 포함하는 버퍼를 먼저 만들어야 하며, 버퍼는 사용하기 전에 가스를 제거하고 섭씨 2도에서 8도에서 보관해야 합니다.

둘째, 5%의 마우스 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지를 사용합니다. 배양 배지에는 BSA 또는 FCS가 포함되어서는 안 되며, 이러한 화합물은 세포 자극의 특이성을 변화시킬 수 있습니다. 마지막으로, MIL 10 E Biotech의 마우스 IL 17 분비 분석 세포 농축 및 검출 키트가 필요합니다.

이 키트에는 IL 17 캐치 시약, IL 17 검출 항체, 비오틴, 항 비오틴 PE 및 항 PE 마이크로비드와 같은 구성 요소가 포함되어 있습니다. 논리적으로 당신은 자극되지 않은 PLE 세포 및 T 세포에 대한 counterstain과 같은 음성 및 양성 대조군으로 이 프로토콜을 수행할 가능성이 높습니다. 시연에서는 자극된 세포에만 초점을 맞출 것입니다.

이 프로토콜은 멸균 기술을 사용하여 수행됩니다. 당사의 프로토콜은 gentle max associator를 사용하여 분리된 마우스 SP cyte의 단일 세포 현탁액으로 시작됩니다. 세포의 농도는 세포 계수를 통해 미리 결정되어야 합니다.

실온에서 10분 동안 200Gs로 셀을 펠렛화합니다.원심분리 후 피펫을 사용하여 펠릿에서 슈퍼 나틴을 흡인합니다. 펠릿의 손실을 방지하기 위해 튜브를 디캔팅하지 마십시오. 이제 세포는 우리의 배양 배지에 재현탁 된 다음 밀리리터 당 1,000 만 개의 세포와 평방 센티미터당 500 만 개의 세포의 농도에 충분한 배지를 첨가해야합니다.

재현탁 세포의 면역 반응을 자극하기 위해 샘플에 이온 마이신과 PMA를 첨가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 그런 다음 우물에 그에 따라 레이블이 지정됩니다. 이제 우리는 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양하고 자극 기간을 시작하기 위해 혼합하지 않고 배양할 것입니다.

자극 시작 3시간 후 IL 17 분석을 진행합니다. 따라서 그에 따라 계획을 세우십시오. 여기서 우리는 자극된 쥐 비장 세포를 볼 수 있습니다.

자극된 세포의 뚜렷한 형태와 세포 군집에 유의하십시오. 명확성을 위해 자극된 세포만 따라갈 것입니다. 여기서부터 분비를 멈추기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 자극된 세포를 수집합니다.

그런 다음 저온 완충액을 사용하여 셀을 웰에서 튜브로 옮기고 두 번째로 세척합니다. 모든 세포가 수집되었는지 확인하려면 현미경으로 접시를 확인하는 것이 좋습니다. 세포가 여전히 붙어 있으면 접시를 헹구어 남은 세포를 수집 할 수 있습니다.

Cold Buffer를 사용하면 세포 현탁액의 세포 덩어리를 사전 참여 필터를 사용하여 제거할 수 있습니다. 이 절차의 한 가지 잠재적인 함정은 라벨링 중에 발생할 수 있는 캐치 시약의 교차 오염입니다. 이중특이성 항체가 비분비 T 세포에 결합하여 주변 림프구에서 분비된 IL 17을 가두어 이 문제를 피하기 위해 위양성을 생성하는 경우, 표지 전에 세포를 냉각시키고 저온 완충액을 사용하여 IL 17의 분비 및 느린 확산을 제한하고 이러한 교차 오염을 방지하는 것이 중요합니다.

IL 17 분비 세포가 2% 이상 존재하는 경우에도 교차 오염이 발생할 수 있다는 점에 유의하는 것이 가장 중요합니다. IL 17 분비 세포의 농도가 2% 이상으로 예상되는 경우 그에 따라 부피를 조절합니다. 따라서 세포를 차갑게 유지하는 것 외에도 정의된 농도로 유지해야 합니다.

라벨링 절차를 시작하기 위해 15ml 밀폐형 튜브에 1,000만 개의 세포를 사용합니다. 더 높은 셀 수를 사용해야 하는 경우 그에 따라 모든 부피를 확장하기만 하면 됩니다. 최적의 세포 농도가 얻어지면 10ml의 콜드 버퍼를 추가하여 세포를 세척합니다.

이제 원심분리 후 냉장 원심분리기에서 300Gs에서 10분 동안 세포를 스핀다운하고 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 흡인합니다. 상층액을 디캔팅하면 세포 손실과 부정확한 부피가 발생할 수 있으므로 상등액을 디캔팅하지 마십시오. 10ml의 콜드 버퍼 원심분리 및 흡인으로 구성된 세척 단계를 반복합니다.

이제 원하는 순도의 펠릿이 생겼으므로 마이크로리터의 저온 배양 배지에 세포를 재현탁하여 라벨을 붙입니다. 이제 20마이크로리터의 마우스 IL 17 캐치 시약을 추가할 것입니다. 얼음 위에서 5분 동안 세포를 배양합니다.

얼음 위에서 5분간 배양한 후 튜브를 제거하고 세포를 섭씨 37도의 10밀리리터로 희석합니다. 따뜻한 매체. 그런 다음 max mix tube rotator에 튜브를 고정하고 섭씨 37도에서 45분 동안 튜브를 배양합니다.

지속적인 동작으로 온도를 섭씨 37도까지 높이면 섭씨 37도에서 45분 분비 후 사이토카인 분비가 다시 시작됩니다. 튜브를 즉시 얼음 위에 놓습니다. 이렇게 하면 사이토카인 분비가 중단됩니다.

여기서부터는 세포를 얼음 위에 두는 것이 중요합니다. 콜드 버퍼를 사용하면 캐치 시약의 교차 오염을 방지할 수 있습니다. 튜브에 차가운 버퍼를 채우고 섭씨 2도에서 8도까지 300G에서 10분 동안 원심분리합니다.

수퍼 나틴을 완전히 흡인하십시오. 세탁 단계를 한 번 더 반복합니다. Cell Pellet은 80마이크로리터의 차가운 완충액에 재현탁되고 튜브는 얼음 위에 놓입니다.

항체의 비특이적 결합을 피하려면 10마이크로리터 FCR 차단 시약을 첨가하고 얼음에서 5분 동안 배양하는 것이 좋습니다. 그런 다음 비오틴에 접합된 마우스 IL 17 검출 항체 20마이크로리터를 추가하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다. 다시 한 번, 이전과 마찬가지로 10ml의 콜드 버퍼와 원심분리기를 300Gs에서 섭씨 2도에서 8도까지 10분 동안 추가하여 세포를 세척합니다.

이제 세포 펠릿을 80마이크로리터의 콜드 버퍼에 흡인 및 재현탁시키고 20마이크로리터의 2차 항체를 추가합니다. 안티 비오틴 pe. 세포와 2차 항체 용액을 혼합하고 얼음 위에서 10분 동안 튜브를 다시 배양합니다.

두 번째 배양이 완료되면 10ml의 콜드 버퍼와 원심분리기로 세포를 세척합니다. 펠릿은 이제 500마이크로리터의 콜드 버퍼에 재현탁할 수 있습니다. 추가 다운스트림 분석을 위해 세포를 분리해야 하는 경우, anti PE 마이크로비드로 자기 라벨링하고 수동으로 분리하거나 max columns 및 max separator를 사용하여 자동으로 분리할 수 있습니다.

이제 SPLU 세포의 라벨링을 완료했으며 분석을 위한 분석 준비가 되었습니다. 우리는 달리기 전에 유세포 분석으로 자극된 SP 세포와 자극되지 않은 SP 세포를 비교할 것입니다. 사실 세포는 죽은 세포를 배출하기 위해 밀리리터당 0.5마이크로그램의 프로피듐 요오드화물로 염색됩니다.

유세포 분석기에는 각 샘플에 대해 200, 000개의 세포가 로드되었으며 이제 샘플에서 상대 항체 반응성의 산점도를 살펴볼 것입니다. 유세포 분석을 통한 IL 17 양성 세포와 같은 희귀 세포를 분석하기 위한 두 가지 중요한 고려 사항은 전방 산란 대 측면 산란 플롯에서 림프구에 대한 게이트를 설정하는 것과 비특이적 배경 염색을 유발할 수 있는 프로피듐 요오드화물 및 B 세포로 염색된 죽은 세포를 게이팅하는 것입니다. 탐지의 감도를 더욱 강화하기 위하여.

여기에서는 CD 4 A PC 항체를 사용하여 CD 45 RB 2 CP 당 20 T 세포를 검출합니다. B 세포를 검출하기 위해 샘플의 전방 및 측면 산란 특성을 확인하고 림프구 집단 관계에 보행을 적용합니다. Y축에서 염색된 죽은 세포와 염색된 B 세포를 보기 위해 두 번째 게이트를 적용했습니다.

이러한 세포는 T 세포 분석에서 제외됩니다. 본질적으로 음성 대조군인 이 예에서 자극되지 않은 샘플에서 약 0.003%의 자극되지 않은 샘플에서 CD 4개의 양성 T 세포를 분비하는 IL 17의 상당한 수를 볼 수 있으며, 최대 기술로 약 0.367%의 분리 전과 60점 76%의 자기 분리 후 76%를 분비하는 CD 4개의 양성 T 세포를 볼 수 있습니다. 우리는 비디오 문서를 통해 pe를 사용하여 세포 농축 및 검출 키트에 mul 10 biotech의 마우스 IL 17 분비 분석을 사용하는 방법을 보여 드렸습니다.

이 절차에서 가장 중요한 부분은 시작 집단에 있는 IL 17 분비 세포의 빈도를 파악하는 것입니다. 올바른 세포 농도는 라벨링과 사이토카인 분비 기간에 교차 오염이 적도록 보장하여 신뢰할 수 있는 결과를 보장합니다. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.