나노 약물 운반체의 생체 분포: SEM 응용

1. 나노 입자 주입 및 장기 수확

1. 나노 입자를 정맥 내 마취 마우스에 주입하여 수동 타겟팅을 허용합니다.
2. 원하는 시점에서, 즉, 1, 4 및 8주, 후 주사, 미국 수의학 협회(AVMA) 지침에 따라 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다.
3. 신체 구멍을 열고 외과적으로 관심있는 장기를 제거하십시오. 시료 준비 전까지 10% 인산염 완충 포르말린을 폴리프로필렌 용기에 넣었다.

2. 조직 샘플 준비

1. 포셉을 사용하여 마우스 조직을 고정된 식염수(PBS)로 이송합니다. 샘플을 30분 간 흔들어 10분마다 PBS를 교체합니다.
2. 조직을 제거하고 김스 와이프로 건조. 그런 다음 최적의 절삭 온도 화합물 (OCT)을 포함하는 플라스틱 금형에 놓습니다. 하룻밤 -80 °C에 보관하십시오.
3. 다음 날, 샘플을 극저온으로 옮기고 온도를 -23°C로 설정합니다.
4. 오르간 유형과 나노 입자 크기의 슬라이드를 라벨로 표시하고 냉동고의 선반에 놓습니다.
5. 10월로 저온척을 덮고 샘플을 위에 놓습니다. 추출기 플런저를 샘플 위로 낮추고 3-5분 동안 평형화할 수 있도록 합니다.
6. 척을 시편 홀더에 장착하고 블레이드가 얼어 붙은 시료를 직선으로 절단할 수 있도록 방향을 지정합니다. 샘플을 블레이드 가까이에 가져와 거친 향을 합니다. 두께를 30 μm로 설정하고 균등하게 절단 된 슬라이스가 생성 될 때까지 여러 섹션을 슬라이스합니다.
7. 단면 두께를 7-8 μm로 줄임으로써 미세한 면으로 전환합니다. 슬라이스에 레이블이 붙은 유리 슬라이드를 눌러 슬라이스 섹션을 수집합니다. 슬라이드 2개를 각 슬라이드에 놓고 슬라이드 랙에 보관합니다. 실온에서 건조시키십시오.
8. 일단 건조되면 10월을 제거하기 위해 슬라이드 랙을 50% 에탄올에 담그어 샘플을 탈수합니다. 그런 다음 랙을 80% 에탄올로 전송한 후 -20°C에서 10분 동안 10분 동안 차가운 메탄올의 1:1 비율로 아세톤으로 랙을 배치한다.
9. 슬라이드 랙을 제거하고 종이 타월에 과도한 용매를 배출합니다. 20-30분 후 슬라이드를 슬라이드 상자에 놓고 이미징이 될 때까지 -20°C의 냉동실에 보관하십시오.

3. SEM 및 EDS를 이용한 고해상도 이미징

1. "생물학적 샘플의 SEM 이미징"에 설명된 바와 같이 샘플을 준비합니다. 그런 다음 샘플을 SEM에 로드합니다.
2. SEM을 켜고 작동 거리를 약 5mm로 조정하고 가속 전압 및 빔 전류를 25 keV로 조정하여 일반적으로 생물학적 시료에 대해 너무 높습니다. 그러나 샘플은 전도도 및 보호를 위해 코팅됩니다.
3. 이미징을 시작하고 약 1,000-2,000X 배율로 확대하여 나노 입자를 포함하는 구조를 확인하십시오. BSD(백 스캐스트 감지)가 없으면 특정 깊이 이하로 구분할 수 없습니다.
4. 동일한 매개 변수 아래에 BSD를 삽입하고 z 방향으로 스테이지를 이전과 동일한 작업 거리로 이동합니다.
5. 동일한 배율 의 주위에 화상 진찰을 시작하고 나노 입자의 존재에 있는 높은 대비를 볼 수 있는지 확인하십시오. 이미지를 저장합니다.
6. 다른 BSD 구성(검출기의 전하가 정렬되는 경우)을 사용하여 나노 입자에 대해 가장 높은 대비를 보이는 구성을 선택합니다.
7. 나노 입자 또는 나노 입자의 덩어리를 보여주는 높은 조영 영역에 확대.
8. 챔버의^2ND 카메라를 열고 SEM 부착물의 다운 버튼을 눌러 시스템에 EDS를 삽입하는 것을 지켜보십시오. EDS가 가깝지만 BSD 또는 총을 건드리지 않는 경우 버튼을 놓습니다.
9. EDS 컴퓨터에서 Aztec 프로그램을 열고(여전히 워크스테이션상태)에서 이미지를 획득합니다.
10. EDS는 그 시점부터 특징적인 엑스레이의 스펙트럼을 보여줍니다. 그래프에서 식별할 바륨과 티타늄 피크를 모두 찾습니다. 이것은 당신이보고있는 것은 실제로 나노 입자이며 오염의 어떤 종류가 아니라는 것을 확인합니다.
11. 샘플로 돌아가 아틀라스 소프트웨어를 사용하여 슬라이드에 있는 기관의 테두리를 매핑합니다. 영역의 모자이크 이미지를 만들기 위한 "Organ" 프로토콜을 선택하고 실행하도록 합니다(대부분의 시간이 몇 시간 걸릴 수 있음).
12. 합성 이미지가 소프트웨어에 의해 생성되고 스티치되면 Tif 파일로 내보냅니다.
13. 오픈 소스 소프트웨어인 ImageJ에서 Tif 파일을 열고 대비 임계값 값을 조정하여 매우 높은 콘트라스트 영역(예: 나노입자)을 강조표시합니다. 내장 함수를 사용하여 Organ 프로토콜에 정의된 픽셀 크기를 사용하여 나노 입자의 부피를 정량화합니다(약 100nm여야 함).
14. 이 절차는 마우스 폐의 1 주 샘플을 참조하는 동안,이 절차는 분포를 보여주는 그래프를 컴파일하기 위해 다른 주 및 기타 장기의 샘플과 함께 반복된다.
15. 매주 각 기관에 대한 바이오 분포를 계산한 후, 바이오 유통 그래프는 8주 동안 나노입자의 생체 분포 및 농도의 변화를 보여줄 것이다. 이들은 피크 농도를 보여주고 또한 나노 입자가 기관에서 지우는 데 걸리는 거리에 대한 정보를 제공합니다.