5.1: 유세포 분석 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS): 비장 B 림프구의 분리

1. 준비

1. 시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
2. 먼저 세제로 모든 해부 도구를 살균한 다음 70%의 에탄올로 완전히 건조시하십시오.
3. 2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 50mL를 준비한다.

2. 해부

1. 이산화탄소 전달 시스템을 사용하여 저산소증으로 마우스를 안락사시합니다. supine 위치에 있는 해부 판에 안락사 마우스를 고정하고 가위와 집게를 사용하여 세로 복강경을 수행합니다.
2. 집게를 사용하여 복부 오른쪽에 내장과 위를 움직여 위와 비장을 노출시십시오. 비장은 위장에 부착됩니다.
3. 집게를 사용하여 위에서 비장을 조심스럽게 분리하고 HBSS 2 % FCS의 5mL가 들어있는 페트리 접시에 놓습니다.

3. 면역 세포 격리

1. 비장을 같은 페트리 접시 위에 40μm 세포 여과기에 놓습니다. 플런저로 비장을 분쇄하여 동일한 접시에 분리합니다.
2. 해리된 비장과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기.
3. 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하여 상체를 버립니다.
4. 적혈구를 lyse 칼륨 아세테이트 의 2mL에 펠릿을 다시 중단. 2 분 기다린 다음 HBSS 2 % FCS를 사용하여 최대 15mL의 볼륨을 구성할 수 있습니다.
5. 10°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 상체를 버리고 HBSS 2 % FCS의 5mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
6. 트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포를 계산하고 HBSS 2% FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 10⁷ 세포/mL로 조정합니다.

4. 셀 염색

1. 세포 현탁액의 200μL을 6개의 FACS 튜브로 전송하여 1에서 6까지 표시합니다.
2. 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
3. 다음으로, 표 1에 따라 200μL HBSS 2% FCS에 적절한 양의 항체를 추가하여 6개의 새로운 항체 혼합물을 준비한다.
4. 이어서, 이러한 항체 믹스를 해당 번호가 매겨진 FACS 튜브로 이송한다.
5. 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 항체와 혼합 된 세포 현탁액을 배양합니다.
6. 각 튜브에 HBSS 2% FCS 1mL을 추가한 다음 10°C에서 3분 동안 370 x g로 다시 원심분리기를 추가합니다.
7. 슈퍼네티드를 버리고 200μL에 펠릿을 2% FCS로 상환한다.
8. 재중단된 펠릿을 새로운 FACS 튜브로 전송합니다.

표 1: 항체 혼합 조성. HBSS + 항체의 200μL의 6개의 혼합이 실험을 위해 제조되었다. 믹스 1은 PMT 설정용이며, 혼합 2 ~5는 보상 설정이며, 혼합 6은 셀 정렬용이다.

5. FACS 교정

1. 먼저, 선별기를 켜고"Fluidics 시작"을 수행합니다.
2. 스트림을 켜고 스트림이 안정화될 때까지 15분 동안 기다립니다.
3. 스트림의 진폭을 조정하여 분리된 낙하 형성을 얻습니다. 그런 다음"스위트 스팟"을클릭하여 진폭 조정을 완료합니다.
4. 중립 밀도(N.D.) 필터를 넣고 - 1.0을 열고 세포계 설정 및 추적을 의미하는"CST"인터페이스를 엽니다.
5. 일일 품질 관리를 수행하기 위해 먼저 제조업체의 지시에 따라 FACS 매체로 CST 구슬을 희석한 다음 CST 제어를 수행합니다.
6. CST 제어가 완료되면 N.D. 1.0 필터를 사이토미터의 N.D. 2.0 필터로 바꿉다.
7. 다음으로 제조업체의 지시에 따라 FACS 매체의 낙하 지연 구슬을 희석한 다음 FACS에 로드합니다.
8. 적절한 정렬이 Drop Delay를수행하도록 하려면 -
   1. 먼저"전압"을클릭한 다음 "광학 필터"를 클릭합니다. 오른쪽 사분면은 100%와 같아야 합니다. 필요한 경우, 오른쪽 사분면에서 100 %를 얻기 위해 사이토미터 왼쪽 또는 오른쪽에 빨간색 레이저 나사를 조정합니다.
   2. 그런 다음 스트림이 수집 튜브에 속하는지 확인하기 위해 테스트 정렬을 수행합니다. 이렇게 하려면"폐기물 서랍"을클릭하고"테스트 정렬"을시작합니다. 측면 스트림이 수집 튜브에 속하는지 확인합니다. 그렇지 않으면 전압이 조정될 때까지 조정합니다.
   3. 실험 템플릿으로 이동합니다. 그런 다음"Accudrop 드롭 지연"실험을 열고"정렬 레이아웃"을 클릭합니다.
   4. 유량을 변경하여 초당 1000~3000개의 이벤트를 가져옵니다.
   5. "전압"을클릭한 다음"광학 필터"를 클릭합니다. 왼쪽 사분면은 0과 오른쪽 사분면과 100이어야 합니다.
   6. "정렬레이아웃"에서" 창을 클릭 "정렬" 다음"취소"를 클릭합니다. 왼쪽 사분면은 100이고 오른쪽 사분면은 0과 같아야 합니다. 왼쪽 사분면이 95미만이면 자동으로 조정하려면"자동 지연"을클릭합니다.

6. 유동 세포및 순도 제어

1. 형광의 세포 형태와 음수 피크를 정의하는 튜브 1 (스테인드 셀)로 시작하여 흐름 세포 측정을 시작합니다. 전방 및 측면 분산을 설정하고 각 형광 파라미터의 전압을 정의합니다. 각 점 플롯에 그리드를 사용하여 처음 10년 동안 음수 집단을 배치합니다.
2. 다음으로, 사이토미터내의 로드 튜브 2(단일 색상 제어). 음수 및 양수 모집단 중앙값이 정렬될 때까지 스펙트럼 중첩을 조정하거나 자동 계산 소프트웨어를 사용합니다. 신호를 스케일로 유지하는 것이 중요합니다. 보정 컨트롤은 실험용 불소 크롬 및 검출기 설정과 일치해야 합니다. 10,000개의 이벤트를 기록합니다.
3. 튜브 3, 4 및 5(다른 단일 색상 컨트롤)로 이 단계를 반복합니다.
4. 다음으로, 로드 튜브 6(다중 스테인드 셀)과 특정 게이팅 전략을 사용하여 관심 있는 세포 집단을 정의한다.
5. 레이아웃 정렬 창에서 관심 있는 셀 모집단을 선택합니다. "대상이벤트"에서셀 임계값과"정밀도"의정밀도 수준을 선택합니다. 여기서 는 단 하나의 인구만 정렬되고 있지만, 네 개의 다른 인구는 동시에 정렬 할 수 있습니다.
6. 일단 준비 클릭 "정렬" 및 "OK", 다음 셀 정렬을 기다립니다.
7. 세포 정렬이 완료되면, 먼저 HBSS 2 % FCS의 90 마이크로 리터와 새로운 FACS 튜브에 정렬 된 세포의 10μL을 파이프하여 순도 제어를 수행합니다.
8. 그런 다음, 튜브를 사이토미터로 로드합니다. 게이팅 전략이 의도한 대로 작동하는지 확인하기 위해 세포의 표현형을 기록하고 분석합니다.

7. 데이터 분석

1. 'FlowJo' 소프트웨어를 열고 각 튜브의 파일을"모든 샘플"창에서 드래그합니다.
2. 파일을 두 번 클릭하여 새 창에서 엽니다.
3. "다각형"을클릭하고 이전에 사용한 게이팅 전략을 다시 만듭니다.
4. 다른 모든 파일로 단계를 반복합니다.
5. 점 플롯을 시각화하려면"레이아웃 편집기"를클릭하고 레이아웃 편집기 탭에서 튜브 6 및 순도 제어에서 관심 있는 개체수를 드래그합니다. 셀은 순도 제어에 대한 관심 의 집단에만 나타나야 합니다(그림 2참조).
6. 정렬된 셀에서 B 림프구의 순도를 확인하려면"테이블 편집기"를 클릭합니다. 튜브 6에서 B 림프구 모집단을 드래그하고 테이블의 순도 제어.
7. "통계"에서메뉴는 CD45⁺ 셀의 빈도를 선택하여 이 셀 채우기의 순도를 테스트한 다음"테이블 만들기"를 클릭합니다.
8. 매개 변수 값이 새 테이블에 나타납니다. 순도 제어 창에서 CD45⁺ 세포 내에서 B 림프구의 빈도를 확인하여 98 % 이상이어야합니다 (그림 2, 하단 패널 참조).

면역 체계는 백혈구라고도 하는 백혈구를 생성하여 병원체의 침입으로부터 신체를 보호합니다. 병원체가 유기체를 성공적으로 감염시키면 다양한 백혈구가 활성화되고 이러한 조정 반응을 면역 반응이라고 합니다.

연구자들이 병원체에 대한 반응으로 활성화된 면역 세포의 특정 유형과 수를 식별할 수 있는 것은 종종 유용합니다. 유세포 분석은 연구자들이 표면에 발현된 특정 항원결정기를 기반으로 세포를 분리할 수 있는 기술입니다. 이는 알려진 면역 세포 특이적 항원결정기에 결합하는 형광 표지 단클론 항체를 사용하여 수행되며, 여기 시 이러한 결합된 형광 색소는 유세포 분석기로 검출하고 점수를 매길 수 있는 빛의 파장을 방출합니다.

유세포 분석기는 세 가지 시스템으로 구성됩니다. 유체 시스템은 세포가 레이저 앞을 하나씩 통과하도록 흐름을 통해 세포를 운반합니다. 광학 시스템은 형광단의 존재 또는 부재를 인식하는 레이저와 검출기로 구성됩니다. 마지막으로, 전자 시스템은 수집된 광학 데이터를 분석을 위해 전자 파일로 변환합니다.

유세포 분석의 확장은 형광 활성화 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter, FACS)로, 이를 통해 특정 세포 집단을 농축하여 독립적으로 연구할 수 있습니다. 세포 분류는 각각 단일 세포를 포함하는 미세 방울을 형성하는 유체 흐름 내의 진동 노즐을 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 검출기는 각 물방울에서 형광등이 방출되는지 여부를 결정하고 해당 정보를 기반으로 전자석이 각 세포에 음전하 또는 양전하를 부여합니다. 다음으로, 강력한 전기장은 서로 다르게 충전된 물방울을 별도의 용기로 분류합니다. 궁극적으로, 용기 중 하나는 특정 세포 표면 분자의 발현을 기반으로 하는 균질한 세포 집단을 포함합니다.

이 동영상에서는 유세포 분석을 사용하여 마우스 비장 조직에서 백혈구를 분리하고 FACS를 사용하여 B 림프구를 선택하는 방법을 배웁니다.

먼저 실험용 장갑을 끼고 적절한 보호복을 착용하십시오. 다음으로, 해부 가위와 집게를 먼저 세제로 씻은 다음 70% 에탄올로 씻은 다음 깨끗한 종이 타월로 말리십시오.

그런 다음 49ml의 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)을 50ml 튜브에 넣습니다. 태아 송아지 혈청(Fetal Calf Serum, FCS) 1ml를 첨가하여 HBSS 2% FCS 용액을 만들고 약 10회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.

다음으로, 안락사된 마우스를 해부 플레이트의 앙와위 위치에 놓습니다. 가위와 집게를 사용하여 복강에 접근하기 위해 세로 개복술을 수행합니다. 집게를 사용하여 복부 오른쪽에 있는 장을 한쪽으로 움직여 위와 비장을 노출시킵니다. 비장은 위에 붙어 있습니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 HBSS 2% FCS 5ml를 페트리 접시에 넣습니다. 집게를 사용하여 위에서 비장을 조심스럽게 분리하고 비장을 페트리 접시에 넣습니다.

면역 세포를 분리하려면 먼저 페트리 접시의 40미크론 세포 여과기에 비장을 놓습니다. 플런저로 비장을 부수어 접시로 분리하십시오. 그런 다음 페트리 접시에서 해리된 비장과 액체를 15ml 원심분리기 튜브에 피펫으로 넣습니다. 섭씨 10도에서 7분 동안 370회 g으로 튜브를 원심분리한 다음 펠릿을 방해하지 않도록 튜브를 조심스럽게 회수합니다.

이제 펠릿을 피하고 상등액을 제거하고 액체를 적절한 폐기물 용기에 버리십시오. 그런 다음 2ml의 ACK 용해 완충액을 원심분리 튜브에 첨가하여 적혈구를 재현탁 및 용해합니다. 2분 정도 기다린 다음 HBSS 2% FCS를 추가하여 총 15밀리리터의 부피를 얻습니다. 원심분리를 반복합니다. 튜브를 조심스럽게 회수하고 상층액을 버리십시오. 펠릿을 HBSS 2% FCS 5밀리리터에 다시 재현탁합니다.

재현탁된 세포를 계수하려면 5마이크로리터의 세포 현탁액을 5마이크로리터의 트리판 블루(Trypan Blue)로 희석합니다. 그런 다음 이 희석된 세포 현탁액을 5마이크로리터 방울로 커버 유리와 Malassez 슬라이드 사이에 부드럽게 떨어뜨립니다. 이제 40X 배율의 현미경으로 존재하는 세포의 수를 세십시오. 그런 다음 적절한 부피의 HBSS 2% FCS를 첨가하여 세포 농도를 10에서 밀리리터당 7번째 세포로 조정합니다.

면역 세포를 염색하려면 먼저 6개의 FACS 튜브를 1개에서 6개까지 라벨링합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 셀 용액을 6개의 튜브 각각으로 옮깁니다. 이 튜브를 섭씨 10도에서 7분 동안 370회 g으로 원심분리하고 상층액을 제거합니다.

그런 다음 6개의 새 FACS 튜브를 1에서 6까지 라벨을 붙이고 각각에 200마이크로리터의 HBSS 2% FCS를 피펫팅합니다. 표 1에 따라 각 튜브에 적절한 양의 항체를 첨가하여 6개의 새로운 항체 혼합물을 준비합니다. 믹스 1은 항체가 첨가되지 않은 염색되지 않은 세포를 위한 것입니다. 2개에서 5개까지의 혼합물은 각각 보상 설정을 위해 서로 다른 단일 항체를 포함합니다. Mix six에는 분류에 사용할 다중 염색 세포에 대한 4개의 항체가 모두 포함되어 있습니다.

다음으로, 이러한 항체 혼합물을 해당 번호가 매겨진 FACS 튜브로 옮깁니다. 이 용액을 섭씨 4도에서 20분 동안 또는 어두운 곳의 얼음 위에서 배양하십시오. 다음으로, 각 튜브에 HBSS 2% FCS 1ml를 첨가한 다음 다시 원심분리합니다. 상등액을 폐기한 다음 펠릿을 HBSS 2% FCS 200마이크로리터에 재현탁합니다. 마지막으로, 재현탁된 펠릿을 새로 라벨링된 FACS 튜브로 옮깁니다.

FACS를 수행하려면 먼저 분류기를 켭니다. 그런 다음 세포분석기 메뉴를 선택하고 fluidics startup을 클릭합니다. 화면의 지시를 따릅니다.

스트림 탭에서 빨간색 십자가를 클릭하여 스트림을 켠 다음 스트림이 안정화될 때까지 15분 동안 기다립니다. 스트림 탭에 명확한 분리된 드롭이 나타날 때까지 스트림의 진폭을 조정합니다. 그런 다음 스위트 스폿을 클릭하여 진폭 조정을 완료합니다. 레이저 앞에 ND(Neutral Density) 필터 1.0을 삽입합니다.

화면 상단의 유세포 분석기 메뉴를 열고 Cytometer Setup and Tracking의 약자인 CST를 선택합니다. 매일 품질 관리를 수행하려면 먼저 제조업체의 지침에 따라 FACS 튜브에서 CST 비드를 FACS 배지로 희석합니다. 그런 다음 튜브를 기계에 로드하고 CST 탭에서 실행을 클릭하여 CST 제어를 수행합니다.

CST 제어가 완료되면 ND 1.0 필터를 세포분석기의 ND 2.0 필터로 교체합니다. 다음으로, 제조업체의 지침에 따라 FACS 매체에서 드롭 딜레이 비드를 희석한 다음 튜브를 FACS에 로드합니다. 적절한 분류를 보장하려면 먼저 전압을 클릭한 다음 광학 필터를 클릭하여 드롭 지연을 수행하십시오. 광학 필터의 오른쪽 사분면은 100%와 같아야 하며, 이는 방울의 100%가 기계에 등록되었음을 나타냅니다. 필요한 경우 세포 분석기의 빨간색 레이저 나사를 왼쪽 또는 오른쪽으로 조정하여 오른쪽 사분면에서 100%를 얻습니다. 흐름이 수집 튜브로 떨어지도록 하는 것이 중요합니다. 이렇게 하려면 waste drawer를 클릭하여 테스트 정렬을 수행한 다음 테스트 정렬을 수행합니다. 측면 흐름이 수집 튜브로 떨어지는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 정렬할 때까지 정렬 탭에서 전압을 조정합니다.

브라우저 탭을 선택하고 공유 보기를 클릭하여 실험 템플릿으로 이동합니다. 그런 다음 Accudrop_DROP DELAY 실험을 열고 정렬 레이아웃 버튼을 클릭합니다. 이제 초당 3,000개의 이벤트에 도달할 때까지 흐름 속도를 조작하여 획득 대시보드에서 임계값 속도를 변경합니다. 전압을 클릭한 다음 광학 필터를 클릭합니다. 왼쪽 사분면은 0과 같고 오른쪽 사분면은 100과 같아야 합니다.

마지막으로 정렬 레이아웃 창에서 정렬을 클릭한 다음 취소를 클릭합니다. 왼쪽 사분면은 100과 같아야 하고 오른쪽 사분면은 0과 같아야 합니다. 왼쪽 사분면이 95 미만인 경우 자동 지연을 클릭하여 왼쪽 사분면에서 100%의 드롭을 얻기 위해 전압을 자동으로 높이도록 소프트웨어에 지시합니다.

유세포 분석을 시작하기 위해 먼저 염색되지 않은 세포를 사용하여 세포 형태와 형광 색소의 음성 피크를 정의합니다. 이렇게 하려면 염색되지 않은 세포가 포함된 튜브 1을 기계에 놓고 획득 대시보드 탭에서 load를 클릭합니다. Cytometer(세포분석기) 탭에서 세포 집단이 화면에 점의 조밀한 농도로 표시될 때까지 전방 및 측면 산란 전압을 조정합니다. 림프구는 작은 세포이므로 전방 산란이 낮고 측면 산란이 낮습니다.

다음으로, 음의 수준에서 세포 집단이 글로벌 워크시트 탭의 첫 번째 10년이 될 때까지 세포분석기 탭에서 형광 색소의 전압을 조정하여 배경 형광을 제거합니다. cytometer(세포분석기) 메뉴에서 view configuration(보기 구성)을 클릭하고 모든 형광 색소가 있는지 확인합니다. 다음으로, 튜브 2를 세포분석기에 넣고 load를 클릭합니다. negative 및 positive population medians가 global worksheet 탭에서 정렬될 때까지 cytometer 탭에서 스펙트럼 중복을 조정합니다. Acquisition 탭에서 events to record 매개변수를 10,000으로 설정하고 record를 클릭합니다. 튜브 3, 4, 5에 대해 이 단계를 반복합니다.

다음으로, 다중 염색된 세포를 포함하는 로드 튜브 6을 로드합니다. B 림프구를 분리하려면 먼저 세포의 형태에 따라 세포를 정렬하기 위한 매개변수를 설정합니다. 첫 번째 창에서 y축에 FSC-A 전방 산란 영역을, x축에 SSC-A 측면 산란 영역을 플로팅합니다. 산점도에서 각 점은 셀을 나타냅니다. 전역 워크시트에서 polygon gate를 클릭한 다음 낮은 forward scatter와 중간 side scatter가 있는 모집단을 선택합니다. 새 점도표 창에서 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 메뉴에서 모집단 표시를 선택한 다음 P1을 클릭합니다.

그런 다음 새 창에서 y축에 생존율을 플로팅하고 x축에 CD45를 플로팅하여 생존 가능한 CD45 양성 세포를 게이트합니다. 폴리곤 게이트를 사용하여 생존도가 낮고 CD45 신호가 높은 셀에 원을 그리며 P2를 선택하여 선택한 셀을 새 창에 표시합니다. 다음 창에서는 T 림프구를 제외한 CD45 양성 백혈구에 대한 게이트를 확인합니다. x축에 CD45, y축에 CD3을 두고 CD45 신호가 높고 CD3 신호가 낮은 모집단에 원을 그리며 P3를 선택합니다. 마지막으로, B 림프구를 식별하는 CD19 양성 세포에 대한 게이트입니다. y축에 CD19, x축에 CD3를 두고 CD19 신호가 높고 CD3 신호가 낮은 모집단에 원을 그리며 P4를 선택합니다.

이제 모든 정렬 매개 변수가 설정되었습니다. 다음으로, 정렬 레이아웃 창에서 관심 있는 세포 집단인 P4(게이트된 네 번째 집단)를 선택하고 기계에 B 림프구만 분류하도록 지시합니다. 타겟 이벤트를 10,000개 셀로 설정하고 정밀도를 순도로 설정합니다. 우리는 하나의 모집단만 분류하고 있습니다. 그러나 최대 4개의 서로 다른 모집단을 동시에 정렬할 수 있습니다. 준비가 되면 정렬 및 확인을 클릭합니다. 그런 다음 셀 정렬을 기다립니다.

세포 분류가 완료되면 분류된 세포 10마이크로리터를 90마이크로리터의 HBSS 2% FCS가 있는 새 FACS 튜브에 피펫팅하여 순도 제어를 수행합니다. 튜브를 세포분석기에 놓고 load를 클릭한 다음 record를 클릭하여 세포의 표현형을 분석하여 게이팅 전략이 의도한 대로 작동했는지 확인합니다.

이제 분류된 세포를 분석하여 마우스 비장에서 분리된 백혈구 중 B 림프구의 비율을 결정할 것입니다. 시작하려면 FlowJo 아이콘을 두 번 클릭하고 각 튜브의 파일을 모든 샘플 창으로 드래그합니다.

폴리곤을 클릭하고 이전 섹션에서 사용된 게이팅 전략을 다시 만듭니다. 그런 다음 layout editor를 클릭하고 tube six에서 관심 있는 B 림프구 집단과 purity control을 layout editor 탭으로 드래그합니다. B 림프구를 나타내는 점도표가 나타납니다. 이 예에서 오른쪽 상단의 플롯은 전체 비장 세포 현탁액에서 정렬된 B 림프구를 나타내고 오른쪽 하단의 플롯은 순도 대조군입니다. 세포는 순도 대조군에서 관심 모집단에서만 나타나야 합니다.

정렬된 세포에서 B 림프구의 순도를 확인하려면 테이블 편집기를 클릭하십시오. 표에서 tube six 및 purity control의 B 림프구 모집단을 드래그합니다. 통계 메뉴에서 CD45 양성 세포의 빈도를 선택하여 이 세포 집단의 순도를 테스트합니다. 그런 다음 테이블 만들기를 클릭합니다. 매개 변수 값이 새 테이블에 나타납니다. Purity Control Window에서 CD45 양성 세포 내 B 림프구의 빈도를 확인하며, 이는 98%보다 높아야 합니다.