유세포 분석 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS): 비장 B 림프구의 분리

1. 준비

1. 시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
2. 먼저 세제로 모든 해부 도구를 살균한 다음 70%의 에탄올로 완전히 건조시하십시오.
3. 2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 50mL를 준비한다.

2. 해부

1. 이산화탄소 전달 시스템을 사용하여 저산소증으로 마우스를 안락사시합니다. supine 위치에 있는 해부 판에 안락사 마우스를 고정하고 가위와 집게를 사용하여 세로 복강경을 수행합니다.
2. 집게를 사용하여 복부 오른쪽에 내장과 위를 움직여 위와 비장을 노출시십시오. 비장은 위장에 부착됩니다.
3. 집게를 사용하여 위에서 비장을 조심스럽게 분리하고 HBSS 2 % FCS의 5mL가 들어있는 페트리 접시에 놓습니다.

3. 면역 세포 격리

1. 비장을 같은 페트리 접시 위에 40μm 세포 여과기에 놓습니다. 플런저로 비장을 분쇄하여 동일한 접시에 분리합니다.
2. 해리된 비장과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기.
3. 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하여 상체를 버립니다.
4. 적혈구를 lyse 칼륨 아세테이트 의 2mL에 펠릿을 다시 중단. 2 분 기다린 다음 HBSS 2 % FCS를 사용하여 최대 15mL의 볼륨을 구성할 수 있습니다.
5. 10°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 상체를 버리고 HBSS 2 % FCS의 5mL에서 펠릿을 다시 놓습니다.
6. 트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포를 계산하고 HBSS 2% FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 10⁷ 세포/mL로 조정합니다.

4. 셀 염색

1. 세포 현탁액의 200μL을 6개의 FACS 튜브로 전송하여 1에서 6까지 표시합니다.
2. 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
3. 다음으로, 표 1에 따라 200μL HBSS 2% FCS에 적절한 양의 항체를 추가하여 6개의 새로운 항체 혼합물을 준비한다.
4. 이어서, 이러한 항체 믹스를 해당 번호가 매겨진 FACS 튜브로 이송한다.
5. 어둠 속에서 얼음에 20 분 동안 항체와 혼합 된 세포 현탁액을 배양합니다.
6. 각 튜브에 HBSS 2% FCS 1mL을 추가한 다음 10°C에서 3분 동안 370 x g로 다시 원심분리기를 추가합니다.
7. 슈퍼네티드를 버리고 200μL에 펠릿을 2% FCS로 상환한다.
8. 재중단된 펠릿을 새로운 FACS 튜브로 전송합니다.

표 1: 항체 혼합 조성. HBSS + 항체의 200μL의 6개의 혼합이 실험을 위해 제조되었다. 믹스 1은 PMT 설정용이며, 혼합 2 ~5는 보상 설정이며, 혼합 6은 셀 정렬용이다.

5. FACS 교정

1. 먼저, 선별기를 켜고"Fluidics 시작"을 수행합니다.
2. 스트림을 켜고 스트림이 안정화될 때까지 15분 동안 기다립니다.
3. 스트림의 진폭을 조정하여 분리된 낙하 형성을 얻습니다. 그런 다음"스위트 스팟"을클릭하여 진폭 조정을 완료합니다.
4. 중립 밀도(N.D.) 필터를 넣고 - 1.0을 열고 세포계 설정 및 추적을 의미하는"CST"인터페이스를 엽니다.
5. 일일 품질 관리를 수행하기 위해 먼저 제조업체의 지시에 따라 FACS 매체로 CST 구슬을 희석한 다음 CST 제어를 수행합니다.
6. CST 제어가 완료되면 N.D. 1.0 필터를 사이토미터의 N.D. 2.0 필터로 바꿉다.
7. 다음으로 제조업체의 지시에 따라 FACS 매체의 낙하 지연 구슬을 희석한 다음 FACS에 로드합니다.
8. 적절한 정렬이 Drop Delay를수행하도록 하려면 -
   1. 먼저"전압"을클릭한 다음 "광학 필터"를 클릭합니다. 오른쪽 사분면은 100%와 같아야 합니다. 필요한 경우, 오른쪽 사분면에서 100 %를 얻기 위해 사이토미터 왼쪽 또는 오른쪽에 빨간색 레이저 나사를 조정합니다.
   2. 그런 다음 스트림이 수집 튜브에 속하는지 확인하기 위해 테스트 정렬을 수행합니다. 이렇게 하려면"폐기물 서랍"을클릭하고"테스트 정렬"을시작합니다. 측면 스트림이 수집 튜브에 속하는지 확인합니다. 그렇지 않으면 전압이 조정될 때까지 조정합니다.
   3. 실험 템플릿으로 이동합니다. 그런 다음"Accudrop 드롭 지연"실험을 열고"정렬 레이아웃"을 클릭합니다.
   4. 유량을 변경하여 초당 1000~3000개의 이벤트를 가져옵니다.
   5. "전압"을클릭한 다음"광학 필터"를 클릭합니다. 왼쪽 사분면은 0과 오른쪽 사분면과 100이어야 합니다.
   6. "정렬레이아웃"에서" 창을 클릭 "정렬" 다음"취소"를 클릭합니다. 왼쪽 사분면은 100이고 오른쪽 사분면은 0과 같아야 합니다. 왼쪽 사분면이 95미만이면 자동으로 조정하려면"자동 지연"을클릭합니다.

6. 유동 세포및 순도 제어

1. 형광의 세포 형태와 음수 피크를 정의하는 튜브 1 (스테인드 셀)로 시작하여 흐름 세포 측정을 시작합니다. 전방 및 측면 분산을 설정하고 각 형광 파라미터의 전압을 정의합니다. 각 점 플롯에 그리드를 사용하여 처음 10년 동안 음수 집단을 배치합니다.
2. 다음으로, 사이토미터내의 로드 튜브 2(단일 색상 제어). 음수 및 양수 모집단 중앙값이 정렬될 때까지 스펙트럼 중첩을 조정하거나 자동 계산 소프트웨어를 사용합니다. 신호를 스케일로 유지하는 것이 중요합니다. 보정 컨트롤은 실험용 불소 크롬 및 검출기 설정과 일치해야 합니다. 10,000개의 이벤트를 기록합니다.
3. 튜브 3, 4 및 5(다른 단일 색상 컨트롤)로 이 단계를 반복합니다.
4. 다음으로, 로드 튜브 6(다중 스테인드 셀)과 특정 게이팅 전략을 사용하여 관심 있는 세포 집단을 정의한다.
5. 레이아웃 정렬 창에서 관심 있는 셀 모집단을 선택합니다. "대상이벤트"에서셀 임계값과"정밀도"의정밀도 수준을 선택합니다. 여기서 는 단 하나의 인구만 정렬되고 있지만, 네 개의 다른 인구는 동시에 정렬 할 수 있습니다.
6. 일단 준비 클릭 "정렬" 및 "OK", 다음 셀 정렬을 기다립니다.
7. 세포 정렬이 완료되면, 먼저 HBSS 2 % FCS의 90 마이크로 리터와 새로운 FACS 튜브에 정렬 된 세포의 10μL을 파이프하여 순도 제어를 수행합니다.
8. 그런 다음, 튜브를 사이토미터로 로드합니다. 게이팅 전략이 의도한 대로 작동하는지 확인하기 위해 세포의 표현형을 기록하고 분석합니다.

7. 데이터 분석

1. 'FlowJo' 소프트웨어를 열고 각 튜브의 파일을"모든 샘플"창에서 드래그합니다.
2. 파일을 두 번 클릭하여 새 창에서 엽니다.
3. "다각형"을클릭하고 이전에 사용한 게이팅 전략을 다시 만듭니다.
4. 다른 모든 파일로 단계를 반복합니다.
5. 점 플롯을 시각화하려면"레이아웃 편집기"를클릭하고 레이아웃 편집기 탭에서 튜브 6 및 순도 제어에서 관심 있는 개체수를 드래그합니다. 셀은 순도 제어에 대한 관심 의 집단에만 나타나야 합니다(그림 2참조).
6. 정렬된 셀에서 B 림프구의 순도를 확인하려면"테이블 편집기"를 클릭합니다. 튜브 6에서 B 림프구 모집단을 드래그하고 테이블의 순도 제어.
7. "통계"에서메뉴는 CD45⁺ 셀의 빈도를 선택하여 이 셀 채우기의 순도를 테스트한 다음"테이블 만들기"를 클릭합니다.
8. 매개 변수 값이 새 테이블에 나타납니다. 순도 제어 창에서 CD45⁺ 세포 내에서 B 림프구의 빈도를 확인하여 98 % 이상이어야합니다 (그림 2, 하단 패널 참조).