자기 활성화 세포 분류 (MACS): 흉선 T 림프구 분리

1. 준비

1. 시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
2. 먼저 세제로 모든 해부 도구를 씻은 다음 70 % 에탄올로 씻은 다음 깨끗한 종이 타월로 말리십시오.
3. 2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)의 200mL를 준비한다.

2. 해부

1. supine 위치에 있는 해부 플레이트에 안락사 마우스를 고정합니다.
2. 가위와 집게를 사용하여 흉부 구멍에 접근하기 위해 세로 복강경을 수행합니다.
3. 심장을 제거하여 심장 위에 있는 흉선에 접근할 수 있습니다. 그런 다음, 두 개의 흰 엽으로 구성되고 심장 위의 가슴 구멍에 위치하는 흉통을 식별합니다.
4. 포셉을 사용하여 흉선을 조심스럽게 분리하고 5mL의 HBSS 2 % FCS로 페트리 접시에 놓습니다.

3. 면역 세포 격리

1. 같은 페트리 접시 위에 40 μm 세포 여과기에 흉기를 놓습니다. 플런저로 흉기를 분쇄하여 같은 접시에 해리합니다.
2. 해리된 흉선과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮킨다.
3. 페트리 접시를 HBSS 2% FCS 5mL로 세척하고 세척된 배지도 동일한 원심분리기 튜브로 옮겨 넣습니다.
4. 20°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
5. 적혈구를 lyse 칼륨 아세테이트 의 2 mL에 펠릿을 다시 중단. 2 분 기다린 다음 HBSS 2 % FCS를 사용하여 최대 14 mL의 볼륨을 구성하십시오.
6. 20°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 슈퍼네티드를 버리고 5mL의 HBSS 2% FCS로 펠릿을 다시 놓습니다.
7. 트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포 농도를 추정하고 HBSS 2% FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 10⁷ 세포/mL로 조정한다.

4. 면역 세포의 자기 라벨링

1. 두 개의 FACS 튜브를 가져 가라. 자기 라벨링을 사용하여 분리될 하나의 튜브, "비농축 T 세포", 그리고 다른 튜브인 "농축 된 T 세포"에 라벨을 붙입니다.
2. 두 개의 FACS 튜브 각각에 세포 용액을 분배합니다.
3. 원심 분리기 "농축 된 T 세포"튜브는 370 x g에서 20 °C에서 3 분 동안 3 분 동안 펠릿을 피하는 슈퍼 네티얼을 폐기하십시오.
4. 항 CD3 생체개화 항체 혼합물의 250 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다(표 1, 혼합 1).

섞다	라벨링 시약	희석
1	항 CD3 바이오티니화 항체	1/400 (HBSS 2% FCS)
2	스트렙타비딘 커플비즈	1/5 (HBSS 2% FCS)
3	안티 CD3 BV421	1/200 (HBSS 2% FCS)

표 1: 항체 혼합 조성. 믹스 1과 2는 자기 분리에 사용됩니다. 혼합 3은 자기 분리 후 세포 농축을 평가하는 데 사용됩니다.

5. 세포 서스펜션 항체 믹스를 어둠 속에서 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
6. 3mL의 HBSS 2% FCS를 튜브와 원심분리기모두에 370 x g로 다시 넣고 20°C에서 3분 동안 추가합니다.
7. 상체를 버리고 250 μL 스트렙타비딘 커플 비즈 (표 1, 혼합 2)에서 펠릿을 다시 놓습니다.
8. 세포 혼합물과 구슬을 얼음에 20분 동안 배양합니다.
9. 다음으로, HBSS 2% FCS의 3mL를 추가하고 20°C에서 3분 동안 370 x g에서 잘 섞고 원심분리기를 다시 섞습니다.
10. HBSS 2% FCS의 2mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.

5. CD3 양성 세포의 자기 분리

1. 자석에 컬럼을 놓고 HBSS 2% FCS3mL을 추가하여 시스템을 가습합니다. 5분 간 기다립니다.
2. 다음으로 레이블이 지정된 셀을 열에 파이프로 넣습니다.
3. 셀 서스펜션이 컬럼을 통과한 후, HBSS 2% FCS의 3mL로 컬럼 X3를 세척합니다.
4. 그런 다음 자석에서 컬럼을 제거하고 15mL 수집 튜브에 놓습니다.
5. 대상 셀을 elute하려면 열에 HBSS 2% FCS5mL을 추가하고 플런저로 열을 플러시합니다.
6. HBSS 2% FCS의 또 다른 5mL와 함께 용출 단계를 반복합니다.

6. 유동 세포측정에 의한 표적 세포 농축 평가

1. "농축 된 T 세포"라는 레이블이 붙은 FACS 튜브로 용출 된 세포 현탁액 500 μL을 전송합니다. "비 농축 T 셀" 서스펜션의 200 μL을 제2 FACS로 전송합니다.
2. 그런 다음 20°C에서 7분 동안 370 x g의 두 튜브를 원심분리합니다.
3. 수퍼나탄을 폐기한 다음 형광 항체 믹스 3(표 1 참조)의 100 μL을 두 튜브에 추가합니다.
4. 어둠 속에서 4 °C에서 20 분 동안 두 튜브를 배양하십시오.
5. 다음으로, 20°C에서 3분 동안 370 x g에서 튜브에 HBS S 2% FCS 3mL을 추가하고 원심분리기.
6. 상체를 폐기한 다음 각 튜브를 HBSS 2% FCS의 250μL로 재보설합니다.
7. 지금, 유동 세포측정에 의하여 CD3 양성 세포 농축 속도를 평가합니다.

7. 데이터 분석

1. 'FlowJo' 아이콘을 열고"모든 샘플"창에서 각 튜브의 파일을 드래그합니다.
2. "농축된 T 셀" 파일을 두 번 클릭하여 Y축의 X축 및 측면 분산(SSC-A)에 전방 분산(FSC-A)을 표시하는 점 플롯을 표시합니다.
3. 림프구 인구를 동그라미로"다각형"을클릭합니다.
4. 다음으로 동그라미를 한 채우기를 두 번 클릭하여 새 창을 만듭니다.
5. X 축에서 Y축및"FSC-A"에서"FSC-W"를선택하고 FSA-W 음수 셀을 동그라미로 선택합니다. "하위채우기 식별"에서셀 집단을 "단일 셀"이라고 지칭합니다.
6. 동그라미를 한 채우기를 두 번 클릭하여 새 창을 만듭니다. Y 축에서"CD3"를선택하고 CD3 양성 셀을 동그라미로 합니다. "하위인구 식별"에서"창 이름 셀 채우기 "T 셀".
7. "비 농축 된 T 셀"로 반복합니다.
8. 셀 채우기를 시각화하려면"레이아웃 편집기"를클릭하고 "농축 된 T 셀"과 "비 농축 된 T 셀"파일에서"T 셀"을탭으로 드래그합니다.
9. CD3+ 림프구를 나타내는 점 플롯이 나타납니다. CD3+ 셀은 CD3+ 농축 튜브에 대한 관심 의 집단에만 나타나야 합니다.
10. 정렬된 셀에서 CD3+ 림프구의 농축을 평가하려면"테이블 편집기"를클릭한 다음 "농축 된 T 셀"과 "농축되지 않은 T 셀" 파일에서 "T 셀"모집단을 테이블에 드래그합니다.
11. "통계"메뉴에서"림프구 의 빈도"셀을 선택하여 모든 림프구에서 CD3+ 셀의 백분율을 확인한 다음"테이블 만들기"를클릭합니다.
12. 매개 변수 값이 새 테이블에 나타납니다. "농축 된 T 세포"의 경우 CD3 + 셀의 주파수는 약 80 %여야합니다.