5.3: ELISA 분석: 간접, 샌드위치 및 길항

1. 간접 ELISA

간접ELISA는 1차 항원 특이적 항체가 이차 공주 항체에 의해 인식되는 곳이다. 다음 프로토콜은 인플루엔자 A 바이러스(IAV)-감염된 마우스의 혈청 샘플이 IAV 특이적 IgG 항체의 존재를 위해 시험되는 간접 ELISA 방법의 예입니다. 이 예의 한 가지 강점은 다른 이차 항체가 모든 항체 등색형 또는 특정 등색형(예를 들어, IgG)을 인식하는 데 사용될 수 있다는 것이다.

마이크로 플레이트에 항원을 코팅

1. 정제된 항원의 50 μL(정제된 A/PR/8 인플루엔자 A 바이러스의 2 mg/mL)을 각 플레이트의 각 웰에 코팅하여 정제된 항원을 가진 96웰 ELISA 플레이트의 웰을 코팅한다.
2. 접착제 덮개로 접시를 덮고 4°C에서 하룻밤 동안 배양하여 항원이 접시에 결합할 수 있도록 합니다.
3. 잠복이 완료되면 플레이트를 싱크대 위로 쓸어 넘으로써 코팅 용액을 제거합니다.

블로킹

4. 코팅된 우물에서 남은 단백질 결합 부위를 200 μL 차단 버퍼를 추가하여, 1X PBS에 당나귀 혈청이 5% 잘 사용된다. 대체 차단 시약은 PBS에서 5% 비지방 건조 우유 또는 BSA 또는 이차 항체가 생성된 동물로부터의 정상 혈청을 포함한다.
5. 실온에서 최소 2시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
6. 인큐베이션에 이어, 플레이트를 가볍게 하여 블로킹 버퍼를 제거한 다음 1% Tween-20을 함유한 PBS로 플레이트를 세척합니다.

1차 항체를 가진 배양

7. 1X PBS를 사용하여 1-204,800의 희석 범위를 얻기 위해 1차 항체를 포함하는 혈청 시료의 직렬 희석을 준비한다. 이렇게 하려면 먼저 혈청을 1:12.5로 희석한 다음 4X 희석(희석 범위 - 1:12.5 ~ 1:204,800)을 수행합니다.
8. 연재된 혈청 샘플 100μL을 우물에 넣습니다.
9. 접착제 커버로 플레이트를 덮고 실온에서 1-2 시간 동안 배양하십시오.
10. 인큐베이션에 이어 플레이트를 싱크대 위로 쓸어넘기고 1% Tween-20을 함유한 PBS로 플레이트를 세척합니다.

이차 항체를 가진 배양

11. 이 실험에서 효소-컨쥬게이드 이차 항체, 고추냉이 과옥시다제, HRP-컨쥬게이드 당나귀 항마우스 보조의 100 μL을 각 웰에 추가합니다.
12. 상온에서 1 시간 동안 접시를 배양하십시오.
13. 인큐베이션후, 접시를 싱크대 위로 쓸어 넘은 다음 1% Tween-20을 함유한 PBS로 플레이트를 세척합니다.

탐지

14. 각 우물에 1 mg/mL의 농도로 표시기 기판(3,3',5,5't'-테트라메틸벤지딘(TMB)의 100 μL을 추가합니다.
15. 상온에서 5-10 분 동안 기판으로 접시를 배양하십시오.
16. 10 분 후, 100 μL 2N 황산 (H₂SO_4)를추가하여 효소 반응을 중지하십시오.
    정지 용액을 추가한 지 30분 이내에 405nm의 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 플레이트를 읽고 우물의 흡광도를 결정합니다.

2. 샌드위치 엘리사

본 ELISA 버전에서, 실험용 샘플은 공주포항체와 공주 검출 항체 사이에 "끼여", 둘 다 동일한 단백질에 특이적이지만 상이한 에피토프에 특이적이다. 다음 샌드위치 ELISA 예에서, 인간 TNFα의 농도는 공지된 표준, 재조합 인간 TNFα(75 pg/mL의 농도에서 진술)의 2.5X 직렬 희석으로부터 생성된 표준 곡선을 사용하여 알 수 없는 시료로 결정되었다.

마이크로 플레이트에 항체를 포획하는 코팅

1. 96웰 ELISA 플레이트의 웰을 정제된 포획 항체로 코팅하여 100 μL의 포획 항체(1-10 μg/mL 범위)를 플레이트의 각 웰에 첨가합니다.
2. 접착제 플레이트 커버로 플레이트를 덮고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
3. 인큐베이션 후 플레이트를 싱크대 위로 쓸어가 서 플레이트에서 코팅 용액을 제거합니다.

블로킹

4. 200 μL 차단 용액, PBS를 함유하는 5% 무지방 건조 우유를 우물에 추가하여 항체 코팅 우물에서 남은 단백질 결합 부위를 차단합니다.
5. 실온에서 또는 4°C에서 하룻밤 동안 적어도 2 시간 동안 배양하십시오.
6. 인큐베이션에 이어, 플레이트를 가볍게 하여 블로킹 버퍼를 제거한 다음 1% Tween-20을 함유한 PBS로 플레이트를 세척합니다.

테스트 샘플을 포함하는 항원 추가

7. 테스트 샘플의 100 μL을 우물에 추가합니다. 접착제 덮개로 접시를 밀봉합니다.
8. 실온에서 1-2 시간 동안 또는 4 ° C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
9. 인큐베이션 후, 싱크대 위로 접시를 쓸어 넘은 다음 1% Tween-20을 포함하는 200 μL 1X PBS로 우물을 세척하여 샘플을 제거합니다.

효소-컨쥬게이드 검출 항체 추가

10. 미리 최적화된 농도로 100 μL의 효소 접합 검출 항체를 우물에 첨가합니다.
11. 접착제 덮개로 접시를 밀봉하고 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
12. 싱크대 위에 플레이트를 쓸어 넘음으로써 언바운드 검출 항체를 제거하고 1% Tween-20을 함유한 200 μL 1X PBS로 우물을 세척한다.

탐지

13. 1 mg/mL의 농도에서 지표 기판의 100 μL을 추가합니다. 모든 바운드 효소-공해 검출 항체는 기판을 검출 가능한 신호로 변환합니다.
14. 상온에서 5-10 분 동안 접시를 배양하십시오.
15. 5-10 분 후, 우물에 100 μL 2N H₂SO_4를 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 정지 용액을 추가한 지 30분 이내에 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 읽고 우물의 흡광도를 결정합니다.

3. 경쟁 ELISA

경쟁적인 ELISA의 단계는 간접 및 샌드위치 ELISA에 사용되는 것과 다르며, 주요 차이점은 샘플 항원과 "추가 기능"항원 사이의 경쟁 적 바인딩 단계입니다. 시료 항원들은 표지가 없는 1차 항체로 배양된다. 이러한 항체-항원 복합체는 동일한 항원으로 미리 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가된다. 잠복기 후에, 어떤 불바운드 항체든지 멀리 씻어내게 됩니다. 원래 시료에서 항원의 우물과 항원 양을 결합하는 데 사용할 수 있는 자유 항체의 양과 역상관관계가 있다. 예를 들어, 항원이 풍부한 샘플은 더 많은 항원 항체 복합체를 가지며, ELISA 플레이트에 결합하기 위해 거의 결합되지 않은 항체를 남겨 둡시다. 1차 항체에 특이적인 효소-컨쥬게이트 이차 항체는 이어서 우물에 첨가되고 기판이 뒤따릅니다.

마이크로 플레이트에 항원을 코팅

1. 정제된 항원의 100 μL로 96웰 ELISA 플레이트의 웰을 1-10 μg/mL 농도로 코팅합니다.
2. 접착제 플레이트 커버로 플레이트를 덮고 4°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다.
3. 인큐베이션에 따라 싱크대 위로 플레이트를 쓸어넘기면 우물에서 언바운드 항원 용액을 제거합니다.

블로킹

4. 코팅된 우물에서 나머지 단백질 결합 부위를 각 웰에 블로킹 버퍼 200 μL을 추가하여 PBS에서 5% 비지방 건조 우유 또는 BSA가 될 수 있습니다.
5. 플레이트를 실온에서 2시간 이상 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

1차 항체를 가진 배양 샘플(antigen)

6. 우물을 차단하는 동안, 분석에서 각각 의 150 μL 샘플 항원 및 1차 항체의 150 μL을 혼합하여 항원 항체 혼합물을 준비한다.
7. 이 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.

항원-항체 혼합물을 우물에 추가

8. 이제 싱크대 위로 플레이트를 가볍게 하여 우물에서 차단 버퍼를 제거합니다.
9. 그런 다음, Tween-20을 포함하는 1X PBS로 우물을 씻는다.
10. 시료 항원 항체 혼합물의 100 μL을 추가합니다.
11. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
12. 싱크대 위에 접시를 쓸어서 샘플 혼합물을 제거합니다.
13. 이어서, 1%의 Tween-20을 함유한 1X PBS로 우물을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한다.

이차 항체 추가

14. 이 경우 AP-컨쥬게이드 항체인 효소 컨쥬게이징 이차 항체의 100 μL을 각각 양호하게 넣습니다.
15. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
16. 인큐베이션에 이어 1%의 트위엔-20을 함유한 1X PBS로 플레이트를 세척한다.

탐지

17. 각 우물에 기판 용액의 100 μL을 추가합니다.
18. 5-10 분 기다립니다.
19. 10 분 후, 우물에 100 μL 2N 황산을 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 그런 다음 스톱 솔루션을 추가한 후 30분 이내에 마이크로 플레이트 판독기에서 흡광도를 측정합니다.

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 생물학적 시료에서 사이토카인 및 항체와 같은 분석물의 농도를 측정하는 데 일반적으로 사용되는 고감도 정량 분석법입니다. 이 분석의 일반적인 원리는 세 단계로 구성됩니다: 마이크로 플레이트에서 표적 분석물을 포착 또는 고정하는 것부터 시작하여 표적 특이적 검출 단백질에 의한 분석물 검출, 마지막으로 접합 효소가 기질을 착색된 산물로 전환하는 효소 반응. 다양한 캡처 및 탐지 방법에 따라 ELISA는 직접, 간접, 샌드위치 및 경쟁의 네 가지 유형이 될 수 있습니다.

직접 ELISA의 경우, 표적 항원이 먼저 플레이트에 결합된 다음 특정 검출 항체에 의해 검출됩니다. 이 방법은 일반적으로 특정 항원에 대한 항체를 스크리닝하는 데 사용됩니다. 간접 ELISA는 면역 반응을 정량화하기 위해 샘플에서 항체를 검출하는 데 사용됩니다. 플레이트는 먼저 표적 항체를 고정시키는 특정 포획 항원으로 코팅된 다음 두 번째 항체를 사용하여 이 항원-항체 복합체를 검출합니다.

샌드위치 ELISA의 경우, 표적 분석물은 항원이며, 포획 항체를 사용하여 플레이트에서 포획된 후 검출 항체에 의해 검출되어 항체-항원-항체 샌드위치를 형성합니다. 이 방법은 혼합 샘플에서 항원의 농도를 측정하는 데 유용합니다.

Competitive ELISA는 관심 대상 항원에 대해 하나의 항체만 사용할 수 있는 경우에 사용됩니다. 플레이트는 먼저 정제된 항원으로 코팅됩니다. 한편, 항원을 포함하는 샘플은 항체와 함께 사전 배양된 다음 플레이트에 첨가되어 자유 항체 분자가 고정된 항원에 결합할 수 있도록 합니다. 플레이트의 신호가 높을수록 샘플의 항원 농도가 낮아집니다. ELISA의 4가지 유형(직접, 간접, 샌드위치 및 경쟁) 모두에서 검출 항체는 효소에 직접 접합되거나 다른 항체 또는 단백질을 통해 간접적으로 연결될 수 있습니다.

반응에 일반적으로 사용되는 효소는 각각의 기질을 가진 양고추냉이 과산화효소 또는 알칼리성 인산가수분해효소이며, 둘 다 플레이트 리더를 사용하여 측정 및 정량화할 수 있는 용해성 착색 생성물을 생성합니다. 이 동영상에서는 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA 및 경쟁 ELISA를 수행하는 방법을 관찰한 후 간접 및 샌드위치 ELISA 분석법에서 표적 분석물을 정량화하는 예를 살펴봅니다.

첫 번째 실험은 간접 ELISA를 사용하여 인플루엔자에 감염된 마우스에서 얻은 혈청에서 항인플루엔자 바이러스 항체의 존재를 결정하는 방법을 보여줍니다.

먼저 50마이크로리터의 정제된 항원(이 경우 정제된 A/PR/8 인플루엔자 A 바이러스 1밀리리터당 2mg)을 96웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 다음으로, 플레이트를 접착 커버로 덮고 항원이 플레이트에 결합할 수 있도록 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 싱크대 위에서 플레이트를 튕겨 코팅 용액을 제거합니다. 다음으로, 각 웰에 200마이크로리터의 차단 완충액(여기서는 1X PBS의 5% 당나귀 혈청)을 추가하여 코팅된 웰의 나머지 단백질 결합 부위를 차단합니다. 접시를 실온에서 최소 2시간 동안 배양하도록 두십시오. 배양 후 블로킹 버퍼를 제거한 다음 1% Tween-20이 포함된 1X PBS 200마이크로리터를 추가하여 플레이트를 세척합니다. 접시를 싱크대 위로 한 번 더 두드려 세탁물을 제거합니다.

그런 다음 새 튜브에 460마이크로리터의 PBS를 첨가한 다음 40마이크로리터의 혈청을 추가하여 1-12.5 희석하여 테스트 샘플을 준비합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 PBS를 두 번째 튜브에 추가한 다음 100마이크로리터의 첫 번째 희석액을 추가합니다. 희석액이 1 - 204,800인 최종 샘플을 얻을 때까지 이 연속 희석 범위를 계속합니다. 연속으로 희석된 혈청 샘플을 웰에 3회씩 추가합니다. 접시를 접착 덮개로 덮고 실온에서 한 시간 동안 배양합니다. 다음으로, 플레이트를 싱크대에 튕겨 샘플을 제거한 다음 1% Tween-20이 포함된 1X PBS 200마이크로리터를 추가하여 플레이트를 세척합니다. 다시 한 번 접시를 튕겨 세척물을 제거합니다.

이제 이 실험에서 양고추냉이 과산화효소(HRP, conjugated donkey anti-mouse secondary)인 효소 접합 2차 항체 100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양하고 플레이트를 튕겨 여분의 액체를 제거합니다. 1% Tween-20이 포함된 1X PBS로 플레이트를 세척한 다음 각 웰에 밀리리터당 1밀리그램의 농도로 지시 기질 100마이크로리터를 도포합니다. 실온에서 5-10분 동안 플레이트를 기판과 함께 배양합니다. 이 예에서 무색 3,3', 5,5' - 테트라메틸벤지딘 또는 TMB 기질은 HRP가 존재할 때 파란색으로 변합니다. 10분 후 100마이크로리터의 2N 황산을 첨가하여 효소 반응을 중지합니다. 샘플이 노란색으로 변합니다.

stop solution을 첨가한 후 30분 이내에 플레이트를 microplate reader에 삽입하고 기판에 적합한 파장에서 plate를 판독하여 well의 흡광도를 측정합니다.

샌드위치 ELISA를 시작하려면 플레이트에 정제된 포획 항체를 코팅해야 합니다. 이를 위해 밀리리터당 1-10마이크로그램 범위의 농도로 포획 항체 100마이크로리터를 96웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 다음으로, 접착 플레이트 커버로 플레이트를 덮은 다음 섭씨 4도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 배양 후 싱크대 위에서 플레이트를 튕겨 코팅 용액을 제거합니다.

이제 200마이크로리터의 5% 무지방 분유를 우물에 첨가하여 코팅된 우물에 남아 있는 단백질 결합 부위를 차단합니다. 플레이트를 실온에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 블로킹 버퍼를 제거한 다음 1% Tween-20을 함유한 1X PBS로 웰을 세척합니다. 싱크대 위의 접시를 튕겨 세탁물을 제거하십시오. 이제 100마이크로리터의 테스트 샘플을 웰에 추가하고 접착 덮개로 플레이트를 밀봉한 다음 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 싱크대 위의 플레이트를 튕겨 샘플을 제거한 다음 1% Tween-20이 포함된 1X PBS 200마이크로리터로 웰을 세척합니다. 싱크대 위의 플레이트를 튕겨 세척물을 제거한 다음 100마이크로리터의 효소 접합 검출 항체를 웰에 추가합니다.

접착 덮개로 플레이트를 밀봉하십시오. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 싱크대 위에서 플레이트를 튕겨 결합되지 않은 검출 항체를 제거하고 1% Tween-20이 포함된 1X PBS 200마이크로리터로 웰을 세척합니다. 다음으로, 100 밀리리터 당 1 밀리그램의 농도로 지시 기질 1 마이크로리터를 첨가하고 실온에서 5-10 분 동안 플레이트를 배양합니다. 10분 후, 웰에 100마이크로리터의 2N 황산을 첨가하여 효소 반응을 중단한 다음 마이크로플레이트 리더에 정지 용액을 추가한 후 30분 이내에 플레이트를 판독합니다.

경쟁력 있는 ELISA를 수행하려면 먼저 96웰 ELISA 플레이트의 웰에 100마이크로리터의 정제된 항원을 밀리리터당 1-10마이크로그램의 농도로 코팅합니다. 접착 플레이트 커버로 플레이트를 덮은 다음 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 싱크대 위에서 플레이트를 튕겨 웰에서 결합되지 않은 항원 용액을 제거합니다.

다음으로, 각 웰에 200마이크로리터의 차단 완충액을 첨가하여 코팅된 웰의 나머지 단백질 결합 부위를 차단합니다(여기서는 PBS의 5% 무지방 분유). 실온에서 최소 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 웰을 막으면서 항원-항체 혼합물을 1로 준비합니다. 분석의 각 웰에 대해 150마이크로리터의 1차 항체에 150마이크로리터의 샘플 항원을 추가하여 5밀리리터 튜브. 이 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 이제 싱크대 위로 플레이트를 튕겨 우물에서 차단 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 Tween 20을 함유한 1X PBS로 웰을 세척한 다음 샘플 항원-1차 항체 혼합물 100마이크로리터를 추가합니다.

접시를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하도록 둡니다. 다음으로, 싱크대 위에서 플레이트를 튕겨 샘플 혼합물을 제거한 다음 1% Tween-20이 포함된 1X PBS로 웰을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 효소 접합 2차 항체를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 1% Tween-20이 포함된 1X PBS로 플레이트를 세척한 다음 각 웰에 100마이크로리터의 기판 용액을 추가합니다. 5-10분 동안 기다립니다. 10분 후 100마이크로리터의 2N 황산을 첨가하여 효소 반응을 중단한 다음 정지 용액을 첨가한 후 30분 이내에 마이크로플레이트 리더에서 흡광도를 측정합니다.

반정량적 간접 ELISA 분석의 경우, 인플루엔자 A에 감염된 마우스의 혈청 샘플에서 연속적으로 희석된 샘플에서 인플루엔자 A 바이러스 항체의 존재를 플레이트 리더에서 405나노미터에서 각 웰의 흡광도를 판독하여 측정했습니다. 이 원시 데이터는 계산을 위해 스프레드 시트로 내보내집니다. 이 실험에서는 1 - 12.5에서 1 - 204,800 범위의 연속으로 희석된 혈청 샘플을 3회씩 반복했습니다.

따라서 데이터를 분석하기 위해 평균 흡광도 값은 각 희석에 대한 모든 값을 더하고 합계를 3으로 나누어 각 삼중 세트에 대해 계산됩니다. 각 삼중석 세트에 대한 평균이 결정되면 평균 OD450 판독값이 직렬 희석액에 대해 표시됩니다. OD 판독값은 혈청이 희석됨에 따라 감소하며, 이는 더 희석된 샘플에서 더 적은 항체가 발견됨을 나타냅니다. 정량 샌드위치 ELISA에서, 알려진 표준물질의 희석액(이 경우 Human TNFalpha를 재조합)을 96웰 플레이트에 첨가하고 미지의 샘플과 함께 판독했습니다.

표준 곡선을 만들기 위해 알려진 농도의 각 판독값 세트에 대한 평균 흡광도 값이 계산되었습니다. 그런 다음, 평균 흡광도 값을 x축의 알려진 단백질 농도에 대해 y축에 표시했습니다. 최적 맞춤 곡선은 그래프의 점을 통해 추가됩니다.

표준 곡선이 생성되면 테스트 샘플의 평균 흡광도 값을 먼저 계산하여 테스트 샘플의 TNFalpha 단백질의 양을 결정할 수 있습니다. 이 예에서 테스트 샘플은 OD450 판독값이 0.636과 0이었습니다. 681. 이 값을 더하고 합계를 2로 나누면 평균 0.659가 됩니다. 표준 곡선 그래프의 y축에서 이 흡광도 값에서 표준 곡선까지 수평선을 연장합니다. 교차점에서 수직선을 x축으로 연장하고 이 테스트 샘플에서 밀리리터당 38.72피코그램의 TNFalpha 농도에 해당하는 해당 농도를 읽습니다.