5.4: ELISPOT 분석: IFN-γ 분비 비장세포 검출

1. 셋업

버퍼 및 시약

1. 칼슘이나 마그네슘이 없는 멸균 인산염 완충식염(PBS)
2. 코팅 버퍼- 멸균 PBS 또는 탄산완충제
3. PBS의 분석 희석제- 10% 태아 소 혈청 (FBS)
4. 세포 배양 배지-RPMI 1640 와 10% FBS, 페니실린/연쇄 절제술, 및 L-글루타민
5. 워시 버퍼- PBS 포함 0.05% Tween20
6. 이중 증류수(ddH₂O)
7. 검출 기판- 100 mg AEC (3-아미노-9-에틸 카르바졸) 10 mL DMF (N,N, 디메틸포르미드).

설비

8. 라미나르 플로우 후드
9. 가습 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO_2로설정)
10. 자동 ELISPOT 리더 또는 해부 현미경

자료

11. 엘리스팟 플레이트
12. 멸균 및 비멸 저수지
13. 파이프토르 와 팁
14. 멸균 세로지컬 파이펫
15. 멸균, 원식 폴리 프로필렌 튜브
16. 플레이트 세척을 위한 스퀴즈 병 2개

분석 특정 시약

17. 세포-1차 세포 또는 세포주(여기, C57BL/6 마우스로부터 의 비장구가 사용됨)
18. 각성제-미토겐 또는 항원(여기, phorbol 12-myristate 13-아세테이트(PMA, 50 ng/mL) 및 이오노마이신(1 μM)이 사용되었습니다.
19. 1차 항체-생체분해된 항세포카인 검출 항체(분석 희석제에서 2 μg/mL로 희석)
20. 이차 항체- 연쇄상구당-고추냉이 과산화제 (SAv-HRP)

2. 절차

코팅

1. 조건멸 및 라미나르 유동 후드 내부에 보관하고, 정제된 항 사이토카인 포획 항체를 멸균 코팅 버퍼에서 0.5-4.0 μg/mL의 최종 농도로 희석한다. (참고: IFN-γ 및 IL-6의 경우 5 μg/mL을 사용합니다.)
2. 캡처 항체 용액, 100 μL/웰, ELISPOT 플레이트로 전송합니다.
3. 플레이트 커버로 접시를 덮고 밀봉하여 증발을 방지합니다.
4. 접시를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

블로킹

5. 다음 날, 라미나르 플로우 후드에 ELISPOT 플레이트를 발견합니다. 플레이트를 멸균 물티슈에 빠르게 반전하여 각 우물에서 캡처 항체 용액을 제거합니다.
6. 그런 다음 각 웰에 세포 배양 배지의 200 μL을 추가합니다. 이 단계는 분석 중에 비특이적 바인딩을 차단합니다.
7. 플레이트 커버를 교체하고 37°C에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.

도금 및 활성화 셀

8. 플레이트가 배양하는 동안 세포 배양 배지에서 50 ng/mL PMA 및 1 μM 이오노마이신을 함유한 2X 미토겐 용액을 준비한다.
9. 이어서, 표적 세포 현탁액을 2 x 10⁶ 셀/mL의 육수 농도로 준비한다.
10. 인큐베이션이 완료된 후, 라미나르 플로우 후드 내부의 멸균 물티슈에 플레이트를 빠르게 반전시켜 각 우물에서 세포 배양 배지를 제거한다.
11. 다음으로, 스톡 셀 서스펜션 용액의 2X 직렬 희석을 생성한다. 이렇게 하려면 먼저 준비된 셀룰러 서스펜션 스톡 용액의 200 μL을 ELISPOT 플레이트의 맨 위 줄의 우물에 넣습니다.
12. 그런 다음, 세포 스톡 용액을 포함하는 행 아래 플레이트의 다음 5행에 일반 세포 배양 배지 100 μL을 추가한다.
13. 그 후, 맨 위 행에서 바로 아래 행으로 셀룰러 서스펜션의 100 μL을 파이프하여 2X 직렬 희석을 수행합니다. 이 솔루션을 위아래로 부드럽게 파이프하여 세포를 분포할 수 있도록 적절한 혼합을 보장합니다.
14. 나머지 네 행에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
15. 문화 매체만으로 여섯 번째 행을 둡니다. 그것은 실험 적인 제어 역할을 할 것입니다.
16. 다음으로, 준비된 미토겐 용액의 100μL을 플레이트의 처음 5열의 실험적 우물에 추가한다. 대조군 우물과 여섯 번째 행에서 미토겐없이 세포 배양 배지의 100 μL을 추가합니다.
17. 플레이트 커버를 교체하고 플레이트를 37°C로 교체하고, 인큐베이터에서 5% CO_2를 20-48시간 동안 교체합니다. (참고: 20-24시간은 일반적으로 IL-2 및 TNF-α 검출하기에 충분하지만 IL-4 및 IFN-γ 48시간이 최적입니다.

탐지

1차 항체

18. 분석 희석제에서 2 μg/mL의 농도로 항체를 검출하는 생체 개화 된 항 사이토카인을 준비합니다.
19. PBS에서 0.05% Tween-20을 혼합하여 이 시점에서 20-25mL의 워시 버퍼를 준비하십시오.
20. 인큐베이션이 완료되면 접시를 풀고 싱크대에 빠르게 반전하여 우물에서 모든 액체를 제거합니다. (참고:이 시점 이후에는 플레이트를 더 이상 멸균 상태로 보관할 필요가 없습니다).
21. 그런 다음 각 웰에 ~200 μL 세척 버퍼를 추가하여 접시를 씻으시고 씻어 주세요. 이 액체를 재빨리 반전시키고 싱크대 위로 판을 쓸어 넘깁니다. 총 5개의 세시에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
22. 다음으로, 각 웰에 항체 용액을 검출하는 희석된 바이오티니징 항 세포카인의 100 μL을 추가한다. 실온에서 2시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

이차 항체

23. 인큐베이션이 완료된 후 싱크대 위로 플레이트를 반전시키고 쓸어 넘기면 검출 항체를 추방합니다.
24. 이전과 마찬가지로, ~ 200 μL 세척 버퍼로 접시를 5 번 세척하여 각 세척 사이에 액체를 배출하십시오.
25. 다음으로 각 우물에 희석 된 스트렙타비딘 고추냉이 과로시다제 용액 100 μL을 추가합니다 (분석 희석제에서 미리 결정된 최적의 농도로 희석).
26. 플레이트 커버를 교체하고 37°C에서 1.5-2시간 동안 실온에서 배양합니다.

기판

27. 인큐베이션 후, 사용하기 15분 전에 제조업체의 지침에 따라 AEC 기판 용액을 먼저 활성화합니다.
28. 다음으로, 우물의 내용물들을 버리고 이전과 마찬가지로 워시 버퍼로 접시를 5번 씻는다.
29. 그런 다음 준비된 AEC 기판 용액 100 μL을 각 웰에 즉시 추가합니다.
30. 스팟 개발을 모니터링하면서 - 10-20 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오.
31. 접시를 물로 헹구고 접시를 싱크대 위로 쓸어 넘기면 반응을 멈춥시다.
32. 종이 타월에 접시를 부수고 접시가 밤새 또는 완전히 건조 될 때까지 공기 건조할 수 있도록합니다. 접시 아래에 플라스틱 트레이를 제거하면 건조가 용이합니다.

3. 데이터 수집 및 분석

1. 건조 후, 반점은 자동화 된 플레이트 리더로 계산 할 준비가되어 있습니다. 여기서 CTL Immunospot 판독기가 사용되지만 이 프로토콜은 모든 판독기에게 적용될 수 있습니다.
2. 먼저 계측기를 켜고 컴퓨터를 켭니다. 그런 다음 CTL 프로그램을 열고 "스캔 수"를 클릭합니다.
3. 트레이가 기기에서 확장하려면 "배출"을 푸시합니다. 그런 다음, 플라스틱 어댑터를 제거하고 ELISPOT 플레이트 및 어댑터에 행 "A"를 정렬합니다.
4. 파일을 저장할 파일 이름과 위치를 선택하고 접시를 트레이에 로드합니다.
5. 그런 다음 소프트웨어의 "로드"를 클릭하고 컴퓨터 측면의 문을 닫습니다.
6. "계산 후 시작"을 누릅니다. 파일이 저장되었는지 확인하고 품질 관리 "QC" 소프트웨어를 열어 데이터를 분석하고 반점 수를 계산합니다.

노트:

1. 최소 셀 수는 예비 실험에서 결정되어야 합니다. 최적의 반점 수는 ~50/well입니다. 너무 많은 세포가 로드되면 뚜렷한 반점을 감지하기가 어려울 것입니다. 추가적으로, 세포는 중첩되고 막에 단층을 형성하지 않을 수 있습니다, 따라서 검출의 수준이 감소될 수 있습니다.
2. 실험을 최적화할 때, 표적 단백질의 예상 발현 수준을 고려한다. 발현이 낮을수록 웰당 필요한 셀 수가 높아집니다.
3. ELISA와 는 달리 플레이트 세탁기를 사용하기보다는 접시를 손으로 씻는 것이 좋습니다. ELISPOT 플레이트는 더 섬세하며 PVDF 멤브레인에 구멍을 뚫는 것을 피해야합니다.
4. 하나는 얼룩을 일으킬 수 있으므로 잠복 기 동안 플레이트의 움직임을 제한해야합니다.
5. 직접 광에 노출되면 반점이 사라지기 때문에 플레이트는 어둠 속에서 저장되어야 합니다.

효소 결합 면역스폿(ELISPOT) 분석법은 병원체나 세포 손상에 대한 면역 반응을 분석하는 방법입니다. 이를 통해 다양한 면역 세포가 분비하는 특정 단백질을 검출하여 면역 세포의 활성화를 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, ELISPOT은 분비된 사이토카인을 검출하여 외부 항원에 노출되었을 때 T 세포 반응을 측정하는 데 일반적으로 사용됩니다.

사이토카인 기반 ELISPOT 분석의 경우, 공정은 표적 사이토카인에 특이적인 포획 항체로 ELISPOT 마이크로플레이트를 코팅하는 것으로 시작됩니다. 항체 코팅 후, T 세포는 웰에 추가되고 예를 들어 항 CD3 항체와 같은 외부 물질에 의해 자극됩니다. 그런 다음 세포는 표적 사이토카인을 분비하며, 이 사이토카인은 포획 항체에 의해 즉시 고정됩니다. 단백질은 희석이나 분해 없이 살아있는 세포에서 분비된 후 즉시 캡처되기 때문에 이 분석은 정확도가 높습니다. 표적 사이토카인이 고정된 후 검출 항체가 추가되며, 이 항체는 포획된 사이토카인에도 결합합니다.

ELISPOT 기법은 또한 특정 항체 생성을 분석하여 감염 또는 백신 접종 후 기억 B 세포를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 항체 기반 ELISPOT에서는 항원이 플레이트에 결합되는 포획 단계 또는 항원이 포획 후 표적 항체를 검출하는 검출 단계에서 항체 대신 특정 항원이 사용됩니다. 공정의 모든 변형에서, T 세포 또는 B 세포의 경우, 검출 항체 또는 항원은 비오틴화되어 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)와 같은 스트렙타비딘 접합 검출 효소에 결합할 수 있습니다. 그런 다음 과산화효소의 기질인 AEC를 첨가하면 어둡고 불용성 침전물이 생성됩니다. 이 침전물은 포획된 단백질의 위치를 표시하며, 각 분비 세포는 ELISPOT 리더 또는 현미경을 사용하여 정량화할 수 있는 가시적인 반점을 생성합니다. 반점의 크기는 각 세포에서 분비되는 단백질의 양에 대한 상대적 추정치입니다. 이 분석은 분비 세포의 상대적으로 작은 하위 집단에서도 단일 세포의 면역 반응을 감지할 수 있으므로 세포 수준에서 면역 반응을 연구하는 데 유용합니다.

이 동영상에서는 ELISPOT 분석을 수행한 다음 분비 세포를 나타내는 반점을 정량화하는 방법을 배웁니다.

실험 전반에 걸쳐 층류 후드에서 작업하고 장갑을 착용하여 멸균 상태를 확인합니다.

이 프로토콜의 모든 계산은 96웰 플레이트 1개에 필요한 부피를 기반으로 합니다.

먼저 항사이토카인 포획 항체를 희석합니다. 이렇게 하려면 10ml의 버퍼를 멸균된 15ml 원추형 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 단클론 항체 1밀리리터를 버퍼에 추가하여 최종 농도가 밀리리터당 1마이크로그램인 용액을 생성합니다. 다음으로, 포획 항체 용액을 멸균 저장소에 붓고 멀티채널 피펫을 사용하여 100마이크로리터를 96웰 ELISPOT 플레이트의 각 웰에 분배합니다.

접시를 접시 덮개로 덮고 증발을 방지하기 위해 밀봉한 다음 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 층류 후드에서 ELISPOT 플레이트를 엽니다. 플레이트를 멸균 물티슈에 빠르게 뒤집어 각 웰에서 포획 항체 용액을 제거합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 200마이크로리터의 세포 배양 배지를 추가합니다. 이 단계는 분석 중 비특이적 결합을 차단합니다. 플레이트 커버를 교체하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다.

플레이트가 배양되는 동안 10ml의 세포 배양 배지에 1마이크로리터의 PMA와 20마이크로리터의 이오노마이신을 추가하여 2X 미토겐 용액을 준비하여 PMA 밀리리터당 15나노그램과 1마이크로몰 이오노마이신의 최종 농도를 달성합니다.

마우스 비장 세포의 세포 현탁액도 이 시기에 멸균 후드에서 준비해야 합니다. 현미경과 혈구계를 사용하여 세포의 농도를 측정하고 밀리리터당 200만 개의 세포 농도에 도달할 때까지 총 부피를 조정합니다.

배양이 완료된 후 플레이트를 멸균 물티슈에 빠르게 뒤집어 각 웰에서 세포 배양 배지를 제거합니다. 다음으로, 준비된 세포 현탁액 원액 200마이크로리터를 ELISPOT 플레이트의 맨 윗줄에 있는 웰에 추가합니다. 실험을 삼중으로 설정하여 테스트된 각 세포 유형이 3개의 그룹화된 열 세트에 도금되도록 합니다. 이 아래에, 100마이크로리터의 일반 세포 배양 배지를 세포 스톡 용액이 포함된 행 아래의 플레이트의 다음 5개 열에 추가합니다.

다음으로, 맨 위 줄에서 바로 아래 줄로 100마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫팅하고 용액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 고르게 분포시켜 연속 희석을 수행합니다. 나머지 행에 대해 이 프로세스를 반복하여 각 단계에서 이전 행에서 아래 행으로 100마이크로리터를 이동하고 다섯 번째 행이 연속으로 희석될 때까지 계속합니다. 여섯 번째 줄은 대조군 역할을 하기 위해 세포 배양 배지만 있는 상태로 둡니다. 플레이트의 실험용 웰에 있는 세포를 자극하기 위해 1열에서 5열까지의 각 웰에 있는 세포 현탁액에 준비된 미토겐 용액 100마이크로리터를 추가합니다. 컨트롤 역할을 할 여섯 번째 줄은 자극을 받지 않고 그대로 두십시오. 뚜껑을 닫고 플레이트를 섭씨 37도, CO2 5%에서 24-48시간 동안 배양합니다.

희석된 비오틴화 항사이토카인 검출 항체를 준비합니다. 먼저 PBS 45ml에 10% 소 태아 혈청 5ml를 첨가하여 50ml의 분석 희석제를 준비합니다. 다음으로, 검출 항체를 분석 희석제에서 밀리리터당 2마이크로그램의 농도로 희석합니다. 또한 이때 .05% Tween-20과 PBS를 혼합하여 20-25ml의 세척 버퍼를 준비하십시오.

배양이 완료된 후 플레이트의 뚜껑을 풀고 빠르게 뒤집어 웰에서 모든 액체를 제거합니다. 각 웰에 약 200마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하여 플레이트를 세척합니다. 싱크대 위에서 접시를 빠르게 뒤집고 튕겨 이 액체를 배출하십시오. 이 과정을 네 번 더 반복하여 총 다섯 번 세탁합니다. 다음으로, 각 웰에 희석된 검출 항체 용액 100마이크로리터를 추가하고 뚜껑을 교체한 후 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후, 싱크대 위에서 플레이트를 뒤집고 튕겨 플레이트의 웰에서 검출 항체 용액을 배출합니다.

이전과 마찬가지로 세척 버퍼로 플레이트를 5회 세척하고 각 세척 사이에 액체를 배출합니다. 최종 세척 후 streptavidin- horseradish peroxidase 용액을 제조업체의 지침에 따라 희석하여 준비합니다. 다음으로, 플레이트의 웰이 비어있는 상태에서 각 웰에 희석 된 streptavidin- horseradish peroxidase 용액 100 마이크로 리터를 추가합니다. 뚜껑을 다시 접시에 놓고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

배양 후 사용 15분 이내에 미리 만들어진 AEC 기판 용액을 활성화하십시오. 우물의 내용물을 버리고 이전과 같이 세척 버퍼로 플레이트를 다섯 번 씻습니다. 그런 다음 준비된 AEC 기판 용액 100마이크로리터를 각 웰에 즉시 추가합니다. 플레이트를 실온에 두어 약 10-20분 동안 현상하면서 스팟 발달을 모니터링합니다. 이 반점은 우물 표면에 작고 어두운 원으로 나타납니다. 그런 다음 접시를 물로 헹구고 싱크대 위로 튕겨 반응을 멈춥니다. 종이 타월로 접시를 닦고 밤새 또는 완전히 마를 때까지 자연 건조시킵니다. 접시 아래의 플라스틱 트레이를 제거하면 건조가 용이합니다. 건조 후에는 자동 플레이트 리더로 얼룩을 계수할 준비가 됩니다.

여기서는 CTL ImmunoSpot 리더가 사용되지만 이 프로토콜은 모든 리더에 적용할 수 있습니다. 그런 다음 CTL 프로그램을 열고 스캔 수를 클릭합니다. 트레이가 기기에서 확장되도록 배출을 누릅니다. 그런 다음 플라스틱 어댑터를 제거하고 ELISPOT 플레이트와 어댑터의 A 행을 정렬합니다. 저장할 파일의 파일 이름과 위치를 선택하고 플레이트와 어댑터를 트레이에 로드합니다. 소프트웨어에서 로드를 클릭하고 기계 측면의 도어를 닫습니다. 그런 다음 계산 후 시작을 누릅니다. 파일이 저장되었는지 확인한 다음 품질 관리 QC 소프트웨어를 열어 데이터를 분석하고 스폿 수를 계산합니다. 이 데이터를 Excel 파일로 내보냅니다. 분석이 완료되면 Eject(취출)를 클릭하여 플레이트를 검색합니다.

이 실험에서는 야생형 및 종양이 있는 마우스의 세포를 도금하고 IFN 감마를 분석했습니다. 세포 농도가 감소함에 따라 반점의 수가 감소한다는 것을 주목하십시오. 일반적으로 ELISPOT 데이터는 플레이팅된 셀 수당 스폿 수로 표시됩니다. 이 예에서는 스폿 수가 막대 그래프에 표시되었으며 각 세포 농도는 x축에 나열되었습니다. spot of the number of spots는 주어진 집단에서 총 세포 수당 활성화된 세포의 수를 나타냅니다.