공 초점 형광 현미경: 쥐 섬유 아세포에서 단백질의 국소화를 결정하는 기술

1. 재료

버퍼

1. 세척 버퍼: 칼슘이나 마그네슘이 없는 멸균 인산염 완충식식염(PBS) 1X
2. 고정 버퍼: PBS의 1% 파라포름알데히드
3. 침투 버퍼: PBS에서 0.1% 트리톤 X-100
4. 블로킹 버퍼: PBS의 소 세럼 알부민 1%
5. 세포 성장 배지: DMEM10% 태아 소 혈청으로 보충 (FBS), 페니실린 /연쇄 절제술, 그리고 L-글루타민

설비

6. 라미나르 플로우 후드
7. 가습 인큐베이터 (37°C, 5% CO₂₎
8. 공초점 레이저 스캐닝 현미경; 여기, 니콘 이클립스 Ti 레이저

재료 및 시약

9. 챔버 세포 배양 슬라이드
10. DAPI를 장착한 페이드 방지 마운팅 미디어(핵 염색용)
11. 현미경 커버 유리
12. 섬세한 작업 와이프
13. 파이프토르 와 팁

분석 특정 시약

14. 부착 세포 (1 차 세포 또는 세포주); 여기서, CD1d로 감염된 마우스 섬유아세포가 사용되었다(LCD1).
15. 세포 표적을 검출하는 1차 항체; 여기서, 쥐 안티마우스 CD107a(LAMP-1) 및 마우스 항마우스 CD1d가 사용되었다.
16. 1차 항체 동포형에 특이적인 플루오로포레-컨쥬게이드 이차 항체; 여기서 항쥐 IgG는 알렉사플루어(488)와 알렉사플루어(647)에 공주된 항마우스 IgG를 사용하였습니다.

2. 프로토콜

항체 염색 준비

파종 셀

1. 성장 미디어에 대한 관심의 세포를 다시 중단합니다.
2. 그런 다음, 4웰 챔버 슬라이드의 우물에 셀 서스펜션/잘 당 500 μL을 시드한다. (여기서, LCD1 세포는 성장 매체의 500 μL에서 2.5x10⁵ 셀/챔버에서 종자하였다. 종자 밀도는 세포주 마다 다를 수 있습니다).
3. 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 동안 챔버 슬라이드를 배양하여 세포가 유리에 부착할 수 있도록 합니다.
4. 다음 날, 각 우물에서 미디어를 흡인한 다음 500 μL PBS로 셀 1X를 세척합니다.

고정

5. 세포를 고치려면 각 우물에 500 μL 1 % 파라포름알데히드 용액을 추가하고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.
6. 인큐베이션 후 파라포름알데히드를 적절한 유해 액체 폐기물 용기에 수거하십시오.
7. 그런 다음 500 μL PBS로 세포를 3번 세척하여 고정물의 잔재를 제거합니다.

투과성

8. 실온에서 15분 동안 500 μL permeabilization 버퍼/웰으로 배양하여 세포를 침투합니다.
9. 그런 다음 PBS의 500 μL로 세포를 3번 짧게 세척합니다.

블로킹

10. 4°C에서 1시간 동안 500 μL 차단 버퍼로 각 우물의 세포를 배양하여 비특이적 항체 결합을 차단합니다.

1차 항체 배양

11. 슬라이드 챔버에서 차단 버퍼를 흡인합니다.
12. 그런 다음 희석된 1차 항체 용액의 500 μL을 세포에 추가합니다. (여기서, 안티 CD107a(LAMP-1)는 1:500을 희석하고 안티 CD1d가 희석되지 않은(1H6 단클론 항체는 랜디 브루츠키에비츠 박사가 친절하게 제공하였다)를 희석하였다.
13. 슬라이드를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

참고: 둘 이상의 표적을 조사하는 경우 1차 항체가 다른 동종타입인지 확인하십시오. 권장된 항체 농도는 제조자 마다 다르며 사용하기 전에 적정해야합니다.

이차 항체 배양

14. 우물에서 1 차적인 항체 용액을 흡인합니다.
15. 500 μL PBS로 우물 챔버를 4 번 세척하십시오.
16. 그런 다음 희석된 이차 항체 용액의 500 μL을 각각 양으로 첨가합니다. (여기서, 이차 항체-항마우스 IgG 알렉사플루어(647)와 안티래트 IgG 알렉사플루어(488)는 차단 완충제에서 1:2000을 희석하였다.)
17. 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 배양하십시오.
18. 인큐베이션 후, 이차 항체 용액을 흡인한다.
19. 500 μL PBS로 챔버를 4번 세척하여 결합되지 않은 이차 항체를 제거합니다.

참고: 권장된 항체 농도는 제조자마다 다르며 사용하기 전에 적정해야 합니다. 두 개 이상의 표적을 조사하는 경우, 이차 항체는 고유한 여기/방출 스펙트럼을 가진 다른 형광에 공인되어야 합니다. 또한 형광을 선택하는 동안 핵 카운터스테인 (즉 DAPI)의 흥분 / 방출을 명심하십시오. 플루오로포어 선택은 사용되는 공초점 현미경의 레이저 구성에 의해 영향을 받을 수 있다. 기계의 레이저 구성은 실험에 적합한 형광을 지시합니다.

3. 장착 커버스립

1. 먼저 슬라이드에서 챔버를 조심스럽게 제거합니다.
2. 그런 다음 슬라이드를 섬세한 작업 닦아 에 비스듬히 잡고 셀을 건드리지 않고 가장자리에서 유체를 제거합니다.
3. 핵 얼룩 DAPI를 포함하는 안티페이드 마운팅 배지 1방울을 세포의 각 섹션에 추가합니다.
4. 다음으로, 손끝을 사용하여 가장자리를 눌러 슬라이드 위에 20mm x 60mm 커버슬립을 놓습니다. (화상 진찰을 방해하기 때문에 세포 에 걸쳐 거품 형성을 피하십시오).
5. 섬세한 작업 닦아 측면에 여분의 장착 매체를 닦아 일주일까지 실온에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장합니다.

4. 공초점 이미징

공초점 레이저 스캐닝 현미경의 이미지 샘플. 그림 2에 표시된 데이터의 경우 Nikon Eclipse Ti A1R은 NIS 요소 고급 연구 소프트웨어와 함께 사용되었습니다. 다음 섹션에서는 앞서 언급한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처하는 절차에 대해 자세히 설명합니다.

1. 세포 이미징을 시작하려면'국정원 소프트웨어 아이콘'을클릭하여'국정원 요소 고급 연구 소프트웨어'를엽니다.
2. 다음으로 컨트롤 창에서'TiPad'탭을 클릭하고 이미징에 원하는 목표를 선택합니다. (여기, 처음 40 배 목표가 사용 되었습니다.).
3. 슬라이드를 셀과 함께 스테이지에 로드하고 렌즈 아래에 중앙을 가두십시오.
4. 이제'A1plus Compact GUI'탭에서 사용되는 형광에 적합한 레이저를 설정합니다. 기어 기호를 클릭하여 염료 및 스펙트럼 설정 메뉴를 열고 필요한 채널을 선택하고 각 채널에 대한 레이저를 설정합니다.
5. 그런 다음 첫 번째 이진 미러 아래의 드롭다운 메뉴에서 적절한 배출을 선택합니다.
6. 다음으로,'A1plus Compact GUI'창을 클릭하면'Ch.시리즈'를클릭하여 사용된 레이저가 동시에 또는 순차적으로 샘플에 발사할지 여부를 설정하는 라인 채널 시리즈를 설정합니다. (여기서는 채널 1부터 시작하여 채널 2, 다음 4로 순차 패스를 선택했습니다.)
7. 그런 다음 상단에있는'화살표 팁'아이콘을 클릭하여 스캔을 시작합니다. 이 시점에서 이미징이 살아있는 동안 'A1plus Compact GUI'창에서 슬라이딩 스케일을 클릭하고 핀홀 크기를 수정하여 초점 표시등에서 제한을 보장합니다. (여기서 사용 가능한 가장 낮은 설정(0.5)이 사용되었습니다.
8. 다음으로, 슬라이딩 스케일을 사용하여 잠재적인 배경 염색을 제한하면서 특정 염색을 감지할 수 있도록 하여 각 레이저 의'고전압'및'오프셋'설정을 적절한 수준으로 조정합니다. 양수 염색 샘플을 사용할 수 있는 경우 각 채널에 대해 이 샘플을 이미징하여 레이저 설정이 잡음 비율에 최적의 신호를 생성하도록 하십시오.
   주의: 장시간 레이저 강도가 높으면 광표백이 발생할 수 있습니다.
9. 각 레이저에 대한 최적의 HV 및 오프셋 값을 설정한 후'ND 획득 탭'을클릭한 다음'Z'아이콘을 선택하여 z 계열의 매개 변수를 설정합니다. 다음으로, 샘플의 라이브 이미지를 획득하는 동안 먼저 이미지의 하단을 찾아'아래쪽'버튼을 클릭하여 하단을 설정한 다음 샘플의 위쪽 위치를 찾아'위쪽'버튼을 클릭합니다. 각 단계에 대해 필요한 단계 크기를 구체적으로 입력하거나 필요한 총 단계 수를 지정하여 단계 크기를 설정합니다.
10. z 시리즈 매개 변수가 설정되면 이미지의 원하는 크기/픽셀 해상도를 선택합니다. 이렇게 하려면 'A1plus Compact GUI'창을 클릭 하 고' 크기' 아이콘 원하는 해상도를 선택 합니다. 이미지의 노이즈를 줄이기 위해 선택한 이미지 수를 평균으로'ø'기호 옆에 있는 드롭다운 메뉴를 선택할 수 있습니다.
11. 이제 샘플 이미징을 시작하려면'ND 획득 메뉴'에'지금 실행'탭을 클릭합니다.
12. 이미징이 완료되면'파일','저장'을클릭하여 이미지를 저장하여 확장'.nd2'로이미지 파일을 내보냅니다. 마지막으로 다른 각 샘플에 대한 프로세스를 반복합니다.