면역침전반응 기반 기술: 아가로스 비즈를 사용한 내인성 단백질의 정제

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1. 단백질 A/G 플러스 아가로즈 구슬을 이용한 면역 침전

세포 리세이트 제제

심심분리기 10⁸ 티모세포는 마이크로센심분리기에서 3분 동안 13,000rpm에 상복부를 제거합니다.
참고: 세포 수는 원하는 단백질과 선택한 세포 유형의 발현 수준에 따라 달라집니다.
PMSF를 통해 500 μL 용해 버퍼 RIPA에서 세포를 다시 일시 중단합니다.
소용돌이로 몇 가지 빠른 펄스를 사용하여 세포를 방해한 다음 주사기에 부착 된 25 G 바늘로 lysate을 몇 번 흡입하십시오.
참고: 거품을 만들지 마십시오. 더 큰 세포 모형을 위한 21G 바늘과 같은 더 큰 바늘을 사용하십시오.
10 분 동안 얼음에 세포 용해를 배양.
4°C에서 15분 동안 13,000rpm의 lysate원심분리기.
상체를 신선한 마이크로 센심 분리기 튜브로 옮기십시오.

사전 클리어링

20 μL 단백질 A/G PLUS 아가로즈 구슬과 등류형 대조군 항체의 1 μg(여기, 마우스 IgG1 동형 대조군 항체가 사용됨)를 용액에 첨가한다.
참고: 사용되는 동형 항체의 선택은 풀다운 단계에서 나중에 사용되는 단백질 특이적 항체에 의존할 것이다.
차가운 방(4°C)의 원심분리기 회전기에 lysate 믹스를 30분 동안 배양합니다.
4°C에서 30s의 3200 rpm에서 샘플을 원심분리합니다.
미리 클리어된 상체를 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기습니다. 펠릿을 버리십시오.

단백질 농도 측정

브래드포드 분석능력을 수행하여 세포 의 단백질 농도를 결정한다.
Aliquot 1000 μL 브래드포드 시약7 마이크로 센심 분리기 튜브로.
다음과 같은 양의 BSA 단백질 표준(2 mg/mL)을 튜브 6개(표 1)에 넣습니다.

튜브 번호	BSA 부피(μL) (2 mg/mL)	단백질 농도(μg/μL)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

표 1: BSA 단백질 표준 금액

7^번째 튜브에서 미리 지워진 lysate의 1 μL을 추가합니다.
참고: 샘플 농도가 분석 감지 범위 내에 있는지 확인하려면 1:2 또는 1:5 용액 희석을 준비하고 분석합니다.
7개의 튜브 각각에서 200 μL을 평평한 바닥의 개별 우물에 넣고, 96웰 플레이트는 각 샘플을 삼중으로 반복합니다.
595 nm에서 플레이트 리더의 접시를 읽으십시오.
표준 곡선을 엑셀로 생성하고 미리 지워진 lysate의 단백질 농도를 계산합니다.

아래로 당겨

이 예에서 c-myc인 '제어'로 두 개의 신선한 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브를 '제어'로 표시하고 다른 하나는 '테스트'로 레이블을 지정합니다.
미리 지워진 용해 500μg를 각 튜브에 넣습니다.
참고: 여기서 사용되는 단백질의 양은 정제되기를 원하는 단백질의 양에 따라 달라집니다.
리시스 버퍼를 사용하여 각 튜브의 총 부피를 최대 500 μL까지 끌어올수 있습니다.
시험단관에 항-c-myc 항체 2μg을 추가하고 2μg 마우스 IgG1 이소타입 대조군 항체를 대조군에 첨가한다.
참고: 항체의 양은 항체 효능 및 표적 단백질의 양에 따라 달라집니다.
차가운 방 (4 °C)의 회전에 튜브를 2 시간 동안 배양하십시오.
각 튜브에 20 μL 단백질 A/G PLUS 아가로즈 구슬을 추가합니다.
참고: 구슬의 손상을 방지하기 위해 끝 차단된 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다.
하룻밤 동안 차가운 방 (4 °C)에서 회전에 배양하십시오.
참고: 표적 단백질및 항체 효능에 따라, 이 단계는 1시간에서 하룻밤사이에 달라질 수 있다.
30s 4°C의 경우 3200rpm의 튜브를 원심분리하여 구슬을 끌어당깁니다.
각 튜브에서 슈퍼네티드를 흡인합니다.
참고: 표적 단백질은 이제 구슬에 묶여 있습니다.
500 μL 1X 덜벡코의 PBS를 사용하여 구슬을 두 번 세척합니다.
30 s 4 °C의 경우 3200 rpm의 튜브원심분리기.
참고: 보다 엄격한 세척을 위해 RIPA와 같은 보다 엄격한 버퍼를 사용하십시오.
각 튜브에서 버퍼를 흡인합니다. 젤 로딩 팁을 사용하여 구슬에서 남은 버퍼를 제거하고 구슬을 얼음위에 두어 단백질을 엘로우시합니다.
참고: 이 예에서, 단백질은 서양 얼룩 분석을 위해 구슬을 끓여서 SDS-PAGE 실행 버퍼로 용출됩니다. 이 접근법은 IP 결과를 확인하거나 단백질 단백질 상호 작용을 검사하는 데 적합합니다. 구조적 또는 효소 분석을 위한 단백질의 정제와 같은 다른 다운스트림 응용 분야의 경우, 에피토프 태그(플래그 태그 또는 myc-tag)와 같은 보다 정교한 시스템은 관심 있는 단백질을 가진 항체의 용출을 피하기 위해 사용된다.

2. 웨스턴 블롯 분석을 통한 IP 검증

SDS 페이지 전기 포레시스:

20 μL SDS-PAGE 로딩 염료에서 β-메카토-에토놀을 포함하는 비드를 다시 일시 중단합니다.
샘플을 95°C에서 5분간 끓입니다.
원심 분리구는 실온에서 10 초 동안 13,000 rpm에서 구슬을 원심분리합니다.
젤 로딩 팁을 사용하여 구슬에서 얻은 샘플을 조심스럽게 파이프화하여 4-15 % 그라데이션 SDS-PAGE 젤의 우물에 로드하십시오.
샘플 외에도 단백질 사다리가 있는 차선과 미리 지워진 리세이트가 있는 차선을 적재하여 로딩 컨트롤로 작용합니다.
염료 전면이 젤의 바닥에 도달 할 때까지 100 V에서 실행 (~1h).

웨스턴 블롯 분석:

PVDF 멤브레인이 젤과 붉은 음극 사이에 있는지 확인, 웨스턴 블롯 샌드위치를 확인합니다.
100 V에서 1 시간 동안 전송합니다.
낮은 설정에서 로커에 1 h에 대한 실온에서 5 mL 차단 버퍼에 멤브레인을 배치, 비 특정 단백질 결합 부위를 차단합니다.
참고: 블로킹 버퍼, 1차 항체, 이차 항체 및 세차의 부피가 더 큰 크기의 블롯에 대해 증가해야 할 수도 있다.
블로우를 5mL 항-c-myc 항체로 낮은 설정에서 로커의 4°C에서 밤새 블로킹 버퍼에 배양합니다.
참고: 여기에 사용되는 항체는 풀다운 단계에서 사용되는 항체와 다릅니다.
5mL TBST를 사용하여 블로트 3-6번 세척할 수 있으며, 각 세척은 낮은 설정에서 로커의 실온에서 5분입니다.
HRP 태그된 래키 안티래빗 라이트 체인 이차 항체로 블롯을 버퍼블로 배양하고, 낮은 환경에서 로커의 실온에서 1h를 배양한다.
참고: 이차 항체의 선택은 서양 얼룩에 사용되는 1 차적인 항체에 달려 있습니다. 또한, 표적 단백질이 항체의 중사슬에 분자량이 가깝기 때문에 특정 이차광사슬이 프로토콜에 사용된다. 표적 단백질이 50kDa에 가까우면, 라이트 체인 특정 이차를 사용하십시오. 표적 단백질이 25kDa에 가까운 경우, 사용 및 중고 사슬 특정 이차.
5mL TBST를 사용하여 블로트 3-6번 세척할 수 있으며, 각 세척은 낮은 설정에서 로커의 실온에서 5분입니다.
여분의 액체를 제거하기 위해 실험실 와이프에 얼룩에서 액체를 제거하고 얼룩의 가장자리를 두드려.
1x 화학 발광 검출 시약으로 얼룩을 덮고 1 분 동안 배양하십시오.
참고: 감지 시약이 가볍고 시간에 민감하기 때문에 다음 단계를 신속하게 수행해야 합니다.
실험실 와이프에 블롯의 가장자리를 두드려 과도한 검출 시약을 제거합니다.
이미징 표면에 블롯을 놓습니다.
참고: 케미발광 얼룩도 필름을 사용하여 시각화할 수 있습니다.
'Chemiluminescent 프로그램'을사용하여 이미지를 사용하여 10초에서 5분까지 여러 시간 지점을 캡처합니다.
참고: 최적의 시간은 단백질 양과 항체의 품질에 따라 변경될 수 있습니다.
최적의 밴드 가시성을 가진 이미지를 선택한 다음 해당 이미지를 내보냅니다.
블롯을 이동하기 전에 이미저를 사용하여 블로트 사진을 찍어 사다리의 위치를 캡처합니다. 그런 다음 해당 이미지도 내보냅니다.
슬라이드 준비 소프트웨어(예: 파워포인트)를 사용하여 밴드와 래더 이미지를 정렬하여 단일 이미지를 형성합니다.