6.2: 연속 희석 및 플레이팅: 미생물 나열

1. 셋업

1. 모든 재질을 나열하는 플로우 차트, 단계별 실험 프로토콜 및 소모품을 폐기하는 방법은 실험실 노트북에 작성하고 실험 작업 공간 근처에 보관해야 합니다.
2. 작업 공간은 적절한 방부제 (70 % 에탄올)로 살균되어야하며 실험자는 노출 이상으로부터 보호하는 깨끗한 실험실 의류를 착용하여 오염 위험을 완화해야합니다. 적합한 의류에는 실험실 코트, 라텍스 또는 니트릴 장갑, 구글, 호흡보호구 및 폐쇄 신발이 포함되나 이에 국한되지 않습니다. 항상 무균 기술을 유지하는 것이 중요합니다.
3. 식염수 0.45%의 90mL를 준비합니다. 깨끗한 졸업 실린더를 사용하여 멸균 수의 90mL를 측정하고 0.45 %의 식염수로표시된 깨끗한 Erlenmeyer 플라스크로 전송합니다. 무게 .405 g의 염화 나트륨 (시그마 알드리치 NaCl S9888) 라벨 플라스크에 추가 0.45% 식염수. 솔루트가 보이지 않게 될 때까지 반복적으로 소용돌이치는 다.
4. 완료되면 실험자는 모든 표면을 다시 살균하고 OSHA 지침에 따라 원치 않는 유기체, 희석제, 페트리 접시 또는 일회용 접종 루프를 폐기해야 합니다. 실험실 의류는 손을 씻기 전에 제거 할 수 있습니다.

2. 미디어 준비

1. 원하는 유기체의 재배에 적합한 미디어를 선택합니다. 대부분의 시나리오에서 국물은 충분한 세균 성장을 가능하게 합니다. 위노그라드스키 프로토콜의 유기체가 여기에서 원하기 때문에 탄산칼슘, 황, 셀룰로오스 및 진흙으로 구성된 컬럼이 조립되어 7일 동안 방해받지 않고 방치되었습니다. 명명된 컬럼은 호기성, 소음조및 혐기성 섹션으로 구분됩니다.
2. 관심 있는 유기체를 도금하는 데 적합한 매체를 선택합니다. 미생물학 등급 의 한천을 사용한 액체 매체의 보충은 일반적으로 응고제로 사용됩니다. LB 배지/한천은 외명한 컬럼의 호기성, 미세 열병및 혐기성 부위로부터 샘플을 수확할 때 충분합니다. 참고: 마이크로에어로필릭 부위의 샘플은 이 절차를 위해 수확되지 않았습니다. 그러나, 이러한 유기체는 촛불 항아리에서 재배되어야한다. 밀봉하기 전에이 재배 챔버에 촛불을 도입하면 미세 에어로포릭 증식에 적합한 낮은 산소 환경을 만듭니다.
3. 250mL를 준비하고 자하기 때문에 500mL(또는 그 이상) Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 오토클레이브 시 종기를 방지하십시오. "국물"과 다른 하나는 "Agar"라고 레이블을 지정합니다.
4. 제조업체 농도 권장 사항을 따라 각 솔루션을 만드는 데 필요한 미디어 양을 결정합니다. 여기에서 사용되는 LB Agar는 25g/L과 초순수를 결합하여 제조합니다. 250mL의 부피는 6.25 LB Agar/250 mL 물의 용액이 필요합니다. 마찬가지로, LB 국물은 LB 국물과 물의 동일한 비율을 결합하여 제조된다. 고화제로 보충되지 않기 때문에 냉각시 굳어지지 않습니다.
5. 미디어를 계량하고 제조업체 권장 사항과 일치하는 비율로 물과 혼합합니다. "Agar"라고 표시된 플라스크에 6.25g의 LB 아가를 추가하고 6.25g의 LB 국물을 "국물"이라고 표시된 플라스크에 추가합니다. 각 플라스크에 250mL 초순수를 추가합니다.
6. 각 플라스크 위에 알루미늄 호일을 감싸고 오토클레이브를 사용하여 121°C, 15psi에서 최소 15분 동안 미디어를 살균합니다.
7. 내열 장갑이나 패드를 사용하여 사이클이 완료되면 오토클레이브에서 플라스크를 제거하고 40-50°C 수조에 넣습니다.
8. 적절한 온도에 도달하면 "국물"이라고 표시된 플라스크의 내용을 250mL Erlenmeyer 또는 라운드 하단 플라스크에 붓습니다. 250 mL 플라스크 "솔루션_0"에레이블을 지정합니다.
9. 10, 100mm x 15mm 멸균 페트리 접시를 얻고 날짜, 이름, 사용되는 미디어의 종류 및 유기체가 수확될 위노그라드스키 기둥 영역으로 라벨을 붙입니다.
10. 수조에서 "Agar"라고 표시된 플라스크를 제거하고 10개의 페트리 요리에 붓기 시작합니다. 각 접시에 15mL 이상을 추가해서는 안 됩니다. 이는 또한 정확도를 높이기 위해 피페터 및 25mL 세로지컬 파이펫으로 수행될 수 있다. 멸균 파이펫 팁을 사용하여 존재하는 거품을 제거한 다음 플레이트 뚜껑으로 덮고 밤새 고형화하십시오.

3. 희석 제고

1. 랙에 20mL 이상을 저장할 수 있는 10개의 테스트 튜브를 준비하고 T1-T10에 라벨을 부착합니다. 각 튜브 수는 희석 계수와 일치한다(즉, T4 = 1x10^-4 또는 0.0001 또는 1/10,000번째 재고 농도)에 해당한다.
2. 파이프 9 mL의 0.45% 식염수 각각에 10 개의 시험 관.
3. 식염수 블랭크는 이제 오토클레이브에 의해 멸균될 준비가 되었습니다. 알루미늄 호일을 사용하여 10개의 테스트 튜브를 각각 덮은 다음 오토클레이브 호환 테스트 튜브 랙으로 옮기습니다. 121°C, 15 psi에서 최소 15분 동안 멸균하십시오.
4. 내열 장갑을 사용하여 블랭크를 제거하고 식힙니다. 튜브가 실온에 도달하거나 터치를 식힐 때 필요할 때까지 4 °C에서 덮고 보관하십시오.

4. 대상 유기체 의 재배

1. 이전에 줄무늬 플레이트또는 냉동 재고의 50 μL에서 단일 콜로니와 "용액_0"을접종합니다. 접종된 "용액_0"을흔들림(필요한 경우)으로 밤새 37°C 인큐베이터에 배치하여 대상 유기체 시간을 복제할 수 있습니다. (참고: 플라스크는 오염을 방지하기 위해 덮여 있어야 합니다. 대상 유기체가 에어로빅인 경우 멸균 거즈와 면 플러그를 사용하여 오염을 방지하십시오. 위노그라드스키 컬럼의 영역을 평가하는 경우 원하는 각 영역(이 연구의 목적을 위해 에어로빅 및 혐기성)에서 1그램을 제거하고 5.3단계로 진행하기 전에 T1에서 다시 중단하십시오.

5. 직렬 희석

1. 인큐베이터에서 "영양 국물"이라고 표시된 플라스크를 얻고 힘차게 흔들어 줍니다.
2. "용액_0"의파이프 1 mL은 T1라벨이 있는 시험관으로 들어갔다. 소용돌이 T1. 위노그라드스키를 평가하는 경우 원하는 영역의 1그램의 무게를 측정하고 소용돌이전에 T1에 추가합니다. (참고: 1 mL은 단순성으로 사용되며, 희석제의 더 작거나 더 큰 볼륨도 사용될 수 있습니다).
3. 테스트 튜브 T1에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T2에 추가합니다. 소용돌이 T2.
4. 테스트 튜브 T2에서 1mL를 제거하고 테스트 튜브 T3에 추가합니다. 소용돌이 T3.
5. 테스트 튜브 T3에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T4에 추가합니다. 소용돌이 T4.
6. 테스트 튜브 T4에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T5에 추가합니다. 소용돌이 T5.
7. 테스트 튜브 T5에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T6에 추가합니다. 소용돌이 T6.
8. 테스트 튜브 T6에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T7에 추가합니다. 소용돌이 T7.
9. 테스트 튜브 T7에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T8에 추가합니다. 소용돌이 T8.
10. 테스트 튜브 T8에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T9에 추가합니다. 소용돌이 T9.
11. 테스트 튜브 T9에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T10에 추가합니다.

6. 스프레드 도금

1. T1에서 희석된 시료의 파이프 100 μL을 페트리 접시에 직접 스페트합니다. 이 단계는 각 튜브에 대해 반복될 필요는 없지만, 반복될 필요는 없습니다.
2. 멸균, 일회용 확산 막대 또는 화염을 얻어서 유리 확산 막대를 살균합니다. 시계 방향/시계 반대 방향으로 동작하면 퍼지는 막대의 수평 부분을 미끄러져 페트리 접시 내에서 샘플을 동등하게 분배합니다.
3. 평가할 위노그라드스키 열의 각 영역에 대해 반복합니다.
4. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 24시간 동안 배양합니다. 혐기성 유기체의 경우 혐기성 챔버를 사용하십시오.

7. 줄무늬

1. 대상 유기체의 적절한 희석을 선택합니다. 예를 들어, 솔루션_4는 초기 농도의 1/10,000 희석을 산출합니다. 전형적으로, 1/1,000th(T3/솔루션), 1/1,000,000th(T6/솔루션₆₎및 1/1,000,000,000th(T9/솔루션 _9)의희석을 통해 미생물을 예중화하도록 평가된다.
2. 플라스틱 멸균 일회용 접종 루프 또는 10초 이상 불에 불이 붙은 재사용 가능한 금속 접종 루프를 사용하여 5단계에서 원하는 용액에 담가 두세요. 보정된 접종 루프는 0.01 mL를 전송해야 합니다. (주의: 화염 루프가 열에서 제거한 직후 박테리아에 연락하는 것을 허용하지 마십시오)
3. 한쪽에 페트리 접시 커버를 약간 올려 서 접종 루프만 한천에 접근할 수 있습니다. 지그재그 방식으로 미디어 상단을 가로질러 접종루프를 미끄러지듯 미끄러지며 한천을 손상시키지 않도록 주의하세요. 페트리 접시 뚜껑을 낮춥다.
4. 새로운 일회용 접종 루프를 사용하거나 재사용 가능한 루프를 다시 소독하십시오.
5. 플레이트를 약 1/3rd(~118°)로 회전시키고 지그재그 동작의 빈도를 줄입니다.
6. 다시 말하지만, 새로운 일회용 루프를 사용하거나 최종 시간을 회전하기 전에 금속 루프를 다시 살균하고 지그재그 주파수를 다시 한 번 줄입니다. 페트리 접시 뚜껑을 낮춥다.
7. 7.2 - 7.6을 반복하여 3개의 다른 희석을 위해 적어도 3개의 페트리 요리가 줄지어 서 있거나, 새로운 일회용 루프를 사용하거나 재사용 가능한루프(그림 2)를다시 불태울 때까지 반복한다.
8. 줄무늬 페트리 요리를 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다. 혐기성 유기체의 경우, 항예실 챔버를 사용합니다.

8. 데이터 분석 및 결과

1. 배양은 7일 위노그라드스키 기둥의 소산화 및 무산소 영역에서 수확되었다. 이 구역은 각각 이종국 및 철 산화 혐기성에 적합합니다.
2. 컬럼 이출은 LB Agar 플레이트에 줄무늬 또는 확산되기 전에 연속적으로 희석되었습니다.
3. 줄무늬는 평가 된 위노 그라드 스키 지역의 각에서 혼합 인구를 공개했다. 스프레드 플레이트는 비슷한 결과를 낳았습니다.
4. CFU/mL 또는 CFU/g를 계산하려면 세 개의 플레이트에서 계산된 콜로니 수를 평균합니다. 희석 계수에 따라 평균 식민지 수를 곱하고 알리인용 양으로 나눕니다. 예를 들어, 평균 65개의 콜로니가 0.1mL의 용액 6(T6)으로 접종된 플레이트에 계산된 경우 이전에 설명한 공식은 650,000,000 CFU/mL과 같습니다.
5. 격리된 식민지는 이제 종 정체성을 결정하기 위해 농축 소사에 사용하기 위해 각 플레이트에서 선택할 수 있습니다.

때로는 박테리아를 식별하고 연구하기 위해 먼저 샘플에서 박테리아를 분리하고 농축해야 합니다. 예를 들어, Winogradsky Column에서 얻은 샘플은 혼합되어 있는데, 이는 여러 종 또는 박테리아 균주를 포함하고 있음을 의미하므로 개별 박테리아를 연구하거나 존재하는 다양한 종류를 열거하는 것은 어려울 수 있습니다. 이를 위해 연속 희석 및 도금 기술은 일반적으로 박테리아 부하를 안정적으로 정량화하고 개별 콜로니를 분리하는 데 사용됩니다.

연속 희석(serial dilution)은 유기체(이 예에서는 박테리아)의 농도가 고정된 부피의 액체 희석제에서 연속적인 재현탁을 통해 체계적으로 감소하는 과정입니다. 일반적으로 희석제의 부피는 샘플 유기체의 대수 감소를 용이하게 하기 위해 10의 배수입니다. 예를 들어, 1g의 침전물을 먼저 Winogradsky 관심 영역에서 제거하고 10ml의 적절한 액체 매체에 추가합니다. 그런 다음 이 첫 번째 희석 1밀리리터를 9밀리리터의 배지가 들어 있는 다른 튜브에 첨가합니다. 여러 농도의 박테리아가 준비될 때까지 이 과정을 반복할 수 있습니다. 이 예에서는 연속 희석이 박테리아 계수의 핵심인데, Winogradsky 컬럼의 혼합 샘플에는 알 수 없는 수의 박테리아가 포함되어 있기 때문입니다.

다음으로, 줄무늬 도금과 확산 도금은 각각 샘플 내에서 박테리아를 분리하고 계수할 수 있습니다. 줄무늬는 영양분이 보충된 고체 매체의 한 부분에 희석된 샘플을 도입하여 수행되며, 이는 3분의 1로 나뉩니다. 그런 다음 이 접종물을 지그재그 패턴으로 플레이트의 각 3분의 1에 퍼뜨립니다. 플레이트의 다른 섹션이 줄무늬가 있고 이전 샘플에서 한 번만 교차하면 샘플이 더 얇게 퍼집니다. 이것은 이후 섹션에서 개별 콜로니를 달성하기 위해 한 번의 희석에서만 줄무늬를 생성하면 될 수 있음을 의미합니다. 배양 후, 줄무늬 플레이트는 서로 다른 박테리아 종을 구별하는 데 도움이 될 수 있는 정보인 군체 형태를 관찰할 수 있습니다.

대안적으로, 주요 목표가 샘플 내 박테리아의 계수인 경우 스프레드 도금을 사용할 수 있습니다. 스프레드 도금에서, 단일 샘플의 부분 표본은 고체 매체의 전체 표면에 고르게 퍼집니다. 일반적으로 혼합 샘플의 박테리아 수를 모르기 때문에 각 희석액 또는 그 대표 샘플에 대해 스프레드 플레이트가 만들어집니다. 배양 후, 이러한 스프레드 플레이트를 사용하여 계수를 수행할 수 있습니다. 콜로니 수가 30 미만인 플레이트는 작은 카운트는 더 큰 오류가 발생할 수 있으므로 폐기해야 합니다. 마찬가지로, 300을 초과하는 수는 군체가 밀집되고 중복되면 군체 수를 과소평가할 수 있으므로 폐기해야 합니다. 이러한 나머지 접시 각각의 콜로니 수를 기록하고 희석 계수를 곱한 다음 플레이팅된 부피로 나누면 현탁액 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU)가 산출됩니다. 이 비디오에서는 알려진 박테리아가 포함된 샘플과 Winogradsky 컬럼의 다양한 영역에 포함된 미생물 군집을 연속 희석, 스프레드 도금 및 줄무늬 도금을 통해 정성적 및 정량적으로 평가하는 방법을 배웁니다.

먼저 실험복, 장갑, 고글 등 적절한 개인 보호 장비를 착용합니다. 다음으로, 70% 에탄올로 작업 공간을 살균하고 표면을 닦습니다. 다음으로, 500ml 삼각 플라스크 2개를 모아 한 육수에는 라벨을, 다른 한천에는 라벨을 붙입니다. LB 한천 용액을 준비하려면 한천이라고 표시된 플라스크에 약 6.25g의 LB 한천, 3g의 기술 한천, 250ml의 증류수를 혼합합니다.

그런 다음 2를 결합하여 LB 육수를 준비합니다. LB 배지 5g과 증류수 100ml를 플라스크 라벨이 붙은 육수에 넣습니다. 플라스크를 고압멸균한 후 내열 장갑을 사용하여 오토클레이브에서 플라스크를 제거하고 섭씨 40-50도의 수조에 넣습니다. 플라스크가 섭씨 50도가 되면 100ml 분취액을 조심스럽게 3개 준비하고 각 분취액을 0으로 표시합니다. 다음으로, 10개의 멸균 페트리 접시를 모아 날짜, 이름, 사용된 매체 유형 및 유기체를 수확할 Winogradsky Column 영역을 표시합니다. 한천 플라스크에서 15 밀리리터의 한천을 각 페트리 접시에 피펫팅합니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 기포를 제거하고 플레이트 뚜껑을 교체한 다음 밤새 벤치 상단에서 굳어지도록 합니다.

다음 날, 70% 에탄올로 벤치 상판을 닦습니다. 다음으로, 10 20밀리리터 시험관 T1에서 T10까지 라벨을 붙이고 랙에 넣습니다. 각 튜브에 .45% 식염수 9ml를 피펫팅합니다. 이제 10개의 시험관 각각을 캡으로 느슨하게 덮고 오토클레이브 호환 시험관 랙으로 옮깁니다. 사이클이 완료되면 내열 장갑을 사용하여 식염수 블랭크를 제거하고 식히십시오. 튜브가 약 섭씨 22도에 도달할 때까지 실온에서 보관하십시오.

알려진 표적 유기체인 이 예에서 E. coli를 배양하기 위해 이전에 줄무늬가 있는 플레이트에서 단일 콜로니로 100ml의 용액 0을 접종합니다. 그런 다음 튜브를 덮고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. Winogradsky Column의 영역을 평가하려면 호기성 영역에서 T1에 약 1g의 물질을 추가하고 와류에 의해 재현탁합니다. 그런 다음 혐기성 영역에서 1g의 재료로 이 과정을 반복합니다.

인큐베이터에서 E. coli가 접종된 용액 0이 들어 있는 튜브를 제거하고 흔듭니다. 그런 다음 용액 1ml를 T1 시험관과 와류에 피펫으로 넣어 혼합합니다. T1에서 용액 1ml를 제거하고 T2로 옮기고 소용돌이하여 혼합합니다. 튜브 T10을 통해 이 과정을 반복합니다. Winogradsky 컬럼의 호기성 및 혐기성 영역을 평가하려면 이전에 준비된 각 T1 튜브에서 1ml의 용액을 제거하고 적절한 T2 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 이전에 시연된 대로 T10 튜브를 통해 직렬 희석을 계속합니다.

플레이트를 펴기 위해 각 T3 튜브의 희석된 시료 100마이크로리터를 해당 페트리 접시에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 멸균 살포 막대를 사용하여 샘플을 페트리 접시에 부드럽게 분배하고 플레이트 뚜껑을 교체합니다. 앞에서 설명한 대로 T6 및 T9 희석에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 호기성 유기체가 포함된 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 혐기성 유기체가 포함된 플레이트를 섭씨 37도로 설정된 혐기성 챔버에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날 인큐베이터와 혐기성 챔버에서 T3, T6 및 T9 희석 플레이트를 제거하고 벤치 탑으로 옮깁니다. 한 번에 하나의 플레이트로 작업하면서 멸균 접종 루프를 지그재그 패턴으로 미디어 상단을 가로질러 미끄러지듯 움직입니다. 그런 다음 페트리 접시 뚜껑을 교체하십시오. 다음으로 플레이트를 1/3 회전시키고 루프를 살균하여 이전에 만든 지그재그 패턴의 빈도를 줄입니다. 다시 루프를 살균한 후 플레이트를 1/3 회전시키고 마지막으로 지그재그 패턴의 빈도를 줄인 다음 뚜껑을 교체합니다. 이전에 표시된 것처럼 나머지 플레이트에 대해 이 줄무늬 방법을 반복합니다. 그런 다음 호기성 유기체가 포함된 줄무늬 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 밤새 놓고 혐기성 유기체가 포함된 줄무늬 플레이트를 섭씨 37도로 설정된 혐기성 챔버에 밤새 놓습니다.

배양물은 7일간의 Winogradsky Column의 호기성 및 혐기성 구역에서 수확되었습니다. 그런 다음, 배양물을 LB 한천 플레이트에 줄무늬가 생기고 퍼지기 전에 연속적으로 희석했습니다. 줄무늬는 평가된 각 Winogradsky 영역에서 혼합된 개체군을 보여주었고 스프레드 플레이트는 유사한 결과를 생성했습니다. 혼합된 개체군에서 줄무늬가 있는 판은 다양한 모양, 크기, 질감 및 색상의 박테리아 군체를 생성합니다. 대조적으로, 알려진 유기체인 E. coli를 포함하는 줄무늬가 있고 퍼진 판은 상동 개체군을 보여주었습니다. 일반적으로 동일한 시료 및 희석 계수로 퍼져 있는 3개의 플레이트의 평균 콜로니 수를 사용하여 밀리리터당 CFU를 계산하는 것이 가장 좋습니다. 평균 군체 수에 희석 계수를 곱하고 분취된 양으로 나눕니다. 마지막으로, 각 플레이트에서 선택한 분리된 콜로니는 종 정체성을 결정하기 위한 추가 농축 분석에 사용할 수 있습니다.