연속 희석 및 플레이팅: 미생물 나열

1. 셋업

1. 모든 재질을 나열하는 플로우 차트, 단계별 실험 프로토콜 및 소모품을 폐기하는 방법은 실험실 노트북에 작성하고 실험 작업 공간 근처에 보관해야 합니다.
2. 작업 공간은 적절한 방부제 (70 % 에탄올)로 살균되어야하며 실험자는 노출 이상으로부터 보호하는 깨끗한 실험실 의류를 착용하여 오염 위험을 완화해야합니다. 적합한 의류에는 실험실 코트, 라텍스 또는 니트릴 장갑, 구글, 호흡보호구 및 폐쇄 신발이 포함되나 이에 국한되지 않습니다. 항상 무균 기술을 유지하는 것이 중요합니다.
3. 식염수 0.45%의 90mL를 준비합니다. 깨끗한 졸업 실린더를 사용하여 멸균 수의 90mL를 측정하고 0.45 %의 식염수로표시된 깨끗한 Erlenmeyer 플라스크로 전송합니다. 무게 .405 g의 염화 나트륨 (시그마 알드리치 NaCl S9888) 라벨 플라스크에 추가 0.45% 식염수. 솔루트가 보이지 않게 될 때까지 반복적으로 소용돌이치는 다.
4. 완료되면 실험자는 모든 표면을 다시 살균하고 OSHA 지침에 따라 원치 않는 유기체, 희석제, 페트리 접시 또는 일회용 접종 루프를 폐기해야 합니다. 실험실 의류는 손을 씻기 전에 제거 할 수 있습니다.

2. 미디어 준비

1. 원하는 유기체의 재배에 적합한 미디어를 선택합니다. 대부분의 시나리오에서 국물은 충분한 세균 성장을 가능하게 합니다. 위노그라드스키 프로토콜의 유기체가 여기에서 원하기 때문에 탄산칼슘, 황, 셀룰로오스 및 진흙으로 구성된 컬럼이 조립되어 7일 동안 방해받지 않고 방치되었습니다. 명명된 컬럼은 호기성, 소음조및 혐기성 섹션으로 구분됩니다.
2. 관심 있는 유기체를 도금하는 데 적합한 매체를 선택합니다. 미생물학 등급 의 한천을 사용한 액체 매체의 보충은 일반적으로 응고제로 사용됩니다. LB 배지/한천은 외명한 컬럼의 호기성, 미세 열병및 혐기성 부위로부터 샘플을 수확할 때 충분합니다. 참고: 마이크로에어로필릭 부위의 샘플은 이 절차를 위해 수확되지 않았습니다. 그러나, 이러한 유기체는 촛불 항아리에서 재배되어야한다. 밀봉하기 전에이 재배 챔버에 촛불을 도입하면 미세 에어로포릭 증식에 적합한 낮은 산소 환경을 만듭니다.
3. 250mL를 준비하고 자하기 때문에 500mL(또는 그 이상) Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 오토클레이브 시 종기를 방지하십시오. "국물"과 다른 하나는 "Agar"라고 레이블을 지정합니다.
4. 제조업체 농도 권장 사항을 따라 각 솔루션을 만드는 데 필요한 미디어 양을 결정합니다. 여기에서 사용되는 LB Agar는 25g/L과 초순수를 결합하여 제조합니다. 250mL의 부피는 6.25 LB Agar/250 mL 물의 용액이 필요합니다. 마찬가지로, LB 국물은 LB 국물과 물의 동일한 비율을 결합하여 제조된다. 고화제로 보충되지 않기 때문에 냉각시 굳어지지 않습니다.
5. 미디어를 계량하고 제조업체 권장 사항과 일치하는 비율로 물과 혼합합니다. "Agar"라고 표시된 플라스크에 6.25g의 LB 아가를 추가하고 6.25g의 LB 국물을 "국물"이라고 표시된 플라스크에 추가합니다. 각 플라스크에 250mL 초순수를 추가합니다.
6. 각 플라스크 위에 알루미늄 호일을 감싸고 오토클레이브를 사용하여 121°C, 15psi에서 최소 15분 동안 미디어를 살균합니다.
7. 내열 장갑이나 패드를 사용하여 사이클이 완료되면 오토클레이브에서 플라스크를 제거하고 40-50°C 수조에 넣습니다.
8. 적절한 온도에 도달하면 "국물"이라고 표시된 플라스크의 내용을 250mL Erlenmeyer 또는 라운드 하단 플라스크에 붓습니다. 250 mL 플라스크 "솔루션_0"에레이블을 지정합니다.
9. 10, 100mm x 15mm 멸균 페트리 접시를 얻고 날짜, 이름, 사용되는 미디어의 종류 및 유기체가 수확될 위노그라드스키 기둥 영역으로 라벨을 붙입니다.
10. 수조에서 "Agar"라고 표시된 플라스크를 제거하고 10개의 페트리 요리에 붓기 시작합니다. 각 접시에 15mL 이상을 추가해서는 안 됩니다. 이는 또한 정확도를 높이기 위해 피페터 및 25mL 세로지컬 파이펫으로 수행될 수 있다. 멸균 파이펫 팁을 사용하여 존재하는 거품을 제거한 다음 플레이트 뚜껑으로 덮고 밤새 고형화하십시오.

3. 희석 제고

1. 랙에 20mL 이상을 저장할 수 있는 10개의 테스트 튜브를 준비하고 T1-T10에 라벨을 부착합니다. 각 튜브 수는 희석 계수와 일치한다(즉, T4 = 1x10^-4 또는 0.0001 또는 1/10,000번째 재고 농도)에 해당한다.
2. 파이프 9 mL의 0.45% 식염수 각각에 10 개의 시험 관.
3. 식염수 블랭크는 이제 오토클레이브에 의해 멸균될 준비가 되었습니다. 알루미늄 호일을 사용하여 10개의 테스트 튜브를 각각 덮은 다음 오토클레이브 호환 테스트 튜브 랙으로 옮기습니다. 121°C, 15 psi에서 최소 15분 동안 멸균하십시오.
4. 내열 장갑을 사용하여 블랭크를 제거하고 식힙니다. 튜브가 실온에 도달하거나 터치를 식힐 때 필요할 때까지 4 °C에서 덮고 보관하십시오.

4. 대상 유기체 의 재배

1. 이전에 줄무늬 플레이트또는 냉동 재고의 50 μL에서 단일 콜로니와 "용액_0"을접종합니다. 접종된 "용액_0"을흔들림(필요한 경우)으로 밤새 37°C 인큐베이터에 배치하여 대상 유기체 시간을 복제할 수 있습니다. (참고: 플라스크는 오염을 방지하기 위해 덮여 있어야 합니다. 대상 유기체가 에어로빅인 경우 멸균 거즈와 면 플러그를 사용하여 오염을 방지하십시오. 위노그라드스키 컬럼의 영역을 평가하는 경우 원하는 각 영역(이 연구의 목적을 위해 에어로빅 및 혐기성)에서 1그램을 제거하고 5.3단계로 진행하기 전에 T1에서 다시 중단하십시오.

5. 직렬 희석

1. 인큐베이터에서 "영양 국물"이라고 표시된 플라스크를 얻고 힘차게 흔들어 줍니다.
2. "용액_0"의파이프 1 mL은 T1라벨이 있는 시험관으로 들어갔다. 소용돌이 T1. 위노그라드스키를 평가하는 경우 원하는 영역의 1그램의 무게를 측정하고 소용돌이전에 T1에 추가합니다. (참고: 1 mL은 단순성으로 사용되며, 희석제의 더 작거나 더 큰 볼륨도 사용될 수 있습니다).
3. 테스트 튜브 T1에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T2에 추가합니다. 소용돌이 T2.
4. 테스트 튜브 T2에서 1mL를 제거하고 테스트 튜브 T3에 추가합니다. 소용돌이 T3.
5. 테스트 튜브 T3에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T4에 추가합니다. 소용돌이 T4.
6. 테스트 튜브 T4에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T5에 추가합니다. 소용돌이 T5.
7. 테스트 튜브 T5에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T6에 추가합니다. 소용돌이 T6.
8. 테스트 튜브 T6에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T7에 추가합니다. 소용돌이 T7.
9. 테스트 튜브 T7에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T8에 추가합니다. 소용돌이 T8.
10. 테스트 튜브 T8에서 1mL을 제거하고 테스트 튜브 T9에 추가합니다. 소용돌이 T9.
11. 테스트 튜브 T9에서 1 mL을 제거하고 테스트 튜브 T10에 추가합니다.

6. 스프레드 도금

1. T1에서 희석된 시료의 파이프 100 μL을 페트리 접시에 직접 스페트합니다. 이 단계는 각 튜브에 대해 반복될 필요는 없지만, 반복될 필요는 없습니다.
2. 멸균, 일회용 확산 막대 또는 화염을 얻어서 유리 확산 막대를 살균합니다. 시계 방향/시계 반대 방향으로 동작하면 퍼지는 막대의 수평 부분을 미끄러져 페트리 접시 내에서 샘플을 동등하게 분배합니다.
3. 평가할 위노그라드스키 열의 각 영역에 대해 반복합니다.
4. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 24시간 동안 배양합니다. 혐기성 유기체의 경우 혐기성 챔버를 사용하십시오.

7. 줄무늬

1. 대상 유기체의 적절한 희석을 선택합니다. 예를 들어, 솔루션_4는 초기 농도의 1/10,000 희석을 산출합니다. 전형적으로, 1/1,000th(T3/솔루션), 1/1,000,000th(T6/솔루션₆₎및 1/1,000,000,000th(T9/솔루션 _9)의희석을 통해 미생물을 예중화하도록 평가된다.
2. 플라스틱 멸균 일회용 접종 루프 또는 10초 이상 불에 불이 붙은 재사용 가능한 금속 접종 루프를 사용하여 5단계에서 원하는 용액에 담가 두세요. 보정된 접종 루프는 0.01 mL를 전송해야 합니다. (주의: 화염 루프가 열에서 제거한 직후 박테리아에 연락하는 것을 허용하지 마십시오)
3. 한쪽에 페트리 접시 커버를 약간 올려 서 접종 루프만 한천에 접근할 수 있습니다. 지그재그 방식으로 미디어 상단을 가로질러 접종루프를 미끄러지듯 미끄러지며 한천을 손상시키지 않도록 주의하세요. 페트리 접시 뚜껑을 낮춥다.
4. 새로운 일회용 접종 루프를 사용하거나 재사용 가능한 루프를 다시 소독하십시오.
5. 플레이트를 약 1/3rd(~118°)로 회전시키고 지그재그 동작의 빈도를 줄입니다.
6. 다시 말하지만, 새로운 일회용 루프를 사용하거나 최종 시간을 회전하기 전에 금속 루프를 다시 살균하고 지그재그 주파수를 다시 한 번 줄입니다. 페트리 접시 뚜껑을 낮춥다.
7. 7.2 - 7.6을 반복하여 3개의 다른 희석을 위해 적어도 3개의 페트리 요리가 줄지어 서 있거나, 새로운 일회용 루프를 사용하거나 재사용 가능한루프(그림 2)를다시 불태울 때까지 반복한다.
8. 줄무늬 페트리 요리를 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다. 혐기성 유기체의 경우, 항예실 챔버를 사용합니다.

8. 데이터 분석 및 결과

1. 배양은 7일 위노그라드스키 기둥의 소산화 및 무산소 영역에서 수확되었다. 이 구역은 각각 이종국 및 철 산화 혐기성에 적합합니다.
2. 컬럼 이출은 LB Agar 플레이트에 줄무늬 또는 확산되기 전에 연속적으로 희석되었습니다.
3. 줄무늬는 평가 된 위노 그라드 스키 지역의 각에서 혼합 인구를 공개했다. 스프레드 플레이트는 비슷한 결과를 낳았습니다.
4. CFU/mL 또는 CFU/g를 계산하려면 세 개의 플레이트에서 계산된 콜로니 수를 평균합니다. 희석 계수에 따라 평균 식민지 수를 곱하고 알리인용 양으로 나눕니다. 예를 들어, 평균 65개의 콜로니가 0.1mL의 용액 6(T6)으로 접종된 플레이트에 계산된 경우 이전에 설명한 공식은 650,000,000 CFU/mL과 같습니다.
5. 격리된 식민지는 이제 종 정체성을 결정하기 위해 농축 소사에 사용하기 위해 각 플레이트에서 선택할 수 있습니다.