6.6: 성장 곡선: 군집 형성 단위 및 광학 밀도 측정을 사용하여 성장 곡선 생성

1. 셋업

1. 필수 실험실 재료: 액체 매체, 고형화 된 천막 매체, Erlenmeyer 플라스크, 15 mL 테스트 튜브, 인산염 완충식 식염수 (PBS), 세균 세포 스프레더, 70 % 에탄올 및 분광광계. 모든 솔루션과 유리 제품은 사용하기 전에 멸균되어야 합니다.
2. 70%의 에탄올로 살균하여 워크스테이션을 준비합니다. 분젠 버너 근처에서 작업하여 미디어 오염을 방지합니다.
3. 박테리아와 함께 작업 할 때, 적절한 개인 보호 장비와 무균 기술을 사용해야합니다. 세균 배양과 함께 작업할 때는 실험실 코트와 장갑이 필요합니다.
4. 버퍼, 솔루션 및 시약용 레시피
   1. 인산염 완충식식염(PBS) (8).
   2. 루리아-베르타니 브로스 (LB) (9).

2. 프로토콜

1. 미디어 준비
   1. 박테리아를 성장 시키고 별도의 자동 분해병에서 액체 국물 및 고체 한천 (1.5 % w /v agar) 미디어를 모두 준비하는 성장 매체를 식별합니다. 여기서, LB 국물과 LB 한청은 대장균의성장을 위해 준비되었다.
   2. 35분 동안 121°C로 설정된 오토클레이브에서 반조개캡으로 미디어를 살균합니다.
   3. 한천 의 경우, 오토클레이브 후, 식히기 위해 30 분 동안 50 °C로 설정 된 수조에 놓습니다. 식으면 20-25mL 의 한천 미디어를 100x15mm 원형 페트리 접시에 붓습니다. 플레이트를 사용 하기 전에 실온에서 24 시간 설정 합니다.
2. 박테리아의 초기 준비
   1. 냉동 된 육수에서, 단일 식민지 분리를 얻기 위해 선택 된 미디어 한고에 격리를위한 줄무늬 박테리아. 선택한 박테리아에 허용되는 성장 조건에서 배양하십시오. 여기서, 대장균은 LB 한천에 줄무늬가 있고 하룻밤 사이에 37°C(16-18h)로 배양된다.
   2. 멸균 접종 루프를 사용하여, 15mL 시험관에서 줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 4mL 액체 매체를 접종하고 선택한 박테리아에 허용되는 조건에서 성장한다. 여기서 대장균은 37°C에서 하룻밤 사이에 210rpm(16-18h)에서 흔들리며 재배된다.
3. 성장 곡선 설정
   1. 성장 플라스크 준비
      1. 오토클레이브 크기의 에를렌마이어 플라스크. 일반적으로 전체 플라스크 볼륨에 대한 미디어의 1:5 비율이 사용됩니다. 여기서, 100 mL LB 미디어는 500 mL 플라스크에 사용된다.
      2. 세로지학적 파이펫을 사용하여 멸균 매체를 Erlenmeyer 플라스크로 옮기세요.
   2. 희석 시리즈 준비
      1. 라벨 15 mL 테스트 튜브: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 및 -9, 각각9mL PBS를 배포. 이 숫자는 CFU/mL을 계산하는 데 사용되는 희석 계수에 해당합니다. 각 수집 타임포인트에는 새로운 튜브 세트가 필요합니다. (그림2)
   3. 마고 플레이트 준비
      1. 컬렉션 및 희석 계수의 시간 라벨 플레이트. 각 시간 지점에 대해 각 희석에 대해 하나의 플레이트가 있을 것입니다.
4. 성장 곡선 프로토콜
   1. 미디어 접종
      1. 2.2.2단계의 일환으로 준비된 야간 액체 배양을 사용하여 플라스크 미디어를 1:1000 배양으로 접종한다. 여기서, 100 μL 하룻밤 액체 배양은 100mL LB 배지에 첨가된다.
      2. 박테리아를 균등하게 분배하기 위해 미디어를 소용돌이시다.
   2. 타임포인트 컬렉션
      1. 성장 상태 설정
         1. 주어진 박테리아에 대 한 선택 된 실험 성장 조건에서 플라스크를 배치. 시간 포인트는 빠르게 성장하는 박테리아에 대 한 자주 취해야 하 고 느린 성장 박테리아에 대 한 긴 간격으로 촬영할 수 있습니다. 여기서 대장균은 분당 210회전(rpm)에서 흔들리며 37°C에서 재배되며, 1시간마다 타임포인트가 소요됩니다.
      2. 광학 밀도(OD600) 측정
         1. 시작 시점을 포함한 각 시점에서(t = 0) 세균 배양 1mL를 인출하고 분광계 큐벳으로 분배한다.
         2. 큐벳을 깨끗하게 닦고 600 nm 파장에서 광학 밀도를 기록합니다. 광학 밀도 판독값이 1.0보다 크면 900 μL 프레시 미디어로 1:10 배양 1:10을 희석하고, 광학 밀도를 기록하고, OD600 측정을 위해 이 값을 10으로 곱한다.
      3. 콜로니 성형 장치(CFU/mL) 측정
         1. 각 시점에서 세균 배양 1mL를 인출하고 PBS 9mL를 포함하는 -1 유리 시험 관에 분배한다.
         2. 희석 계열의 경우- -1 튜브에서 1mL를 모든 희석 튜브아래로 -9로 연속적으로 전송하고, 각 전송 후 소용돌이를 한다. (그림2)
         3. 각 희석에 대해, 그에 상응하는 라벨이 부착된 고체 미디어 천판에 셀 현탁액 100 μL을 분배한다. (그림2)
         4. 에탄올에서 살균된 셀 스프레더를 사용하여 분젠 버너 불꽃을 통과하고, 한천의 표면을 만져 냉각시키고, 천판표면이 건조해질 때까지 100μL의 셀 서스펜션을 확산한다.
         5. 박테리아의 성장을 지원하는 온도에서 스프레드 플레이트를 거꾸로 배양합니다. 여기서 대장균은 37°C에서 배양됩니다.
         6. 인큐베이션 후, 일단 눈에 보이는 식민지가 발생하면 각 판에 세균 성 식민지수를 계산하고 각 시점에서 모든 플레이트에 대한 관련 희석 계수와 함께 이러한 값을 기록합니다.

3. 데이터 분석 및 결과

1. 광학 밀도(OD600) 성장 곡선 플롯
   1. 광학 밀도(OD600)와 세미 로그 스케일의 시간을 플롯합니다. (그림3)
2. 콜로니 성형 유닛(CFU/mL) 성장 곡선 플롯
   1. 각 타임포인트에 대해, 식민지 수가 30-300 박테리아의 범위 내에 떨어졌다 희석 판을 선택합니다. 콜로니 카운트 수를 희석 계수별로 곱한 다음 100 μL 스프레드가 CFU/mL을 계산할 때 추가1:10 희석으로 간주됩니다.
      
   2. 콜로니 형성 유닛과 시간 대 반로그 스케일을 플롯합니다. (그림4)
3. 광학 밀도 및 식민지 형성 장치 관련
   1. OD600과 CFU/mL 사이의 관계가 1.0 OD600을 초과하여 덜 정확하기 때문에 OD600 판독값에 대한 선형 축척에서 콜로니 형성 유닛과 광학 밀도를 1.0 OD600 이상으로 플롯한다. 여기서 처음 여섯 개의 타임포인트가 플롯됩니다. (그림5)
   2. 방정식과 R² 값을 표시하는 선형 회귀 추세선을 생성합니다.
4. 박테리아 두 배 시간 결정
   1. 콜로니 형성 단위 성장 곡선 플롯을 사용하여, 기하급수적 단계 동안, 두 배의 시간을 계산하기 위해 그들 사이의 가파른 경사와 그래프에 두 점을 식별합니다.
   2. 두 배로 계산
      1. 
      2. ΔTime = t₂ - t_1,여기서 t₁ = 타임 포인트 1 및 t₂ = 시간 점 2
      3. , 여기서 b = t_2, B = 세대의 n = 수의 박테리아 수에서 박테리아의 수. 에서 파생 : .
      4. 다음을 사용하여 두 배의 시간을 계산합니다.
         

박테리아는 세포 분열이라는 과정을 통해 번식하며, 그 결과 두 개의 동일한 딸 세포가 생성됩니다. 성장 조건이 유리하면 박테리아 개체군이 기하급수적으로 증가할 것입니다.

박테리아 성장 곡선은 배양에 포함된 박테리아의 양을 시간의 함수로 표시합니다. 일반적인 성장 곡선은 지연 단계, 지수 단계, 정지 단계 및 사망 단계의 4단계를 통해 진행됩니다. 지연 단계는 박테리아가 빠르게 성장하고 분열할 수 있는 상태에 도달하는 데 걸리는 시간입니다. 그 후, 박테리아는 급격한 세포 성장과 분열을 특징으로 하는 기하급수적 단계로 전환됩니다. 이 단계에서 박테리아 배양의 기하급수적인 성장 속도는 특정 조건에서 박테리아가 번식할 수 있는 가장 빠른 속도인 배가 시간으로 표현할 수 있습니다. 그 다음에는 정지기가 오는데, 이 단계에서는 박테리아 세포의 성장이 안정되고 성장률과 사멸률이 환경적 영양분 고갈로 인해 고르게 나타납니다. 마지막으로 박테리아는 사멸 단계로 들어갑니다. 이것은 박테리아 성장이 급격히 감소하고 심각한 영양 고갈로 인해 세포가 용해되는 곳입니다.

두 가지 기술을 사용하여 배양에 존재하는 박테리아의 양을 정량화하고 성장 곡선을 그릴 수 있습니다. 그 중 첫 번째는 집락 형성 단위(CFU)를 통한 것입니다. CFU를 얻기 위해 9개의 희석으로 구성된 1-10개의 시리즈가 일정한 시점에 수행됩니다. 이러한 희석 중 첫 번째 희석액(이 예시에서는 음수)에는 9mL의 PBS와 1mL의 박테리아 배양액이 포함되어 있습니다. 그 결과 1:10 희석 계수가 발생합니다. 그런 다음 이 용액 1mL를 다음 튜브인 음의 2로 전달하여 1:100 희석 계수를 생성합니다. 이 과정은 마지막 튜브인 negative nine까지 계속되어 최종 희석 계수가 1:10억이 됩니다. 그 후, 각 희석액 100 마이크로 리터가 도금됩니다. 그런 다음 플레이트를 배양하고 클론 콜로니를 계산합니다. 30개에서 300개 콜로니 사이에서 성장하는 주어진 시점에 대한 희석 플레이트는 해당 시점의 밀리리터당 CFU를 계산하는 데 사용됩니다.

박테리아 농도를 측정하는 두 번째 일반적인 방법은 광학 밀도입니다. 배양물의 광학 밀도는 분광 광도계를 사용하여 매체 블랭크와 관련하여 즉시 측정할 수 있습니다. 일반적으로 OD600이라고도 하는 600나노미터의 파장이 이러한 측정에 사용되며, 이는 세포 밀도가 증가함에 따라 증가합니다. 광학 밀도는 CFU보다 덜 정확하지만 즉각적으로 얻을 수 있고 상대적으로 적은 시약이 필요하기 때문에 편리합니다. 두 기술을 함께 사용하여 배양의 박테리아 세포 수를 보다 정확하게 근사화하는 표준 곡선을 만들 수 있습니다. 이 동영상에서는 대장균의 시간 연속 희석액에서 CFU 및 OD600 측정값을 얻는 방법을 배웁니다. 그런 다음 CFU 및 OD600 측정을 각각 사용하는 두 개의 성장 곡선이 표준 곡선과 관련되기 전에 표시됩니다.

박테리아와 함께 작업할 때는 실험복과 장갑과 같은 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 적절한 무균 기술을 준수하는 것이 중요합니다.

그런 다음 70% 에탄올로 작업장을 살균하십시오. 먼저 LB 육수와 LB 고체 한천 배지를 별도의 오토클레이브 병에 준비합니다. 병의 뚜껑을 부분적으로 닫은 후 섭씨 121도로 설정된 오토클레이브에서 35분 동안 매체를 살균합니다. 다음으로, 한천 배지를 섭씨 50도로 설정된 수조에서 30분 동안 냉각시킵니다. 식으면 각 페트리 접시에 20-25mL를 붓습니다. 그런 다음 접시를 실온에서 24시간 동안 굳히십시오.

나중에 액체 박테리아 배양액을 생산하는 데 사용될 단일 콜로니 분리물을 준비하려면 이전에 동결된 스톡과 적절한 줄무늬 도금 기술을 사용하여 LB 한천에서 분리하기 위해 E. coli를 줄무늬로 만듭니다. 접시를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 그 후, 줄무늬가 있는 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하기 전에 한천에서 화염 살균 접종 루프를 냉각시킵니다. 15mL 시험관에 4mL의 액체 매체를 접종합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 210rpm으로 흔들면서 밤새 대장균을 성장시킵니다.

성장 곡선에 사용될 1:1000 부피의 박테리아 배양을 설정하려면 먼저 오토클레이브 처리된 500mL 삼각 플라스크를 구합니다. 그런 다음 50mL 혈청학 피펫을 사용하여 100mL의 멸균 배지를 플라스크로 옮깁니다. 다음으로, 9개의 15ml 시험관을 1에서 9까지 연속적으로 표시합니다. 이 숫자는 집락 형성 단위(CFU)를 계산하는 데 사용되는 희석 계수에 해당합니다. 그런 다음 각 튜브에 9mL의 1X PBS를 추가합니다. 그 후, 준비된 한천 플레이트에 해당 시점과 성장할 희석 계수를 표시하십시오. E. coli를 사용한 이 예에서는 시작 시점 이후 한 시간마다 한 번씩 시점을 취합니다. 이전에 준비된 하룻밤 동안 준비된 액체 대장균 배양을 사용하여 오토클레이브 500mL 삼각 플라스크의 배지에 1:1000 부피의 배양액을 접종합니다. 박테리아가 고르게 분포되도록 미디어를 소용돌이칩니다.

분광 광도계를 비운 후 보푸라기가 없는 물티슈로 큐벳을 청소합니다. 다음으로, 배양액 1mL를 큐벳에 분주하고 분광 광도계에 넣어 시점 0에서 배양물의 광학 밀도를 얻습니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 210rpm으로 흔들면서 대장균을 성장시킵니다. 시점이 0이 된 시점 이후의 각 시점에서, 플라스크에서 1mL의 박테리아 배양액을 더 회수하고 광학 밀도 측정을 반복합니다. 광학 밀도 판독값이 1.0보다 크면 100마이크로리터의 박테리아 배양액을 900마이크로리터의 새로운 배지로 희석한 다음 광학 밀도를 한 번 더 측정합니다. 이 값에 OD 600 측정을 위해 10을 곱할 수 있습니다.

각 시점에 대한 집락 형성 단위 측정값을 얻으려면 각 시점에서 플라스크에서 추가로 1mL의 박테리아 배양을 회수합니다. 박테리아 배양액을 음극 하나의 시험관에 분배하고 혼합하기 위해 소용돌이칩니다. 그런 다음 먼저 음극 1 튜브에서 1 mL를 음극 2 튜브로 옮기고 와류를 혼합하여 희석 시리즈를 수행합니다. 음극 2 튜브에서 음극 3 튜브로 1mL를 옮기고 와류를 섞습니다. 모든 희석 튜브를 음극 9개 튜브로 이 직렬 전송을 계속합니다. 각 희석액에 대해 100마이크로리터의 세포 현탁액을 해당 라벨이 부착된 플레이트에 분배합니다. 희석할 때마다 세포 살포기를 에탄올로 살균하고 분젠 버너 화염에 통과시킨 다음 접종자에서 멀리 떨어진 한천 표면을 만져 냉각시킵니다. 그런 다음 세포 스프레더를 사용하여 한천 플레이트의 표면이 건조해질 때까지 세포 현탁액을 퍼뜨립니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 거꾸로 배양합니다. 눈에 보이는 군체가 생기면 각 판에 있는 박테리아 군집의 수를 세십시오. 각 시점에서 각 플레이트에 대한 이러한 값과 관련 희석 계수를 기록합니다.

OD 600 성장 곡선을 만들려면 모든 데이터 포인트가 테이블에 올바르게 입력되었는지 확인한 후 모든 시점과 해당 데이터를 선택합니다. 집락 형성 단위 성장 곡선 플롯을 생성하려면 각 시점에 대해 집락 수가 30-300 박테리아 범위 내에 있는 희석 플레이트를 선택합니다. 콜로니 카운트 수에 희석 계수를 곱한 다음 10을 곱합니다. 이는 100 마이크로 리터 확산이 밀리리터당 집락 형성 단위를 계산할 때 추가 1:10 희석으로 간주되기 때문입니다. 그런 다음 식민지 형성 단위 대 시간을 반 로그 스케일로 플롯합니다.

각각 OD 600 및 CFU 측정으로 생성된 이러한 플롯은 대장균 성장 역학에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 광학 밀도와 집락 형성 단위를 관련시킬 수 있으므로 OD 600 측정에서 밀리리터당 CFU를 추정할 수 있으므로 향후 실험에서 시간과 재료를 절약할 수 있습니다.

이렇게 하려면 OD 600 판독값이 1보다 작거나 같은 선형 스케일에서 광학 밀도에 대해 콜로니 형성 단위를 플롯합니다. 0. 그런 다음 Y = MX + B 형식으로 선형 회귀 추세선을 생성하며, 여기서 M은 기울기이고 B는 y 절편입니다. 데이터 포인트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 추세선 및 선형 추가를 선택합니다. 그런 다음 확인란을 선택하여 차트에 방정식을 표시하고 차트에 R 제곱 값을 표시합니다. R 제곱 값은 데이터가 적합된 회귀선과 얼마나 가깝게 일치하는지에 대한 통계적 측정값입니다. 이 예에서 처음 6개의 시점은 x축에 OD 600, y축에 밀리리터당 CFU로 표시됩니다. 동일한 성장 조건의 향후 실험에서는 이러한 기울기 및 y-절편 값을 이 방정식에 대입하여 OD 600 판독값에서 CFU를 추정할 수 있습니다. 다음으로, 군체 형성 단위 성장 곡선 플롯을 살펴봅니다. 지수 단계에서는 두 지점 사이의 경사가 가장 가파른 두 개의 시간 지점을 식별합니다. 더블링 시간을 계산하려면 먼저 선택한 시점 사이의 시간 변화를 계산합니다. 그런 다음 여기에 표시된 방정식을 사용하여 세대의 변화를 계산합니다. 여기서, 소문자 b는 시점 3의 박테리아 수이고, 대문자 B는 시점 2의 박테리아 수입니다. 마지막으로, 시간의 변화를 세대의 변화로 나눕니다. 이 예에서 더블링 시간은 0입니다. 26시간 또는 15분 19초. 다양한 실험 처리에서 배가 시간을 비교하면 특정 박테리아 종에 대한 최상의 성장 조건을 식별할 수 있습니다. 따라서 가장 낮은 배가 시간을 가진 처리는 테스트 된 조건 중 가장 최적입니다.