성장 곡선: 군집 형성 단위 및 광학 밀도 측정을 사용하여 성장 곡선 생성

1. 셋업

1. 필수 실험실 재료: 액체 매체, 고형화 된 천막 매체, Erlenmeyer 플라스크, 15 mL 테스트 튜브, 인산염 완충식 식염수 (PBS), 세균 세포 스프레더, 70 % 에탄올 및 분광광계. 모든 솔루션과 유리 제품은 사용하기 전에 멸균되어야 합니다.
2. 70%의 에탄올로 살균하여 워크스테이션을 준비합니다. 분젠 버너 근처에서 작업하여 미디어 오염을 방지합니다.
3. 박테리아와 함께 작업 할 때, 적절한 개인 보호 장비와 무균 기술을 사용해야합니다. 세균 배양과 함께 작업할 때는 실험실 코트와 장갑이 필요합니다.
4. 버퍼, 솔루션 및 시약용 레시피
   1. 인산염 완충식식염(PBS) (8).
   2. 루리아-베르타니 브로스 (LB) (9).

2. 프로토콜

1. 미디어 준비
   1. 박테리아를 성장 시키고 별도의 자동 분해병에서 액체 국물 및 고체 한천 (1.5 % w /v agar) 미디어를 모두 준비하는 성장 매체를 식별합니다. 여기서, LB 국물과 LB 한청은 대장균의성장을 위해 준비되었다.
   2. 35분 동안 121°C로 설정된 오토클레이브에서 반조개캡으로 미디어를 살균합니다.
   3. 한천 의 경우, 오토클레이브 후, 식히기 위해 30 분 동안 50 °C로 설정 된 수조에 놓습니다. 식으면 20-25mL 의 한천 미디어를 100x15mm 원형 페트리 접시에 붓습니다. 플레이트를 사용 하기 전에 실온에서 24 시간 설정 합니다.
2. 박테리아의 초기 준비
   1. 냉동 된 육수에서, 단일 식민지 분리를 얻기 위해 선택 된 미디어 한고에 격리를위한 줄무늬 박테리아. 선택한 박테리아에 허용되는 성장 조건에서 배양하십시오. 여기서, 대장균은 LB 한천에 줄무늬가 있고 하룻밤 사이에 37°C(16-18h)로 배양된다.
   2. 멸균 접종 루프를 사용하여, 15mL 시험관에서 줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 4mL 액체 매체를 접종하고 선택한 박테리아에 허용되는 조건에서 성장한다. 여기서 대장균은 37°C에서 하룻밤 사이에 210rpm(16-18h)에서 흔들리며 재배된다.
3. 성장 곡선 설정
   1. 성장 플라스크 준비
      1. 오토클레이브 크기의 에를렌마이어 플라스크. 일반적으로 전체 플라스크 볼륨에 대한 미디어의 1:5 비율이 사용됩니다. 여기서, 100 mL LB 미디어는 500 mL 플라스크에 사용된다.
      2. 세로지학적 파이펫을 사용하여 멸균 매체를 Erlenmeyer 플라스크로 옮기세요.
   2. 희석 시리즈 준비
      1. 라벨 15 mL 테스트 튜브: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 및 -9, 각각9mL PBS를 배포. 이 숫자는 CFU/mL을 계산하는 데 사용되는 희석 계수에 해당합니다. 각 수집 타임포인트에는 새로운 튜브 세트가 필요합니다. (그림2)
   3. 마고 플레이트 준비
      1. 컬렉션 및 희석 계수의 시간 라벨 플레이트. 각 시간 지점에 대해 각 희석에 대해 하나의 플레이트가 있을 것입니다.
4. 성장 곡선 프로토콜
   1. 미디어 접종
      1. 2.2.2단계의 일환으로 준비된 야간 액체 배양을 사용하여 플라스크 미디어를 1:1000 배양으로 접종한다. 여기서, 100 μL 하룻밤 액체 배양은 100mL LB 배지에 첨가된다.
      2. 박테리아를 균등하게 분배하기 위해 미디어를 소용돌이시다.
   2. 타임포인트 컬렉션
      1. 성장 상태 설정
         1. 주어진 박테리아에 대 한 선택 된 실험 성장 조건에서 플라스크를 배치. 시간 포인트는 빠르게 성장하는 박테리아에 대 한 자주 취해야 하 고 느린 성장 박테리아에 대 한 긴 간격으로 촬영할 수 있습니다. 여기서 대장균은 분당 210회전(rpm)에서 흔들리며 37°C에서 재배되며, 1시간마다 타임포인트가 소요됩니다.
      2. 광학 밀도(OD600) 측정
         1. 시작 시점을 포함한 각 시점에서(t = 0) 세균 배양 1mL를 인출하고 분광계 큐벳으로 분배한다.
         2. 큐벳을 깨끗하게 닦고 600 nm 파장에서 광학 밀도를 기록합니다. 광학 밀도 판독값이 1.0보다 크면 900 μL 프레시 미디어로 1:10 배양 1:10을 희석하고, 광학 밀도를 기록하고, OD600 측정을 위해 이 값을 10으로 곱한다.
      3. 콜로니 성형 장치(CFU/mL) 측정
         1. 각 시점에서 세균 배양 1mL를 인출하고 PBS 9mL를 포함하는 -1 유리 시험 관에 분배한다.
         2. 희석 계열의 경우- -1 튜브에서 1mL를 모든 희석 튜브아래로 -9로 연속적으로 전송하고, 각 전송 후 소용돌이를 한다. (그림2)
         3. 각 희석에 대해, 그에 상응하는 라벨이 부착된 고체 미디어 천판에 셀 현탁액 100 μL을 분배한다. (그림2)
         4. 에탄올에서 살균된 셀 스프레더를 사용하여 분젠 버너 불꽃을 통과하고, 한천의 표면을 만져 냉각시키고, 천판표면이 건조해질 때까지 100μL의 셀 서스펜션을 확산한다.
         5. 박테리아의 성장을 지원하는 온도에서 스프레드 플레이트를 거꾸로 배양합니다. 여기서 대장균은 37°C에서 배양됩니다.
         6. 인큐베이션 후, 일단 눈에 보이는 식민지가 발생하면 각 판에 세균 성 식민지수를 계산하고 각 시점에서 모든 플레이트에 대한 관련 희석 계수와 함께 이러한 값을 기록합니다.

3. 데이터 분석 및 결과

1. 광학 밀도(OD600) 성장 곡선 플롯
   1. 광학 밀도(OD600)와 세미 로그 스케일의 시간을 플롯합니다. (그림3)
2. 콜로니 성형 유닛(CFU/mL) 성장 곡선 플롯
   1. 각 타임포인트에 대해, 식민지 수가 30-300 박테리아의 범위 내에 떨어졌다 희석 판을 선택합니다. 콜로니 카운트 수를 희석 계수별로 곱한 다음 100 μL 스프레드가 CFU/mL을 계산할 때 추가1:10 희석으로 간주됩니다.
      
   2. 콜로니 형성 유닛과 시간 대 반로그 스케일을 플롯합니다. (그림4)
3. 광학 밀도 및 식민지 형성 장치 관련
   1. OD600과 CFU/mL 사이의 관계가 1.0 OD600을 초과하여 덜 정확하기 때문에 OD600 판독값에 대한 선형 축척에서 콜로니 형성 유닛과 광학 밀도를 1.0 OD600 이상으로 플롯한다. 여기서 처음 여섯 개의 타임포인트가 플롯됩니다. (그림5)
   2. 방정식과 R² 값을 표시하는 선형 회귀 추세선을 생성합니다.
4. 박테리아 두 배 시간 결정
   1. 콜로니 형성 단위 성장 곡선 플롯을 사용하여, 기하급수적 단계 동안, 두 배의 시간을 계산하기 위해 그들 사이의 가파른 경사와 그래프에 두 점을 식별합니다.
   2. 두 배로 계산
      1. 
      2. ΔTime = t₂ - t_1,여기서 t₁ = 타임 포인트 1 및 t₂ = 시간 점 2
      3. , 여기서 b = t_2, B = 세대의 n = 수의 박테리아 수에서 박테리아의 수. 에서 파생 : .
      4. 다음을 사용하여 두 배의 시간을 계산합니다.