What are bacteriophages and how do they infect bacterial cells?

Bacteriophages, or phages, are viruses that specifically infect bacteria. They attach to the bacterial cell wall and inject their genetic material into the host. The phage then hijacks the cell's biosynthetic machinery to replicate its DNA and produce numerous progeny phage particles, which are released by lysing and killing the host cell.

Why is the plaque assay considered a reliable method for determining viral titer?

The plaque assay remains one of the most reliable methods for determining viral titer because it directly visualizes the lytic activity of phages. Each plaque represents a single infective phage particle that has infected and lysed multiple neighboring bacterial cells, creating a clear, countable zone. This amplification of lytic activity enables accurate enumeration of phage particles in a sample.

What is the purpose of using bacteria in log-phase growth for the plaque assay?

Bacteria in log-phase growth are actively dividing and have the highest viability, ensuring that a large percentage of cells are capable of forming a dense, confluent lawn on the agar plate. This dense bacterial lawn is essential for the plaque assay because it provides abundant host cells for phage infection and allows clear visualization of plaques as transparent zones against the turbid bacterial background.

How does the double agar layer technique work in a plaque assay?

The double agar layer technique uses a solid, concentrated bottom agar layer and a soft, low-concentration top agar layer containing bacteria and phage. The soft overlay allows phage particles to move locally and infect neighboring cells while restricting their movement to distant areas. This creates localized zones of cell lysis, producing visible plaques that can be counted to determine phage concentration.

Why are serial dilutions necessary before performing a plaque assay?

Phage titers vary exponentially across different samples and types, so serial dilutions generate a wide range of phage concentrations to ensure countable plaque numbers. Performing dilutions in triplicate provides statistically significant and accurate data. An ideal plaque count ranges from 10 to 150 plaques per plate, making dilutions essential for obtaining reliable results.

What does PFU stand for and how is it calculated from plaque counts?

PFU stands for Plaque-Forming Units, representing the number of infective phage particles in a sample. To calculate PFU per milliliter, divide the mean plaque count by the dilution factor, then multiply by 10 to account for the additional dilution from using only 100 microliters of phage mixture during overlay preparation. The final average PFU per milliliter corresponds to the number of infective phage particles in the original sample.

How can the plaque assay be used beyond viral enumeration?

Beyond quantifying phage titer, the plaque assay can characterize plaque morphology to aid in identification of different phage types and isolate phage mutants. Additionally, the resistance or sensitivity of bacterial strains to specific phages can be used for phage typing, dividing bacterial species into subgroups based on their susceptibility to different bacteriophages.

플라크 분석: 플라크 형성 단위(PFU)로서 바이러스 역가를 결정하는 방법

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1. 셋업

미생물과 관련된 작업을 시작하기 전에 작업 공간이 멸균되었는지 확인하십시오(예 : 70 %의 에탄올로 닦아). 항상 실험실 코트와 장갑을 착용하고 긴 머리를 다시 묶어 두며 상처가 특히 잘 보호되도록하십시오.
완료되면 모든 표면을 살균하고 손과 손목을 철저히 씻고 살균하십시오.

2. 프로토콜

LB 미디어 준비
참고: 숙주 세균균및 박테리오파지에 따라, 상이한 액체 배지는 숙주 세균균균또는 상이한 고체 배지의 초기 배양에 더 적합할 수 있다. 리소제니 국물 (LB)는 국물 및 한천에 대한이 프로토콜에 사용됩니다.
1. LB 국물, 단단한 바닥 한천 및 부드러운 상단 천에 대해 200 mL 증류수에 4 g LB를 혼합합니다. 모든 솔루션은 자동화하는 동안 오버플로를 방지하기 위해 최종 볼륨의 두 배를 보유할 수 있는 컨테이너에 준비해야 합니다.
  참고: 삼중에서 분석량을 수행하는 경우 LB 하단 한고의 양을 두 배로 준비하십시오.
2. 3가지 솔루션 모두의 pH를 NaOH 또는 HCl을 사용하여 7.4로 적절히 조정합니다.
3. 하단 한천 병에 3 g의 한천 파워를 추가하여 고체 한천용 1.5% 한천 용액을 만듭니다.
4. 상단 한천 병에 1.2 g의 한천 파워를 추가하여 부드러운 한천용 0.6% 한천 용액을 만듭니다.
5. 반조개한 캡을 장착한 병을 121°C로 설정된 오토클레이브에 20분 간 배치하여 솔루션을 살균합니다. 오염을 방지하기 위해 실행이 완료되자마자 캡을 닫습니다.
6. LB 미디어가 약 45-50°C의 온도에 도달하면 200mL LB 솔루션 중 세 가지 모두에 멸균 1 M CaCl_2의 450 μL을 추가하여 최종 농도가 2.25mMM입니다.
7. 고체 한천 배지의 15mL 알리쿼트를 멸균 페트리 접시에 붓고(발포를 방지하기 위해 흔들리지 않도록) 실온에서 몇 시간 또는 하룻밤 동안 고형화되도록한다(그림4A). 플레이트는 며칠 동안 4°C에서 거꾸로 보관할 수 있습니다.
숙주 세포의 배양
1. 분석 하기 하루 전에, LB 국물의 10 mL에 대장균 배양의 10 μL을 추가합니다.
2. 흔들리는 인큐베이터에서 160 rpm에서 하룻밤 사이에 37 °C에서 박테리아를 배양하십시오.
3. 분석의 아침, 신선한 LB의 10 mL에 하룻밤 문화의 0.5 mL을 추가합니다.
  참고: 삼중에서 분석체를 수행하는 경우 이 문화의 양을 두 배로 준비하십시오.
4. 세균 문화가 로그 상 성장에 될 때까지 흔들리는 인큐베이터에서 160 rpm에서 37 °C에서 배양하십시오. 이는 0.5-0.7의 OD600에 의해 분광성으로 결정될 수 있다.
5. 박테리아가 최고 LB 화창에 추가 될 때까지 실온에서 문화를 유지합니다.
박테리오파지의 10배 직렬 희석
1. LB 국물의 180μL을 7개의 우물에 넣고 96웰 플레이트에 넣습니다.
  참고: 통계적 신뢰성을 높이기 위해 삼중에서 희석을 수행하는 것이 좋습니다. 이렇게하려면 플레이트의 두 번째 및 세 번째 행에서 박테리오파지의 추가 희석을 준비하십시오.
2. 정중 하 게 균성을 보장 하 고 첫 번째 우물에 20 μL을 전송 하는 원래 박테리오파지 샘플을 소용돌이.
3. 피펫팅과 아래로 샘플을 잘 섞는다.
4. 결과 서스펜션의 20 μL을 두 번째 우물로 옮킨다.
5. 두 번째 우물에서 솔루션의 20 μL을 세 번째 우물로 옮기고, 여섯 째 우물까지, 일곱 번째우물까지, 7번째와 파지 서스펜션이 추가되지 않는 네거티브 컨트롤을 떠나서 직렬 희석을 계속한다. 이렇게 하면 희석 범위가 10^{-1 -1 -10}^-6입니다.
도금
1. 이름, 날짜 및 짧은 샘플 설명(파지 샘플 희석 계수 포함)과 함께 페트리 접시(이전에 2.1.7단계에서 준비)의 베이스를 레이블을 지정합니다. 분석 1시간 전에 37°C 인큐베이터로 페트리 요리를 예열합니다.
2. 고화된 부드러운 한천 매체(일반적으로 전자레인지를 사용하여 수행됨) 녹여고 고화된 한천이 85°C에서 녹아 약 45°C로 들어오게 합니다. 가열 된 매체는 적절한 온도에 도달하기 위해 ~ 1h에 대한 45 ° C 수조에 배치 할 수 있습니다. 그것은 액체 형태로 남아 있을 정도로 뜨거운 해야 한다, 하지만 추가 된 박테리아를 죽 이지 충분히 냉각.
3. 4mL 세균 배양(2.2단계에서)과 35mL LB 소프트 한천(45°C)을 혼합합니다. 세포를 균등하게 분배하지만 거품을 방지하기 위해 흔들리지 않도록 소용돌이(그림 4A).
4. 각 직렬 희석 단계에 대해 멸균 테스트 튜브 1개, 대조군 샘플에 대해 1개의 멸균 테스트 튜브에 라벨을 부착하여 총 7개의 라벨이 부착된 테스트 튜브에 라벨을 부착합니다. 세균 배양/부드러운 천 혼합물의 5mL 알리쿼트(aliquots)를 단계 2.4.3에서 7개의 튜브에 넣습니다. 이러한 소량의 한천 기반 매체가 실온에서 빠르게 고화되기 때문에 2.4.6 단계를 통해 신속하게 작업할 수 있습니다.
5. 제어 샘플의 100 μL(2.3단계)을 제어 테스트 튜브에 넣고 조심스럽게 소용돌이쳐냅니다. 사용된 파이펫 팁을 버리고 각 직렬 희석 된 박테리오파지 샘플 (단계 2.3)에서 동일한 볼륨을 각각의 시험 관으로 전송하여 혼합합니다.
6. 5mL 혼합물을 라벨, 예열, 고체 식천 판(도4A)에즉시 전달합니다. 접시를 부드럽게 소용돌이어 혼합물을 퍼뜨리기도 합니다.
  참고: 삼중에서 분석서를 수행하는 경우 2.4.3-6 단계를 두 번 더 반복하십시오.
7. 실험실 필름으로 각 플레이트를 밀봉하고, 두 층이 실온(약 15분)에서 제대로 고화되도록 허용한 후 37°C 인큐베이터를 상류로 배치하고, 박테리아와 파지의 성장을 자극하며, 24시간 동안 또는 플라크가 발달할 때까지, 일반적으로 플라크가 나타나기까지 는 보통 1~5일 정도걸립니다(그림 4B),그러나 중간 정도의 경우 는 상당히 다양하지만, 중간 정도의 조건은 상당히 다양합니다.

3. 데이터 분석 및 결과

플라크 계수
1. 바이러스 성 오염을 나타낼 수 있기 때문에 "제어"로 표시된 플레이트에 플라크가 표시되지 않도록하십시오.
2. 가장 희석된 박테리오파지 샘플을 포함하는^{10-6이라고}표시된 플레이트로 시작합니다. 뚜껑을 제거하지 않고 플라크를 계산하여 펜으로 표시하여 이미 계산된 플라크를 나타냅니다.
3. 나머지 플레이트를 계산합니다. 일부 플레이트에는 너무 적거나 너무 많은 플라크가 있을 수 있습니다. 추가 분석을 위해 10-150 플라크가 있는 플레이트를 사용합니다.
PFU 계산
1. 파지 혼합물의100 μL에서 플라크 성형 유닛(PFU)의 수를 얻기 위해 희석 계수(예: 가장 희석된 시료의 경우 10-6)로 플라크 수를 나눕니다.
  참고: 삼중판에서 분석체를 수행하는 경우 세 개의 플레이트에서 평균 플라크 수를 사용하십시오.
2. 원래 시료의 농도(PFU/mL)를 결정하기 위해, 10의 추가 희석계수에 곱하여 100μL의 시료만 도금하였다. (즉)
3. PFU/mL의 평균 값을 10에서 150플라크 사이에 있는 모든 희석에 대해 계산하여 보다 신뢰할 수 있는 결과를 얻습니다.

출처: 틸드 앤더슨^1,롤프 루드¹
¹ 임상 과학 룬드학과, 감염 의학 학과, 생물 의학 센터, 룬드 대학, 221 00 룬드, 스웨덴

박테리오파지 또는 단순히 파지에게 불린 대핵 생물을 감염시키는 바이러스는, Twort (1) 및 d'Hérelle (2)에 의해 20^세기…

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