플라크 분석: 플라크 형성 단위(PFU)로서 바이러스 역가를 결정하는 방법

1. 셋업

1. 미생물과 관련된 작업을 시작하기 전에 작업 공간이 멸균되었는지 확인하십시오(예 : 70 %의 에탄올로 닦아). 항상 실험실 코트와 장갑을 착용하고 긴 머리를 다시 묶어 두며 상처가 특히 잘 보호되도록하십시오.
2. 완료되면 모든 표면을 살균하고 손과 손목을 철저히 씻고 살균하십시오.

2. 프로토콜

1. LB 미디어 준비
   참고: 숙주 세균균및 박테리오파지에 따라, 상이한 액체 배지는 숙주 세균균균또는 상이한 고체 배지의 초기 배양에 더 적합할 수 있다. 리소제니 국물 (LB)는 국물 및 한천에 대한이 프로토콜에 사용됩니다.
   1. LB 국물, 단단한 바닥 한천 및 부드러운 상단 천에 대해 200 mL 증류수에 4 g LB를 혼합합니다. 모든 솔루션은 자동화하는 동안 오버플로를 방지하기 위해 최종 볼륨의 두 배를 보유할 수 있는 컨테이너에 준비해야 합니다.
      참고: 삼중에서 분석량을 수행하는 경우 LB 하단 한고의 양을 두 배로 준비하십시오.
   2. 3가지 솔루션 모두의 pH를 NaOH 또는 HCl을 사용하여 7.4로 적절히 조정합니다.
   3. 하단 한천 병에 3 g의 한천 파워를 추가하여 고체 한천용 1.5% 한천 용액을 만듭니다.
   4. 상단 한천 병에 1.2 g의 한천 파워를 추가하여 부드러운 한천용 0.6% 한천 용액을 만듭니다.
   5. 반조개한 캡을 장착한 병을 121°C로 설정된 오토클레이브에 20분 간 배치하여 솔루션을 살균합니다. 오염을 방지하기 위해 실행이 완료되자마자 캡을 닫습니다.
   6. LB 미디어가 약 45-50°C의 온도에 도달하면 200mL LB 솔루션 중 세 가지 모두에 멸균 1 M CaCl_2의 450 μL을 추가하여 최종 농도가 2.25mMM입니다.
   7. 고체 한천 배지의 15mL 알리쿼트를 멸균 페트리 접시에 붓고(발포를 방지하기 위해 흔들리지 않도록) 실온에서 몇 시간 또는 하룻밤 동안 고형화되도록한다(그림4A). 플레이트는 며칠 동안 4°C에서 거꾸로 보관할 수 있습니다.
2. 숙주 세포의 배양
   1. 분석 하기 하루 전에, LB 국물의 10 mL에 대장균 배양의 10 μL을 추가합니다.
   2. 흔들리는 인큐베이터에서 160 rpm에서 하룻밤 사이에 37 °C에서 박테리아를 배양하십시오.
   3. 분석의 아침, 신선한 LB의 10 mL에 하룻밤 문화의 0.5 mL을 추가합니다.
      참고: 삼중에서 분석체를 수행하는 경우 이 문화의 양을 두 배로 준비하십시오.
   4. 세균 문화가 로그 상 성장에 될 때까지 흔들리는 인큐베이터에서 160 rpm에서 37 °C에서 배양하십시오. 이는 0.5-0.7의 OD600에 의해 분광성으로 결정될 수 있다.
   5. 박테리아가 최고 LB 화창에 추가 될 때까지 실온에서 문화를 유지합니다.
3. 박테리오파지의 10배 직렬 희석
   1. LB 국물의 180μL을 7개의 우물에 넣고 96웰 플레이트에 넣습니다.
      참고: 통계적 신뢰성을 높이기 위해 삼중에서 희석을 수행하는 것이 좋습니다. 이렇게하려면 플레이트의 두 번째 및 세 번째 행에서 박테리오파지의 추가 희석을 준비하십시오.
   2. 정중 하 게 균성을 보장 하 고 첫 번째 우물에 20 μL을 전송 하는 원래 박테리오파지 샘플을 소용돌이.
   3. 피펫팅과 아래로 샘플을 잘 섞는다.
   4. 결과 서스펜션의 20 μL을 두 번째 우물로 옮킨다.
   5. 두 번째 우물에서 솔루션의 20 μL을 세 번째 우물로 옮기고, 여섯 째 우물까지, 일곱 번째우물까지, 7번째와 파지 서스펜션이 추가되지 않는 네거티브 컨트롤을 떠나서 직렬 희석을 계속한다. 이렇게 하면 희석 범위가 10^{-1 -1 -10-6입니다.}
4. 도금
   1. 이름, 날짜 및 짧은 샘플 설명(파지 샘플 희석 계수 포함)과 함께 페트리 접시(이전에 2.1.7단계에서 준비)의 베이스를 레이블을 지정합니다. 분석 1시간 전에 37°C 인큐베이터로 페트리 요리를 예열합니다.
   2. 고화된 부드러운 한천 매체(일반적으로 전자레인지를 사용하여 수행됨) 녹여고 고화된 한천이 85°C에서 녹아 약 45°C로 들어오게 합니다. 가열 된 매체는 적절한 온도에 도달하기 위해 ~ 1h에 대한 45 ° C 수조에 배치 할 수 있습니다. 그것은 액체 형태로 남아 있을 정도로 뜨거운 해야 한다, 하지만 추가 된 박테리아를 죽 이지 충분히 냉각.
   3. 4mL 세균 배양(2.2단계에서)과 35mL LB 소프트 한천(45°C)을 혼합합니다. 세포를 균등하게 분배하지만 거품을 방지하기 위해 흔들리지 않도록 소용돌이(그림 4A).
   4. 각 직렬 희석 단계에 대해 멸균 테스트 튜브 1개, 대조군 샘플에 대해 1개의 멸균 테스트 튜브에 라벨을 부착하여 총 7개의 라벨이 부착된 테스트 튜브에 라벨을 부착합니다. 세균 배양/부드러운 천 혼합물의 5mL 알리쿼트(aliquots)를 단계 2.4.3에서 7개의 튜브에 넣습니다. 이러한 소량의 한천 기반 매체가 실온에서 빠르게 고화되기 때문에 2.4.6 단계를 통해 신속하게 작업할 수 있습니다.
   5. 제어 샘플의 100 μL(2.3단계)을 제어 테스트 튜브에 넣고 조심스럽게 소용돌이쳐냅니다. 사용된 파이펫 팁을 버리고 각 직렬 희석 된 박테리오파지 샘플 (단계 2.3)에서 동일한 볼륨을 각각의 시험 관으로 전송하여 혼합합니다.
   6. 5mL 혼합물을 라벨, 예열, 고체 식천 판(도4A)에즉시 전달합니다. 접시를 부드럽게 소용돌이어 혼합물을 퍼뜨리기도 합니다.
      참고: 삼중에서 분석서를 수행하는 경우 2.4.3-6 단계를 두 번 더 반복하십시오.
   7. 실험실 필름으로 각 플레이트를 밀봉하고, 두 층이 실온(약 15분)에서 제대로 고화되도록 허용한 후 37°C 인큐베이터를 상류로 배치하고, 박테리아와 파지의 성장을 자극하며, 24시간 동안 또는 플라크가 발달할 때까지, 일반적으로 플라크가 나타나기까지 는 보통 1~5일 정도걸립니다(그림 4B),그러나 중간 정도의 경우 는 상당히 다양하지만, 중간 정도의 조건은 상당히 다양합니다.

3. 데이터 분석 및 결과

1. 플라크 계수
   1. 바이러스 성 오염을 나타낼 수 있기 때문에 "제어"로 표시된 플레이트에 플라크가 표시되지 않도록하십시오.
   2. 가장 희석된 박테리오파지 샘플을 포함하는^{10-6이라고}표시된 플레이트로 시작합니다. 뚜껑을 제거하지 않고 플라크를 계산하여 펜으로 표시하여 이미 계산된 플라크를 나타냅니다.
   3. 나머지 플레이트를 계산합니다. 일부 플레이트에는 너무 적거나 너무 많은 플라크가 있을 수 있습니다. 추가 분석을 위해 10-150 플라크가 있는 플레이트를 사용합니다.
2. PFU 계산
   1. 파지 혼합물의100 μL에서 플라크 성형 유닛(PFU)의 수를 얻기 위해 희석 계수(예: 가장 희석된 시료의 경우 10-6)로 플라크 수를 나눕니다.
      참고: 삼중판에서 분석체를 수행하는 경우 세 개의 플레이트에서 평균 플라크 수를 사용하십시오.
   2. 원래 시료의 농도(PFU/mL)를 결정하기 위해, 10의 추가 희석계수에 곱하여 100μL의 시료만 도금하였다. (즉)
   3. PFU/mL의 평균 값을 10에서 150플라크 사이에 있는 모든 희석에 대해 계산하여 보다 신뢰할 수 있는 결과를 얻습니다.