How does a bacteriophage transfer DNA between bacterial cells?

A bacteriophage attaches to a bacterial cell surface and injects its DNA, then replicates its genome while hijacking the host's machinery. Due to low-fidelity DNA packaging, the phage occasionally packages bacterial DNA fragments into its capsid. When this phage infects another cell, it transfers the bacterial DNA, which can recombine and integrate into the new host's chromosome, mediating gene transfer between bacteria.

What are the key requirements for performing phage transduction in the laboratory?

Phage transduction requires a donor strain containing the gene of interest, a recipient strain lacking it, a phage capable of infecting both strains, and a selective growth media that supports transduced bacteria while inhibiting non-transduced ones. The selective media is essential for screening and identifying which bacterial cells successfully received the transferred genetic material.

Why is chloroform added to the phage lysate during preparation?

Chloroform is added to the phage lysate to inhibit bacterial growth and preserve the phage particles. After centrifugation removes debris, the supernatant containing phage is treated with chloroform and stored at four degrees Celsius for no more than one day, ensuring the phage remains viable for the transduction procedure.

What role do magnesium sulfate and calcium chloride play in transduction?

Magnesium sulfate and calcium chloride are added to the recipient strain suspension to enhance phage attachment and DNA transfer efficiency. These divalent cations stabilize the phage-bacterial cell interaction, increasing the likelihood of successful transduction by promoting optimal conditions for DNA uptake by recipient cells.

How does qPCR confirm successful transduction of the ampicillin resistance gene?

qPCR measures cycle quantification (Cq) values for the ampicillin resistance gene and a housekeeping gene. Low Cq values below 29 cycles indicate high target sequence amounts in transduced samples. Delta Cq values normalize results against the housekeeping gene, and normalized transduction efficiency is calculated to confirm the gene transfer occurred in recipient cells.

What is the purpose of the negative control in phage transduction experiments?

The negative control combines recipient strain with LB medium containing magnesium sulfate and calcium chloride, but without phage lysate. This control undergoes identical steps as the transduction reaction, allowing researchers to verify that any ampicillin resistance detected in transduced samples resulted from phage-mediated gene transfer, not contamination or spontaneous resistance.

Why is sodium citrate used during the transduction procedure?

Sodium citrate is added after the one-hour incubation period to chelate divalent cations and halt phage-mediated DNA transfer. This stops the transduction reaction at a defined time point, preventing continued gene transfer and allowing researchers to accurately assess the efficiency of the transduction event that occurred during the incubation window.

파지 형질도입: 공여 E.coli에서 수용 E.coli로 암피실린 내성을 전달하는 방법

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1. 셋업

미생물과 관련된 작업을 시작하기 전에 70 %의 에탄올을 사용하여 작업 공간을 살균하십시오. 항상 필요한 PPE (실험실 코트와 장갑)를 사용합니다.
1x 암피실린, 시판 가능한 P1 파지 용액, 클로로폼, 1M 나트륨 구산염, 글리세롤, 미리 멸균된 플라스틱 파이펫 팁 및 셀 스프레더 상자가 있는 LB agar 플레이트가 가까이 에 있는지 확인하십시오.
오토클레이브를 사용하여 멸균 LB를 준비하고 이를 사용하여 LB 소금 용액 의 3mL 알리쿼트 3개 만들기에 사용하십시오.
1. mM MgCl₂ (952.11-2.3803 μg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg), 0.1-0.2 % 포도당 (100-200 μg)
2. mM MgSO₄ (12.0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg)
3. mM 나트륨 구연산나트륨 (25.806 mg)
완성되면 모든 표면과 장갑을 70% 에탄올로 살균하고 손을 씻으실 수 있습니다.

2. 프로토콜

기증자 파지 리세테 준비
1. 1mL 의 기증자 W3110 균주 대장균을 LB에서 1x 암피실린으로 37°C에서 하룻밤 동안 재배하고 220 rpm에서 흔들어 줍니다.
2. 이 하룻밤 문화를 희석 1:100 신선한 LB의 1 mL에 10-25 mM MgCl_2,5 mM CaCl_2,그리고 0.1-0.2% 포도당.
3. 이 세균 희석을 37°C에서 2시간 동안 증가시키고 220rpm에서 흔들어 보입니다.
4. 이러한 세포가 초기 로그산학 성장 단계(눈에 띄는 성장과 약간의 탁도)에 도달하면, 시판되는 P1 파지의 40μL을 추가하고 37°C에서 폭기와 220 rpm에서 흔들어 둡니다.
  1. 파지 첨가 전에, 이들 세포의 600 nm에서 측정된 광학 밀도는 약 0.4(6)여야 한다.
5. 배양이 용해 될 때까지 1-3 시간 동안 셀을 모니터링합니다.
  1. Lysis는 세포 이물질이 증가하고 탁도가 현저한 감소(즉, 세포가 배양을 통해 볼 수 있게 되면 lysed 것으로 간주됩니다).
6. 용액에 클로로폼의 여러 방울 (50-100 μL)을 추가하고 소용돌이에 의해 혼합합니다.
  1. 클로로폼은 남은 기증자 세포를 죽이고 파지만 남기고 이 리세이트의 티터를 증가시킴으로써 파지 리세이스를 살균합니다.
7. 원심분리기는 14,000rpm에 2분 동안 이물질을 제거하고 상퍼를 신선한 튜브로 이송합니다.
8. 클로로폼 몇 방울을 넣고 4°C에 보관하여 하루 이상 보관하십시오.
변환
1. 37°C에서 LB에서 하룻밤 재배한 수취인 J53 균주 대장균의 1mL 배양을 준비하여 220 rpm에서 흔들어 줍니다.
2. 기증자 파지 용해(2.1)의 100 μL을 1.5mL 마이크로퍼지 튜브로 옮기고 30분 동안 37°C에서 캡을 열어 배양합니다.
  1. 이 배양은 수신자 세포에 추가되기 전에 증발하는 P1 lysate 용액에 있는 모든 나머지 클로로폼을 허용합니다.
3. 부드럽게 펠릿 받는 사람 변형 세포에 의해 원심 분리에 의해 6,000 rpm 에 5 분.
4. 이러한 세포를 100m MgSO₄ 및 5mM CaCl_2를함유한 신선한 LB300 μL에서 재보중단한다. (P1 파지는 전염성이 있어야 합니다).
5. 수신자 박테리아 세포를 사용하여 2개의 반응을 설정하고 준비된 기증자 파지 용액: 1) 100 μL 수신자 J53 균주 E. 대장균과 100 μL 기증자 파지 용해, 및 2) 100 μL 수신자 J53 균주 E. 대장균 및100 μL의 LB를 포함하는 100 μL 감산 염기 및 100 μL를 결합한 음성 대조군
6. 37°C에서 30분간 인큐베이션을 하고 220rpm에서 흔들리면 됩니다.
7. 1mL LB 와 200 μL 1M 나트륨 구연산나트륨(pH=5.5)을 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양하고 220rpm에서 흔들어 앉습니다.
  1. 체연산은 칼슘으로 다수화하여 P1의 감염성을 감소시켜 받는 박테리아의 용해를 방지하는 데 사용됩니다.
  2. 이 용액의 배큐어는 암피실린 저항 마커의 발현을 허용한다.
8. 펠릿 세포는 5 분 동안 6,000 rpm에서 원심 분리에 의해 세포.
9. 100mM 나트륨 구연산염(pH 5.5)으로 LB의 100 μL에서 세포 펠릿을 재중단한다. 두 LB 천 플레이트에 대한 두 반응에 대한 소용돌이 및 플레이트 전체 용액.
  1. LB 플레이트는 변환된 샘플에 대해 1x Amp가 있어야 하며 음수 제어를 위한 앰프가 없어야 합니다.
  2. 이 플레이트의 P1 파지 오염은 냉동고 재고를 준비하기 전에 다시 줄무늬가 필요합니다.
  3. 파지를 제거하지 않으면, 칼슘 첼라토르가 없는 한, 이러한 식민지에서 자란 문화는 성장하지 않을 것입니다.
10. 플레이트에서 약 3-4개의 콜로니를 선택하고 구연산나트륨 1M의 100 μL(pH=5.5)로 확산되는 두 개의 LB 한천 판에 다시 줄무늬를 선택합니다.
  1. LB 플레이트는 변환된 샘플에 대해 1x Amp가 있어야 하며 음수 제어를 위한 앰프가 없어야 합니다.
11. 파지가 없는 식민지가 성장할 수 있도록 하룻밤 사이에 37°C의 플레이트를 배양합니다.
12. 두 접시에서 식민지를 선택하고 폭기와 함께 37 °C에서 LB의 5 mL에서 하룻밤 문화를 성장하고 220 rpm에서 흔들어 그들을 사용합니다.
13. 총 배양량의 4.5mL를 사용하여 DNA 미니프렙에 의해 이러한 배양으로부터 DNA를 분리한다.
  1. 뉴클레아제없는 물의 35 μL을 사용하여 엘루트 DNA.
  2. 나노 드롭에 의해 결과 농도를 측정합니다. 순수 DNA는 약 1.8의 흡광도 비(A_260/280)를생성합니다.
14. 100% 글리세롤과 세균 배양의 1:1 혼합물을 만들어 1mL 글리세롤 주식을 제조하기 위해 각 배양의 나머지 0.5 mL을 사용한다.
15. 세균글리세롤 재고를 -80°C에 저장합니다.

3. 데이터 분석 및 결과

qPCR에 의한 트랜스듀스 확인
1. 6qPCR 반응에 대한 2개의 qPCR 마스터 믹스, 암피실린 저항 유전자에 대한 qPCR 프라이머를 사용하는 3개, 다른 3개들은 가사 유전자에 대한 qPCR 프라이머(반응당 14.5 μL): 12.5 μL qPCR 버퍼 믹스 + 1 μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1
  1. 이 실험에서, 우리는 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용했다.
  2. 가사 유전자 프라이머는 DNA 자이라제 B (7)에 대한 인코딩 세균 유전자 내의 DNA 세그먼트를 증폭하도록 설계되었습니다.
2. 각 qPCR 반응에 대해 각 반응(10.5 μL)에서 100 μg의 DNA를 qPCR 마스터 믹스의 14.5 μL로 결합합니다.
3. 표 1에 나열된 qPCR 기계 및 써모사이클링 프로토콜을 사용하여, 증폭은 6개의 반응 모두에 대한 암피실린 저항성 및 하우스키핑 유전자를 위해 측정되었다.
4. qPCR에 의해 생성된 Cq 값은 암피실린 저항 유전자(도 3)의 정규화된 트랜스듀션 효율을 계산하기 위해 사용되었고, 암피실린 저항 유전자의 성공적인 트랜스듀션을 확인시켰다.
  1. 샘플의 Cq 값 또는 사이클 정량화 값은 신호가 백그라운드 임계값을 초과한 초기 PCR 사이클 번호입니다. 낮은 Cq 값은 더 많은 대상 시퀀스에 해당하며, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
  2. 시료 내 유전자의 정규화된 트랜스듀션 효율은 표적 유전자로부터 가사유전자의 값을 빼서 이러한 Cq 값을 사용하여 계산할 수 있으며, ΔCq 값을 생성하여 정규화된 트랜스듀션 효율을^2(-ΔCq)로계산하는 데 사용될 수 있다.

	온도	시간
변성	94 °C	2분
40 사이클:
변성	94 °C	15초
아닐링, 확장 및 형광 읽기	최저 프라이머_Tm 아래 60°C 또는 5°C	1분

표 1: qPCR 써모사이클링 프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: 알렉산더 S. 골드¹, 토냐 M. 콜핏스¹
¹ 미생물학학과, 보스턴 대학교 의과대학, 국립 신흥 감염 질병 연구소, 보스턴, MA

트랜스듀션은 박테리아 간의 유전적 교류의 한 형태로, 배니오파지 또는 파지, 독점적으로 대핵 생물을 감염시키는 바이러스의 종류입니다.…

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