파지 형질도입: 공여 E.coli에서 수용 E.coli로 암피실린 내성을 전달하는 방법

1. 셋업

1. 미생물과 관련된 작업을 시작하기 전에 70 %의 에탄올을 사용하여 작업 공간을 살균하십시오. 항상 필요한 PPE (실험실 코트와 장갑)를 사용합니다.
2. 1x 암피실린, 시판 가능한 P1 파지 용액, 클로로폼, 1M 나트륨 구산염, 글리세롤, 미리 멸균된 플라스틱 파이펫 팁 및 셀 스프레더 상자가 있는 LB agar 플레이트가 가까이 에 있는지 확인하십시오.
3. 오토클레이브를 사용하여 멸균 LB를 준비하고 이를 사용하여 LB 소금 용액 의 3mL 알리쿼트 3개 만들기에 사용하십시오.
   1. mM MgCl₂ (952.11-2.3803 μg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg), 0.1-0.2 % 포도당 (100-200 μg)
   2. mM MgSO₄ (12.0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mg)
   3. mM 나트륨 구연산나트륨 (25.806 mg)
4. 완성되면 모든 표면과 장갑을 70% 에탄올로 살균하고 손을 씻으실 수 있습니다.

2. 프로토콜

1. 기증자 파지 리세테 준비
   1. 1mL 의 기증자 W3110 균주 대장균을 LB에서 1x 암피실린으로 37°C에서 하룻밤 동안 재배하고 220 rpm에서 흔들어 줍니다.
   2. 이 하룻밤 문화를 희석 1:100 신선한 LB의 1 mL에 10-25 mM MgCl_2,5 mM CaCl_2,그리고 0.1-0.2% 포도당.
   3. 이 세균 희석을 37°C에서 2시간 동안 증가시키고 220rpm에서 흔들어 보입니다.
   4. 이러한 세포가 초기 로그산학 성장 단계(눈에 띄는 성장과 약간의 탁도)에 도달하면, 시판되는 P1 파지의 40μL을 추가하고 37°C에서 폭기와 220 rpm에서 흔들어 둡니다.
      1. 파지 첨가 전에, 이들 세포의 600 nm에서 측정된 광학 밀도는 약 0.4(6)여야 한다.
   5. 배양이 용해 될 때까지 1-3 시간 동안 셀을 모니터링합니다.
      1. Lysis는 세포 이물질이 증가하고 탁도가 현저한 감소(즉, 세포가 배양을 통해 볼 수 있게 되면 lysed 것으로 간주됩니다).
   6. 용액에 클로로폼의 여러 방울 (50-100 μL)을 추가하고 소용돌이에 의해 혼합합니다.
      1. 클로로폼은 남은 기증자 세포를 죽이고 파지만 남기고 이 리세이트의 티터를 증가시킴으로써 파지 리세이스를 살균합니다.
   7. 원심분리기는 14,000rpm에 2분 동안 이물질을 제거하고 상퍼를 신선한 튜브로 이송합니다.
   8. 클로로폼 몇 방울을 넣고 4°C에 보관하여 하루 이상 보관하십시오.
2. 변환
   1. 37°C에서 LB에서 하룻밤 재배한 수취인 J53 균주 대장균의 1mL 배양을 준비하여 220 rpm에서 흔들어 줍니다.
   2. 기증자 파지 용해(2.1)의 100 μL을 1.5mL 마이크로퍼지 튜브로 옮기고 30분 동안 37°C에서 캡을 열어 배양합니다.
      1. 이 배양은 수신자 세포에 추가되기 전에 증발하는 P1 lysate 용액에 있는 모든 나머지 클로로폼을 허용합니다.
   3. 부드럽게 펠릿 받는 사람 변형 세포에 의해 원심 분리에 의해 6,000 rpm 에 5 분.
   4. 이러한 세포를 100m MgSO₄ 및 5mM CaCl_2를함유한 신선한 LB300 μL에서 재보중단한다. (P1 파지는 전염성이 있어야 합니다).
   5. 수신자 박테리아 세포를 사용하여 2개의 반응을 설정하고 준비된 기증자 파지 용액: 1) 100 μL 수신자 J53 균주 E. 대장균과 100 μL 기증자 파지 용해, 및 2) 100 μL 수신자 J53 균주 E. 대장균 및100 μL의 LB를 포함하는 100 μL 감산 염기 및 100 μL를 결합한 음성 대조군
   6. 37°C에서 30분간 인큐베이션을 하고 220rpm에서 흔들리면 됩니다.
   7. 1mL LB 와 200 μL 1M 나트륨 구연산나트륨(pH=5.5)을 넣고 37°C에서 1시간 동안 배양하고 220rpm에서 흔들어 앉습니다.
      1. 체연산은 칼슘으로 다수화하여 P1의 감염성을 감소시켜 받는 박테리아의 용해를 방지하는 데 사용됩니다.
      2. 이 용액의 배큐어는 암피실린 저항 마커의 발현을 허용한다.
   8. 펠릿 세포는 5 분 동안 6,000 rpm에서 원심 분리에 의해 세포.
   9. 100mM 나트륨 구연산염(pH 5.5)으로 LB의 100 μL에서 세포 펠릿을 재중단한다. 두 LB 천 플레이트에 대한 두 반응에 대한 소용돌이 및 플레이트 전체 용액.
      1. LB 플레이트는 변환된 샘플에 대해 1x Amp가 있어야 하며 음수 제어를 위한 앰프가 없어야 합니다.
      2. 이 플레이트의 P1 파지 오염은 냉동고 재고를 준비하기 전에 다시 줄무늬가 필요합니다.
      3. 파지를 제거하지 않으면, 칼슘 첼라토르가 없는 한, 이러한 식민지에서 자란 문화는 성장하지 않을 것입니다.
   10. 플레이트에서 약 3-4개의 콜로니를 선택하고 구연산나트륨 1M의 100 μL(pH=5.5)로 확산되는 두 개의 LB 한천 판에 다시 줄무늬를 선택합니다.
       1. LB 플레이트는 변환된 샘플에 대해 1x Amp가 있어야 하며 음수 제어를 위한 앰프가 없어야 합니다.
   11. 파지가 없는 식민지가 성장할 수 있도록 하룻밤 사이에 37°C의 플레이트를 배양합니다.
   12. 두 접시에서 식민지를 선택하고 폭기와 함께 37 °C에서 LB의 5 mL에서 하룻밤 문화를 성장하고 220 rpm에서 흔들어 그들을 사용합니다.
   13. 총 배양량의 4.5mL를 사용하여 DNA 미니프렙에 의해 이러한 배양으로부터 DNA를 분리한다.
       1. 뉴클레아제없는 물의 35 μL을 사용하여 엘루트 DNA.
       2. 나노 드롭에 의해 결과 농도를 측정합니다. 순수 DNA는 약 1.8의 흡광도 비(A_260/280)를생성합니다.
   14. 100% 글리세롤과 세균 배양의 1:1 혼합물을 만들어 1mL 글리세롤 주식을 제조하기 위해 각 배양의 나머지 0.5 mL을 사용한다.
   15. 세균글리세롤 재고를 -80°C에 저장합니다.

3. 데이터 분석 및 결과

1. qPCR에 의한 트랜스듀스 확인
   1. 6qPCR 반응에 대한 2개의 qPCR 마스터 믹스, 암피실린 저항 유전자에 대한 qPCR 프라이머를 사용하는 3개, 다른 3개들은 가사 유전자에 대한 qPCR 프라이머(반응당 14.5 μL): 12.5 μL qPCR 버퍼 믹스 + 1 μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1μL 포워드 프라이머 + 1
      1. 이 실험에서, 우리는 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용했다.
      2. 가사 유전자 프라이머는 DNA 자이라제 B (7)에 대한 인코딩 세균 유전자 내의 DNA 세그먼트를 증폭하도록 설계되었습니다.
   2. 각 qPCR 반응에 대해 각 반응(10.5 μL)에서 100 μg의 DNA를 qPCR 마스터 믹스의 14.5 μL로 결합합니다.
   3. 표 1에 나열된 qPCR 기계 및 써모사이클링 프로토콜을 사용하여, 증폭은 6개의 반응 모두에 대한 암피실린 저항성 및 하우스키핑 유전자를 위해 측정되었다.
   4. qPCR에 의해 생성된 Cq 값은 암피실린 저항 유전자(도 3)의 정규화된 트랜스듀션 효율을 계산하기 위해 사용되었고, 암피실린 저항 유전자의 성공적인 트랜스듀션을 확인시켰다.
      1. 샘플의 Cq 값 또는 사이클 정량화 값은 신호가 백그라운드 임계값을 초과한 초기 PCR 사이클 번호입니다. 낮은 Cq 값은 더 많은 대상 시퀀스에 해당하며, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
      2. 시료 내 유전자의 정규화된 트랜스듀션 효율은 표적 유전자로부터 가사유전자의 값을 빼서 이러한 Cq 값을 사용하여 계산할 수 있으며, ΔCq 값을 생성하여 정규화된 트랜스듀션 효율을^2(-ΔCq)로계산하는 데 사용될 수 있다.

	온도	시간
변성	94 °C	2분
40 사이클:
변성	94 °C	15초
아닐링, 확장 및 형광 읽기	최저 프라이머Tm 아래 60°C 또는 5°C	1분

표 1: qPCR 써모사이클링 프로토콜