Name: 세포 생물학을위한 단백질의 Microcontact 인쇄 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 학습하세요 세포 생물학 연구를 위한 마이크로콘택트 프린팅 기법으로 fibronectin 단백질을 유리 표면에 패턴화하는 방법을 배우세요. 이 기술은 세포 부착 환경을 조성하여 세포 외 환경에서 세포 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

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1. 솔루션 및 자료 준비 이러한 단계는 사전에 몇 일 실시하여야한다. <ol><li> 유리 coverslips. 지우지 감동과 함께 3 비율 및 온수 : 물, 1 혼합 : Coverslips는 Linbro 7X 세제의 솔루션으로 10 분 동안 침지하여 세척했다. Coverslips는 탈이온수와 함께 광범위하게 씻어서 후 6 시간 동안 450 ° C에서 구워되었습니다. 세라믹 얼룩 랙에에 coverslips을로드하면 (시약 참조)이 과정을 단순화. </li><li> 스탬프에 대한 단백질 솔루션입니다. 1 MG / ML 농도의 주식 솔루션 제조 업체의 지침에 따라 Reconstitute의 fibronectin. </li></ol> 2. topological 마스터에서 우표를 캐스트 이러한 단계는 사전에 몇 일 실시 수 있습니다. 이러한 조직 문화 요리로 덮여 접시에 저장 우표 패턴 업. <ol><li> 압축, 여과 공기 또는 불활성 가스의 흐름을 사용하여 마스터에서 느슨한 먼지를 제거합니다. </li><li> 주인보다 단지 큰 플라스틱 접시의 바닥에, 마스터, 패턴 측면을 놓으십시오. 60 - 또는 100 - mm 조직 문화 요리가 잘 이러한 목적에 적합합니다. </li><li> 폴리스티렌 50 ML의 원심 관에서 치료 요원의 비율로 Sylgard 구성 요소를 결합 : 1 엘라스토머 기지 : 10 무게로. 같은 일회용 피펫으로 플라스틱 장치를 사용하여 철저히 섞는다. 요리 지역의 cm2 당 탄성체 최소한 0.2 ML를 준비합니다. </li><li> 공기 방울을 제거하는 5 분 300 G에서 50 ML 튜브를 원심 분리기. </li><li> 주인 위로 탄성체를 부어 후 30 분, 진공에서 건조기에서 개최. </li><li> 65 ° C 이상에서 2 시간 동안 오븐에 탄성 치료. 높은 온도에서와 stiffer 탄성체에 더 이상 시간이 결과에 대한 치료. 실온으로 냉각하자. </li><li> 마스터에서 우표의 시트를 분리합니다. </li></ol> 3. 유리에 fibronectin의 Microcontact 인쇄 <ol><li> 하나의 스탬프를 잘라 버릴거야. 4mm을 측정하는 우표는 X 4mm 1cm로 X 1 지역 cm 및 1~2mm 두께로 시작하는 가장 쉬운 방법입니다. 유리 슬라이드 또는 작은 플라스틱 접시에 장소 패턴 측면까지. </li><li> 30 초 동안, 진공에서 플라즈마 청소기, 그리고 과정에서 스탬프를 배치합니다. 가장 높은 출력 설정에서 설정 Harrick 과학 플라즈마 청소기 (장비 참조), PDMS 표면이 친수성 ​​렌더링됩니다. 탄성체의 균열에서 긴 시간 결과. </li><li> 탈이온수와 50 μg / ML의 스탬핑 농도에 fibronectin 솔루션을 희석. </li><li> 우표에 대한 솔루션을 스탬프의 - 작은 방울 (50 μl 10) 장소. 이것은 친수성 ​​표면에 걸쳐 분산됩니다. 드롭이 우표를 다루고 있지만, 가장자리를 통해 실행되지 않는 유일한 충분한 솔루션을 추가합니다. 5 분 스탬프로 단백질 adsorb하자. </li><li> Kimwipe의 ® 또는 기타 깨끗한 종이 티슈를 사용하여 패턴 영역을 건드리지 않고, 우표에서 단백질 솔루션의 대부분을 날려 심지. </li><li> 같은 질소로 깨끗하고, 건조, 불활성 가스의 흐름에 따라 우표의 나머지 솔루션을 건조. </li><li> 족집게를 사용하면, 유리 슬라이드에서 우표를 제거 반전하고, 청소 유리 coverslip (표면 패턴 예정)와 접촉 곳입니다. 좋은 접촉을 촉진하기 위해 상단에 무게를 넣으십시오. 최고의 patterning을 제공합니다 구체적인 무게는 우표 크기와 패턴에 따라 달라집니다, 5g의 무게로 시작하고, stampings 간의 조정합니다. 일분에 대한 표면과 접촉 스탬프 둡니다. </li><li> 조심스럽게 스택을 분해하고, coverslip에서 별도의 도장. </li><li> 적극적으로 표면에 adsorbed되지 않습니다 단백질을 제거하는 탈이온수 다음 PBS의 패턴 coverslip을, 린스. 질소 기류 하에서 건조 coverslip. </li></ol> 대표 결과 Microcontact 인쇄 표면에 patterning 분자위한 강력한 프로세스입니다. 그림,이 과정은 micrometers 수십에서 수백 나노미터에 이르기까지 다양한 크기와 기능을 만들 수있는 능력이 있습니다. 녹색 반점이 그림 삽화가 동안 1A, 왼쪽에있는 로고, 높이 각 200 μm의 수 있습니다. 1B는 직경 1 μm의 있으며 가운데에 중심을 측정 4 μm의 간격에서 간격. 그림. 1B 또한 강력한 그것입니다 즉 microcontact 인쇄의 속성 및 첨가제 과정을 보여줍니다. microcontact 인쇄 여러 라운드는 복수 시스템 3 만드는 하나의 표면에 적용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/Figure_a.jpg" alt="그림" /><img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" alt="그림 B" />

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

microcontact 인쇄 과정은 patterning 기판의 다양한 분자의 광범위한 적용을 받으면, 개념 간단하고 매우 견고합니다. 그러나,이 과정은 예술의 무언가 남아있다. 만들 수있는 패턴의 특정 기하학이 단백질 패턴으로 적용, 무게, 도장 / 스탬프 조건은 모든 스탬핑 품질에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 자주 큰 기능 그림의 오른쪽 상단 로고에서 볼 수 있듯이 패턴의 격차 결과에 적용도 약간의 무게. 1A. 반대로, 너무 많은 무게가 플라즈마 처리 단계가 생략하는 경우 두 번째 예를 들어, 특정 단백질 (예 : 항체 등)보다 정확하게 패턴을 features.As 패턴 사이의 지역에서 단백질의 의도 증착 그 결과, 스탬프의 처지와 붕괴의 원인이되며, PDMS는 친수성 ​​떠나. 유리에 fibronectin의 스탬핑이 과정의 기본적인 기법을 보여주는, 그러한 수정 및 최적화를위한 출발점이 여기에 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>플라즈마 세척기</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>데시케이터</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>단백질 표지 키트</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>염색 랙</td><td>시약</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>시약</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>회절 격자</td><td>시약</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 생물학을위한 단백질의 microcontact 인쇄

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

패턴 단백질과 기판에 다른 biomolecules 수있는 능력은 세포외 환경의 공간적 복잡도를 캡처하는 것이 중요합니다. 와이트 그룹에 의해 microcontact 인쇄의 개발 (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/"&gt; http://gmwgroup.harvard.edu/</a&gt;) 1990 년대 중반 마이크로 일렉 트로닉스 / 생명 과학에 초점을 실험실에 액세스할 수 microfabrication 기술을 제작하여이 필드를 revolutionalized. polydimethylsiloxane (PDMS) 우표는 재료 표면에 작용 화학 물질의 패턴을 만드는 데 사용되는이 방법의 초기 구현<sup&gt; 1</sup&gt;. 이후, 혁신적인 접근 방법의 범위는 단백질을 포함한, 패턴 다른 분자로 개발되었습니다<sup&gt; 2</sup&gt;. 이 동영상은 PDMS 스탬프를 만드는 기본적인 과정을 보여주는 이러한 단계를 정확하게 말로 표현하기가 어렵습니다 같은 패턴 단백질로 사용합니다. 우리는 patterning patterning의 구체적인 예를 들어 유리 coverslips에 세포외 기질 단백질 fibronectin에 중점을두고 있습니다. microcontact 인쇄 과정의 중요한 구성 요소는 우표가 캐스팅되는에서 topological 마스터이며 주인의 인상과 인하 지역은 스탬프로 미러링하여 최​​종 패턴을 정의하고 있습니다. 일반적으로, 마스터가 포토 레지스트로 코팅하고 석판술에 의해 패턴 실리콘 웨이퍼로 이루어져, 여기는 다이기 때문입니다. 특정 패턴을 포함하는 주인의 창조는 전문 장비를 필요로하고, 최고의 제조 센터 또는 시설과 상담에 접근합니다. 그러나, 토폴로지와 함께 거의 모든 기판 등 플라스틱 회절 통같이로 마스터, (한 예를 들어 시약 참조)로 사용하고, 같은 serendipitous 주인은 즉시 사용할 수, 간단한 패턴을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 손에 마스터를 둔 지점에서 시작됩니다.

Microcontact 인쇄는 소재 표면에 패턴 단백질 및 다른 분자로 광범위하게 사용됩니다. 우리는 유리에 fibronectin의 패턴을 스탬핑,이 과정의 기본 단계를 보여줍니다.

세포 생물학을위한 단백질의 Microcontact 인쇄

기질 위에 단백질 및 기타 생체 분자를 패턴화하는 능력은 세포 외 환경의 공간적 복잡성을 구현하는 데 중요합니다. ...

마이크로 접촉 인쇄(Micro contact printing)는 세포외 환경의 복잡성을 재현하기 위해 재료 표면에 단백질 및 기타 분자를 패턴화하는 데 사용됩니다. 마이크로 접촉 인쇄를 시작하려면 먼저 토폴로지 마스터(topological master)를 제작하고, 소프트 리소그래피(soft lithography)를 사용하여 해당 마스터로부터 Syl guard로 스탬프를 캐스팅합니다. 이 스탬프에 단백질을 코팅한 다음, 세포가 부착될 수 있는 새로운 표면에 단백질을 찍어낼 때 사용합니다.안녕하세요, 제 이름은 Chen입니다. 저는 컬럼비아 대학교 의공학 전공 Lance Camp 교수님 연구실 소속입니다. 안녕하세요, 저는 기계공학과에서 온 GT입니다.안녕하세요, 컬럼비아 대학교 생체 의공학과(Department of Biomedical Engineering)의 Lance Kem입니다. 저희 연구실에서는 세포가 세포 외 환경의 복잡한 단백질 배열에 어떻게 반응하는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이 방법은 1990년대 중반 George Whitesides 연구실에서 개발되었으며, 현재는 널리 사용되는 가치 있는 도구가 되었습니다.이 기술에는 많은 변형 방법이 있지만, 오늘은 G and Co U가 기본적인 마이크로 컨택 프린팅 과정을 시연하겠습니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 마이크로 컨택 프린팅을 위해 커버슬립과 스탬핑용 단백질 용액은 며칠 전에 미리 준비해야 합니다.먼저, 커버슬립을 림보 용액에 담그고 가열 및 교반하며 10분 동안 유지하여 용액이 투명해질 때까지 처리합니다. 이 과정과 이후의 세척 및 보관 단계는 세라믹 염색 랙에 커버슬립을 장착함으로써 간소화할 수 있습니다. 다음으로, 커버슬립을 탈이온수로 충분히 헹군 후 45 °C에서 6시간 동안 건조합니다.단백질 용액을 준비하려면, 제조사의 지침에 따라 fibronectin을 1 mg/mL 농도의 스톡 용액으로 재구성하십시오. 이 스톡 용액은 -20 °C에서 냉동 보관하며, 작업용 분주액은 4 °C에서 일시 보관합니다.스탬프 제작은 실험 며칠 전에 미리 수행할 수 있습니다. 제작된 스탬프는 조직 배양 접시와 같은 덮개가 있는 용기에 패턴이 위로 향하도록 하여 보관할 수 있습니다. 우선, 압축 여과 공기 또는 불활성 가스를 분사하여 마스터에서 느슨하게 붙어 있는 먼지를 제거하는 것으로 시작합니다.다음으로, 마스터 패턴의 윗면이 위로 향하게 하여 마스터

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이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

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학습하세요 세포 생물학 연구를 위한 마이크로콘택트 프린팅 기법으로 fibronectin 단백질을 유리 표면에 패턴화하는 방법을 배우세요. 이 기술은 세포 부착 환경을 조성하여 세포 외 환경에서 세포 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

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