Name: 사진 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP) Amyloidogenic 펩티드에 적용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 배우세요 사진 유발 가교(PICUP) 방법을 사용하여 아밀로이드생성 펩티드의 올리고머 크기 분포를 분석하는 기법을. 이 방법은 신경퇴행성 질환 연구에 중요한 구조적 특성을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 공중 보건의 캘리포니아학과에서 래리 L. Hillblom 알츠하이머 협회 재단 IIRG - 07-58334, 07-65798에서와 NIH / NIA, 2005/2E에서 보조금 AG027818 및 AG030709 지원했다.

1. 펩타이드 준비 <ol><li> 라벨, 실리콘 코팅, 낮은 흡착제 microfuge 튜브에 microbalance 및 전송을 사용하여 동결 건조된 펩타이드의 ~ 100-200 μg를 달다. 여기, 우리는 Aβ40의 인간 시퀀스, Aβ42, 칼시토닌, 그리고 GRF를 사용합니다. </li><li> 여기, 우리는 단일 펩티드, 집계없는 준비를 얻기 위해 1,1,1,3,3,3 - hexafluoro - 2 - 프로파놀 (HFIP)로 사전 처리를 사용합니다. 사전 구성된 집계가 실험 5 중에서 가난한 재현성의 결과 amyloidogenic 단백질의 신속한 집계를 유발하기 때문에이 단계가 필요합니다. 이러한 여과 및 SEC와 같은 다른 방법도 PICUP 6 총체적없는 준비를 얻는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> HFIP와 펩티드를 치료하기 위해 적절한 보호 (HFIP는 휘발성과 독성)을 입고 연기 후드 안에 얼음 HFIP 컨테이너를 미리 진정해. 250 ML 병의 냉각하면 일반적으로 10-15 분 필요합니다. 0.5 mm의 공칭 펩타이드 농도를 구하는 펩티드 lyophilizates를 포함하는 미리 차게 튜브에 HFIP를 추가합니다. </li><li> 상온에서 5 분 물 목욕 sonicator의 펩타이드 솔루션을 Sonicate. </li><li> 부드럽게 소용돌이와 실온에서 30 분 튜브를 품어. </li><li> 얼음 (1 분)에 튜브를 칠하고, 레이블 0.6 - ML 낮은 흡착제 튜브에서 10-50 - μl aliquots에 솔루션을 나눕니다. </li><li> 질소의 부드러운 흐름에 따라 증발에 의해 HFIP를 제거하거나, 하룻밤 퓸 후드에서 열 튜브를 두십시오. 하룻밤 증발 들어, 랙에 오픈 튜브를 삽입하고 먼지와 미립자 오염을 방지하기 위해 Kimwipes의 큰 시트를 커버. </li><li> lyophilizer에 vacuo에 남아있는 HFIP, 30 분 원심 농축기를 바싹 말리다, 또는 2 H.위한 진공 입구에 부착된 exsiccator에 최종 제품은 microfuge 튜브의 하단에있는 펩타이드 영화 것입니다. 제대로 exsiccated 경우, 튜브가 -20 또는 -80 ° C.에 연장 기간 (개월)에 대한 완벽한 저장할 수 있습니다 </li></ol> 2. HFIP - 대우 펩티드를 Solubilizing과 사진이 교차 연결 <ol><li> 가교 반응, 교차 연결 및 담금질의 시약을 준비 한 요구에 HFIP - 대우 펩티드를 solubilizing 전에. </li><li> 암모늄 persulfate를 달다 (APS, 미스터 228.2 g / 몰)와 10 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4에서 20 MM 솔루션을 준비합니다. 솔루션 분명히 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. </li><li> 10 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4의 트리스 1 MM 솔루션 (2,2 - bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate을 (RuBpy 씨, 748.63 g / 몰) 준비합니다. 소용돌이를 사용하여 혼합하고 완전한 해체를 확인합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛을에서 튜브를 보호합니다. </li><li> 가교 다음과 SDS - PAGE 분석을 위해, 편리한 담금질 시약은 2 5% β - 메르 캅 토 에탄올이다 × SDS - PAGE 샘플 버퍼. 또는, 1 M dithiothreitol (DTT, 씨 154.5 g / 몰) 탈이온수 또는 적절한 버퍼에 사용할 수 있습니다. </li><li> HFIP - 치료 펩타이드 필름은 희석 NaOH 먼저 해산하고 다음 인산 나트륨 버퍼는 ~ 30 μm의 펩타이드의 농도를 얻을에 추가됩니다. 추가 60 MM NaOH는 NaOH와 물을 각각 10 최종 볼륨의 45 %, 구성 이러한 펩타이드 필름이 들어있는 튜브에 탈이온수 다음. 팁 최대 pipetting 아래로 혼합하고, 물 목욕 sonicator 5 분 sonicate를 사용 microfuge 튜브의 내벽에서 펩타이드 필름을 다쳤어요. </li><li> 45% 20 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4, pipetting으로 혼합, 10 분 1만6천g에서 원심 분리기를 추가합니다. 부정적인 컨트롤을위한 담금질 시약과 혼합 uncross 연계 펩티드의 aliquots을 따로 설정합니다. </li><li> 1 s의 카메라 셔터 지연을 조정 높은 조사 시간에 광범위한 급진적인 반응 단백질 저하의 원인이 될 수 있습니다. 카메라 셔터를로드합니다. 조사 시간은 새로운 단백질과 방법을 사용할 때 최적화할 필요가 있습니다. </li><li> 전형적인 PICUP 반응은 20 μl 반응 볼륨에서 수행됩니다. , 얇은 벽으로 둘러싸인, 맑은 0.2 - ML PCR 튜브에 펩타이드 솔루션을 18 μl을 전송합니다. </li><li> 펩타이드 솔루션, 1 μl APS 다음 1 μl RuBpy를 추가하고 (반응 혼합물에 RuBpy와 APS의 최종 농도가 0.05 및 1 ㎜ 각각됩니다) pipetting하여 시약을 섞는다. </li><li> 신속하게 반응 관 1.8 ML의 유리관 안에 넣습니다. 카메라 본체의 전면에 붙어있는 벨로우즈 내부의 병을를 놓습니다. 렌즈 보호를 첨부와 샘플이 벨로우즈 내부 1 S에 대한 조사가되도록 셔터를 누르십시오. </li><li> 샘플 조사 후, 신속하게 유리병 밖으로 풀무와 PCR 튜브의 병을 꺼내. 신속 한 μl DTT, 10 μl 절감 페이지 샘플 버퍼를 추가하여 반응은 끄지. 각 펩타이드 나누어지는에 대한 반응을 반복합니다. </li><li> 반응 혼합물은 이제 노 칠일 이상 또는 SDS - PAGE와 실버 얼룩으로 분석하기 전에 얼음에 보관을위한 스토리지 -20 ° C에 냉동 수 있습니다. </li></ol> 3. SDS - PAGE와 은색 - 염색법교차 연결된 펩타이드 제품 <ol><li> 정기적인 SDS - PAGE와 실버 얼룩이 교차 연결된 펩티드를 시각화하기 위해 수행됩니다. </li><li> 차선 당 펩티드의 ~ 130 pmol를 얻을 레인 당 반응 혼합물의 5 μl를로드합니다. </li><li> 비교 uncross 연계 펩티드 비슷한 금액을 포함합니다. 펩타이드 밴드의 분자량의 시각 근사치에 대한 표준 단백질 사다리도 포함됩니다. </li><li> 표준 겔 전기 영동 장치를 사용하여 겔을 실행합니다. 우리는 Invitrogen에서 XCell SureLock 미니 셀 시스템을 사용하고 Invitrogen 출판 IM - 1002, Novex 사전 캐스트 젤 전기 영동 안내에 따라 실버 얼룩을 수행합니다. </li></ol> 4 부 : 대표 결과 (그림 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="그림 1" /> 그림 1 : uncross 링크된 보여주는 실버 - 스테인드 polyacrylamide의 젤 - (+) GRF, 칼시토닌, Aβ40과 Aβ42과 사진 - 상호 연결된 ()를 SDS - PAGE와 PICUP 생성 Aβ40 oligomers의 실버 얼룩 분석은 높은 oligomers 7 풍부하게 날카로운 감소 다음 tetramer를 통해 모노머 약 유사한 밴드 농도를 보여줍니다. Uncross 링크된 Aβ40는 모노머 7 그것과 일치 미스터와 함께 마이 그 레이션합니다. Aβ42는 뚜렷한 올리고머 크기 분포를 보여줍니다. Aβ42 oligomers 2-3 그룹 8 구성됩니다. 첫 번째 그룹, trimer를 통해 모노머가 증가 올리고머 주문과 함께 강도를 감소 표시됩니다. 두 번째 그룹에서, 가우스 같은 배포 pentamer과 hexamer에서 최대, tetramer 그리고 heptamer 사이에 관찰됩니다. 여기에 표시되지 않습니다 세 번째 그룹은, 씨 ~ 30,000-60,000 다 8 oligomers가 포함되어 있습니다. 이러한 높은 미스터 oligomers는 일반적으로 SEC 절연 LMW Aβ42를 사용하여 관찰 있지만 펩티드는 여과 또는 HFIP 치료 6 준비가되어 있습니다. Uncross 링크된 Aβ42은 주로 두 그룹, 모노머의 밴드와 SDS 5,9에 의해 유도된 인위입니다 광범위한 trimer / tetramer 밴드를 생산하고 있습니다. 칼시토닌 강력 dimers, trimers, 그리고 tetramers 7 미리 존재를 제안, tetramer를 통해 지역 모노머의 단조로운 지수 감소에서 diverges 올리고머 크기 분포를 산출. 제어 polypeptide, GRF은 이합체에서 oligomers의 명백한 상대적 금액이 증가 분자 질량과 함께 기하 급수적으로 감소되는 등 hexamer를 통해 범위 monotonic 올리고머 분포를 생산하고 있습니다. 다른 실험에서, 높은 oligomers 또한 시각 7 수 있습니다. 정확한 번호와 올리고머 밴드의 상대적 농도는 실제 단백질 농도, 젤에 로드된 단백질의 양, 그리고 실버 얼룩 프로토콜의 개발 단계에 사용되는 시간에 따라 실험을 사이에 다소 차이가있을 수 있습니다.

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</ol>

PICUP는 안정적인 단백질 단지 2 공부 원래 개발되었습니다. 방법은 Aβ 10, 프리온 질병 - 관련 PrP SC 11, 및 α - synuclein 12를 포함한 metastable 아밀로이드 단백질 어셈블리의 양적 연구 나중에 적용되었다. PICUP 실험을 디자인할 때 고려되어야하는 가장 중요한 요소는 시약의 stoichiometry, 조사 시간 및 샘플 준비 절차입니다. 후자 문제가 크게 실험 데이터의 해석에 영향을 미치는 반면 전직 두 가지 문제는 경험적 최적화가 필요할 수 있습니다. 특히 amyloidogenic 단백질 들어, metastable oligomers의 크기 배포판의 결정은 집계가없는 시작 준비를 사용합니다. 배경, 메커니즘, 계측, 프로토콜, 최적화, 범위, 수정, 응용 프로그램 및 PICUP의 제한은 이전 출판물 1,2,13로 덮여 있었다. PICUP는 다음과 같은 분류와 정화가, 구조 연구, 세포 독성의 assays, oligomeriz...

<table><tbody><tr><td>Dolan-Jenner 200-W 백열전구</td><td>기타</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>모델 170-D</td><td>램프에서 발생하는 열은&amp;#8211;짧은 배양 시간 동안에는 시료에 영향을 미치지 않습니다.</td></tr><tr><td>35mm SLR 카메라 바디</td><td>도구</td><td>Pentax</td><td>SP500 모델</td><td>본 실험 설정에서는 카메라 본체에 벨로우즈(bellows)를 부착하여, 광원으로부터 10cm 떨어진 곳에 배치된 시료에 조사(irradiation)를 수행할 수 있는 편리한 챔버를 제공합니다.</td></tr><tr><td>투명하고 벽이 얇은 PCR 튜브</td><td>기타</td><td>Eppendorf</td><td>Fisher에서 공급하는 951010006 L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알 (1.8 mL)</td><td>기타</td><td>킴블 체이스</td><td>Fisher 03-340-60에서 공급하는 60940A 2</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>시약</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>헥사플루오로이소프로판올</td><td>시약</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>흄 후드 내에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40 및 A&amp;#946;42</td><td>시약</td><td>UCLA 생체고분자 연구실</td><td></td><td></td></tr><tr><td>칼시토닌</td><td>시약</td><td>American Peptide</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>용액이 투명해질 때까지 볼텍싱하십시오. 주변 빛으로부터 시약을 보호하기 위해 RuBpy 튜브를 알루미늄 호일로 감싸십시오. RuBpy는 매번 새로 조제하며 48시간 이내에 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>과황산암모늄</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>용액이 투명해질 때까지 볼텍싱하십시오. APS는 매번 새로 조제하며, 48시간 이내에 사용해야 합니다. </td></tr><tr><td>&amp;#946;-메르캅토&amp;#8211;에탄올</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>SDS-PAGE 분석을 수행할 때 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS 시료 완충액 (2x)</td><td>시약</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt; 미니셀</td><td>도구</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine 겔 (10-20%)</td><td>기타</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS 전기영동 버퍼 (10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>실버 익스프레스 염색 키트</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

사진 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (picup) amyloidogenic 펩티드에 적용

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

독성 oligomers로 amyloidogenic 단백질의 조립은 알츠하이머, 파킨슨병과 헌팅턴의 질병, 유전 루게릭병, 그리고 2 형 당뇨병을 포함한 단백질 misfolding 질환의 pathogenesis에 있게한 이벤트입니다. 이러한 단백질 어셈블리의 metastable 특성 때문에, 그것은 전기, 크로마 토그래피, 형광, 또는 동적 광 산란과 같은 고전적인 방법을 사용하여 양적 자신의 올리고머의 크기 분포를 평가하기 어렵습니다. amyloidogenic 단백질 Oligomers은 oligomers가 단량체로 교제를 끊다 동시에 큰 어셈블리에 연결할하는 metastable 혼합물로 존재합니다. PICUP 교차하기 전에 존재 올리고머 크기 배포판 공유 결합 가교와 같은 나트륨 dodecyl 황산염의 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS - PAGE) 또는 크기 배제 크로마 토그래피 (SEC)와 같은 분류 방법과 결합하면 PICUP이 제공하는 스냅샷의 올리고머의 인구 안정화 - 연결. 따라서, PICUP는 metastable 단백질 인구의 시각화 및 정량 분석​​을 가능하게하고 시퀀스 수정 및 oligomerization 사이의 조립 및 해독 관계를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다<sup&gt; 1</sup&gt;. Mechanistically, PICUP는 루의 사진 산화를 포함<sup&gt; 2 +</sup&gt; 트리스 (bipyridyl) 루 (II) 복잡한 (RuBpy)에 루에<sup&gt; 3 +</sup&gt; 전자 수용체의 존재에 가시 광선과 방사선에 의해. 루<sup&gt; 3 +</sup&gt; 단백질 급진적인 생성, 이웃 단백질 분자에서 전자를 추출 수있는 강력한 한 전자 산회제입니다<sup&gt; 1,2</sup&gt;. 부수는 불안정, 높은 반응 종이며, 따라서 내부 및 분자간 반응의 다양한 통하여 급속하게 사라집니다. 급진은 이후 수소 원자를 잃고 안정, covalently 링크된 이합체을 형성 dimeric 급진를 형성 다른 단백질 단량체와 반응하는 unpaired 전자의 높은 에너지를 활용할 수 있습니다. 이합체 다음 고차원 oligomers를 형성하는 단량체 또는 다른 dimers와 유사한 메커니즘을 통해 추가로 반응 수 있습니다. 다른 사진이나 화학 가교 방법에 PICUP 상대의 장점<sup&gt; 3,4</sup&gt; 짧은 (≤ 1 S) 비파괴 가시 광선에 대한 노출에 대한 필요가 포함<i&gt; 예약상의</i&gt; 기본 순서의 변경, 그리고 길이가 0 인 가교 공유 결합. 또한, PICUP는 수 간 연결 넓은 산도와 physiologic 매개 변수를 포함하여 온도 범위 내에서 단백질의. 여기, 우리는 세 amyloidogenic 단백질 40의 상호 연결에 PICUP의 응용 프로그램을 보여 - 42 - 잔류 아밀로이드 β 단백질의 변종 (Aβ40과 Aβ42) 및 칼시토닌 및 제어 단백질, 성장 호르몬 방출 인자 (GRF).

사진 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP)의 것은​​ metastable 단백질 혼합물의 올리고머 크기 분포의 특성을 허용합니다. 우리는 세 대표 amyloidogenic 펩티드 40 PICUP의 응용 프로그램을 보여줍니다 - 그리고 아밀로이드 β 단백질 및 칼시토닌의 42 잔여물 형태 및 제어 펩타이드 성장 호르몬 방출 인자.

사진 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP) Amyloidogenic 펩티드에 적용

아밀로이드 형성 단백질이 독성 올리고머로 조립되는 것은 알츠하이머병을 포함한 단백질 미스폴딩 질환의 병인에서 매우 중요한 사건입니다.

아밀로이드 생성 단백질의 가용성 올리고머는 그 세포 독성 특성으로 인해 신경 퇴행성 질환의 병리 생리학적 기저가 되는 것으로 생각됩니다. 이러한 올리고머는 용액 상태에서 지속적으로 형성되고 해리됩니다. 이러한 사실은 이 문제를 해결하기 위한 억제 분자 개발에 필수적인 구조 연구를 어렵게 만듭니다.변형되지 않은 단백질 또는 픽업(pickup)의 광유도 가교 결합이 사용됩니다. 이 방법은 응집이 해제되고 가용화된 아밀로이드 형성 펩타이드를 가교 시약에 노출시킨 후, 1초간의 강한 빛 펄스를 가해 이량체(dimer)와 올리고머(oligomer)를 공유 결합으로 연결하는 과정을 포함합니다. 이후 표준 생화학적 기법을 통해 올리고머의 크기 분포를 분석할 수 있습니다.안녕하세요, 저는 UCLA 신경과 Batan 연구실의 far Rahimi입니다. 저는 Bean 연구실의 Al Mai입니다. 오늘은 변형되지 않은 단백질의 광유도 가교 결합 절차를 보여드리겠습니다.본 실험실에서는 안정화된 아밀로이드 베타 단백질 올리고머를 생성하고 올리고머 분포의 구조적 변형을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이 절차는 원래 안정적인 단백질 복합체 연구를 위해 Fancy와 Coate에 의해 처음 발표되었습니다. 이후 Battan 등이 이 방법을 응용하여 베타-프라민(beta pram)과 알파-시누클레인(alpha sycle)을 포함한 메타 안정성 아밀로이드 단백질 어셈블리의 정량적 연구에 적용하였습니다.그럼 시작하겠습니다. 프로토콜을 시작하기 위해, 얼음 위에서 미리 냉각시킨 HEXA fluoro ISOPROPANOL 또는 HFIP를 1~200 µg의 동결건조 펩타이드가 들어 있는 실리콘 코팅 저흡착 튜브에 첨가합니다. 이때 최종 농도는 약 0.5가 되도록 합니다.밀리몰 농도의 HFIP는 아밀로이드 생성 펩타이드의 응집을 방지하여 결과의 일관성을 향상시킵니다. 이제 실온에서 펩타이드 튜브를 5분 동안 초음파 처리하십시오.초음파 처리가 완료되면, 튜브를 가볍게 볼텍싱하고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 펩타이드를 얼음 위에서 1분 동안 냉각합니다. 냉각된 펩타이드를 10~50 µL씩 분주하여 0.6 mil 저흡착 튜브에 나누어 담습니다.다음으로 캡을 열어 튜브들을 후드 안에 배치합니다. HFIP가 밤새 증발할 수 있도록, 튜브 랙을 킴와이프로 감싸 튜브 안에 먼지가 들어가는 것을 방지합니다. HFIP의 대부분이 증발하면, 튜브들을 진공 엑시카이터(exsiccator)에 넣고 2시간 동안 진공 상태로 두어 잔류 HFIP를 완전히 제거해야 합니다.최종 생성물은 튜브 내부에 형성된 얇은 펩타이드 필름 층입니다. 이 튜브들은 -20°C 또는 -80°C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 가용화 및 광가교 단계를 시작하려면, 먼저 묽은 수산화나트륨 용액에 펩타이드 필름을 용해시킵니다.수산화나트륨을 첨가한 후, 탈이온수와 인산 완충액을 순차적으로 추가하여 최종 용액의 조성이 인산 완충액 45%, 물 45%, 수산화나트륨 용액 10%가 되도록 합니다. 튜브 벽면에 단백질 막이 남아 있는 경우, 이를 긁어 용액에 넣습니다. 피펫 팁을 사용하여 부유된 펩타이드를 피펫팅한 후, Water Bath Sonica를 이용하여 1~2분 동안 초음파 처리합니다.초음파 처리 후, 인산 용액을 첨가하고 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 16,000 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 진행되는 동안, 광교차결합 단계를 위한 카메라를 준비하십시오.카메라 셔터 지연 시간은 1초로 설정하고 셔터를 장전해야 합니다. 튜브의 원심분리가 완료되면 투명한 0.2 mL PCR 튜브에 펩타이드 용액을 18 µL씩 분주하십시오. 이 분주액들은 광교차결합(photo crosslinking)에 사용됩니다.가교결합 직전에 음성 대조군으로 사용할 펩타이드 용액을 일부 따로 떼어 두십시오. ammonium per sulfate 1 µL와 ruthenium 1 µL를 추가합니다. 이제 튜브를 빠르게 1.8 M 유리 바이알 안에 넣고, 바이알을 카메라 본체 전면에 부착된 벨로우즈 안에 배치하십시오.렌즈 보호기로 카메라를 닫고 셔터를 누릅니다. 이제 시료가 1초 동안 조사됩니다. 조사 시간이 길어지면 광범위한 라디칼 반응으로 인해 단백질 분해가 발생합니다.조사를 마친 후, 0.2 mil PCR 튜브를 빠르게 회수하고 Beta mercapto ethanol이 포함된 미리 준비된 페이지 샘플 버퍼 10 µL를 첨가합니다. 가교된 펩타이드는 -20 °C에서 최대 7일까지 보관할 수 있습니다. SDS page, 분획 및 은 염색을 수행하기 전 단계입니다.가교 결합된 펩타이드를 조사하기 위해 일반적인 SDS page 및 은 염색(silver staining)을 사용할 수 있으며, 로딩할 부피를 추정할 때 반응 혼합물 5 µL는 대략 130 pmol의 펩타이드를 생성해야 합니다. 겔 전기영동 및 은 염색을 수행하기 위해 Invitrogen의 Xcel Sherlock mini cell 시스템을 사용할 것을 권장합니다. Invitrogen 출판물 IM 1 0 0 2, no NOx precast gel electrophoresis guide에 따라 SDS page 겔을 은 염색 후 분석하면, 가교 결합되지 않은 대조군 폴리펩타이드인 GRF는 주로 단량체(monomer)로 나타납니다.가교결합된 GRF는 이량체부터 육량체까지 연속적인 올리고머 분포를 생성하며, 이에 따라 올리고머의 겉보기 상대적 밴드 강도는 분자량이 증가함에 따라 기하급수적으로 감소합니다. 가교결합되지 않은 칼시토닌은 주로 단량체로 나타나며 일부는 이량체로 나타납니다. 가교결합된 칼시토닌은 해당 영역에서 단조로운 기하급수적 감소와는 크게 다른 올리고머 크기 분포를 보입니다.가교되지 않은 이량체, 삼량체 및 사량체가 기존에 존재함을 시사하는 단량체부터 사량체까지의 양상이 나타납니다. Beta 40은 단량체로만 나타나며, Beta 40이 생성되었습니다. 모든 리간드는 단량체부터 사량체까지 거의 유사한 밴드 강도를 보이며, 이후 고차 리간드의 풍부도가 감소합니다.가교 결합되지 않은 beta 42는 주로 단량체 밴드와 삼량체-사량체 밴드라는 두 개의 밴드를 생성합니다. 삼량체-사량체 밴드는 SDS 가교 결합으로 인해 발생하는 아티팩트입니다.Beta 42는 두 개의 그룹으로 구성된 뚜렷한 올리고머 크기 분포를 보여줍니다. 첫 번째 그룹인 단량체부터 삼량체까지는 올리고머 차수가 증가함에 따라 강도가 감소하는 양상을 보입니다. 두 번째 그룹에서는 사량체와 칠량체 사이에서 가우시안 형태의 분포가 관찰되며, 오량체와 육량체에서 최대치를 나타냅니다.지금까지 PICUP을 이용해 단백질을 가교 결합하는 방법을 보여드렸습니다. 아밀로이드 생성 단백질을 사용할 때는 재현성 있는 결과를 얻기 위해 준비물이 응집되지 않았는지 확인하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 여기에 제시된 조건과 실험들은 관심 있는 용해물에 따라 실험적으로 수정될 수 있습니다. 이상입니다.시청해 주셔서 감사드리며, 픽업 실험을 성공적으로 수행하시길 바랍니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

Aptamers는가 선택한 짧은 ribo-/deoxyribo-oligonucleotides...

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아 밀 로이드 증 착 다른 질병의 특징은 고 고생 많은 다른 기관. 이 문서에서는 발광 활용된 oligothiophene 형광 형광 현미경 검사 법 기술 함께에서 얼룩의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이 얼룩 메서드 검색 및 임상과 과학적인 설정에 단백질의 탐사를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.

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손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

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1, 2-dithiolane의 합성에 대 한 프로토콜 펩 티 드와 펩 티 드에서 자기 조립 결과 supramolecular 구조의 특성 수정.

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